一种基于DNA条形码的白蚁快速分类鉴定方法与流程

本发明属于白蚁分子生物学领域，具体涉及一种基于DNA条形码的白蚁快速分类鉴定方法。

背景技术：

白蚁，亦称虫尉，属节肢动物门，昆虫纲，等翅目，类似蚂蚁营社会性生活，其社会阶级为蚁后、蚁王、兵蚁和工蚁。

白蚁的主要食物是木纤维。在日常生活中，木材和木材制品是我们不可缺少的物品。包括用木料制成的纸张、衣服等，白蚁都较喜欢蛀蚀。所以一些收藏的报纸、书刊，甚至一些文物，都经常受白蚁的蛀蚀。除此之外还有塑料、橡胶等制品也受白蚁的蛀蚀，如一些通讯或供电的地下电缆、一些电器等都受到白蚁的侵蚀。所以白蚁不但对家具、房屋造成侵害，对很多部门如电讯、文物、工厂、部队国防等部门都造成一定的影响。特别对农业、林业、水利等部门影响更大，交通运输部门有些轮船、火车、汽车等也有白蚁的危害，所以在日常生活中，白蚁的危害是普遍存在的。

一、对农作物的危害：一般来说，白蚁对我国农作物还不是重要的害虫。但是对经济作物甘蔗来说危害还是较为严重的。其种类主要有：台湾家白蚁，黄翅大白蚁，黑翅土白蚁，海南土白蚁，近歪白蚁。

二、对树木的危害：危害树木的白蚁种类很多，其主要种类有：新白蚁，堆砂白蚁，家白蚁，树白蚁，散白蚁，木鼻白蚁，土白蚁和大白蚁，原白蚁等。

三、对房屋建筑的破坏：白蚁对房屋建筑的破坏，特别是对砖木结构、木结构建筑的破坏尤为严重。由于其隐藏在木结构内部，破坏或损坏其承重点，往往造成房屋突然倒塌，引起人们的极大关注。在我国，危害建筑的白蚁种类主要有：家白蚁，散白蚁种堆白蚁等属。其中，家白蚁属的种类是破坏建筑物最严重的白蚁种类。它的特点是扩散力强，群体大，破坏迅速，在短期内即能造成巨大损失。

四、对江河堤坝的危害：白蚁危害江河堤防的严重性，我国古代文献上已有较为详细的记载，近代的记载更为详尽。其种类有土白蚁属大白蚁属和家白蚁属种类的白蚁群体，它们在堤坝内，密集营巢，迅速繁殖，苗圃星罗棋布(除家白蚁外)蚁道四通八达，有些蚁道甚至穿通堤坝的内外坡，当汛期水位升高时，常常出现管漏险情，更烈者则酿成塌堤垮坝。

为了更好的防治白蚁，需要对白蚁的种类进行鉴别，形态学方法是目前白蚁分类的主要方法，主要依靠兵蚁或有翅成虫个体的形态特征和量度值对白蚁进行分类。由于白蚁具有多态性，正确的白蚁形态分类鉴定需要白蚁的各个品级，但是在白蚁标本采集中很难采全白蚁各个品级。其次，同种白蚁个体间在个体形态上亦存在较大的差异。再次，不同地域的种间白蚁个体在形态特征上表现出了趋同现象。最后，白蚁的外部形态特征极为相似，体壁柔软，骨化程度低，白蚁无论雌雄有翅成虫，生殖器均为几块简单骨片，分类鉴定无法采用生殖器特征。这些都给白蚁形态分类带来了较大的困难。

技术实现要素：

基于此，针对上述问题，本发明提出一种基于DNA条形码的白蚁快速分类鉴定方法。

本发明的技术方案是：一种基于DNA条形码的白蚁快速分类鉴定方法，包括以下步骤：

A、选取在形态分类上鉴定准确且与模式标本核对过的白蚁样本为模板，提取样本DNA，选择线粒体COI为特征片段，进行PCR扩增和Sanger测序，获得相应序列，从而建立白蚁样本DNA条形码数据库；

B、采集待测白蚁样本，提取样本DNA，选择线粒体COI为特征片段进行PCR扩增和Sanger测序，获得待测白蚁特征片段序列；

C、将步骤B获得的待测白蚁特征片段序列与步骤A建立的DNA条形码数据库进行比对，判断白蚁种类。

优选地，所述步骤A和B中，提取样本DNA采用试剂盒法进行抽提。

优选地，所述采用试剂盒法进行抽提具体包括如下过程：

(1)取待试验的白蚁样本，剔除腹部，留下头部和胸部，用蒸馏水漂洗干净，然后置于2mL的Eppendorf管中；

(2)向Eppendorf管中加入200μL缓冲液GA；

(3)向Eppendorf管中加入20μL蛋白酶K溶液，充分颠倒混匀，置于56℃水浴锅2-3小时，期间间歇性振荡，直至组织完全溶解；

(4)向Eppendorf管中加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，待溶液变清亮，离心去除管盖内壁的水珠；

(5)向Eppendorf管中加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，离心去除管盖内壁的水珠；

(6)将步骤(5)所得溶液加入吸附柱中，11000-13000转/分钟离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；

(7)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，11000-13000转/分钟离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；

(8)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，11000-13000转/分钟离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；

(9)重复操作步骤(7)；

(10)将吸附柱放回收集管中，11000-13000转/分钟离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温放置2-9分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

(11)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，11000-13000转/分钟离心2分钟，将溶液收集到离心管中，于零下20℃保存备用。

优选地，所述步骤A和B中，线粒体COI特征片段的扩增通用引物序列为：

COI-F:CTTCGTATTTGGTGCATGAT；

COI-R:CWGGGTCRAAGAATGATGTA。

优选地，步骤A和B中，所述的PCR扩增的反应条件为：98℃预变性2min，循环反应35次；每一循环包含98℃10s，56℃10s，72℃30s，72℃延伸3min，4℃保存。

优选地，采集的白蚁样本用质量分数为75％的酒精浸泡于5ml离心管中。

本发明的有益效果是：

本发明通过对已知白蚁种类DNA条形码数据库的建设，通过将未知白蚁种类的COI基因DNA条形码与之比对，就可实现白蚁种类的快速鉴定；DNA条形码技术简单、快速、稳定性高，可大大提升白蚁分类鉴定效率，对推动整个白蚁行业白蚁标本鉴定技术的发展都有向前的推动作用。

附图说明

图1是本发明流程图；

图2是用于建立DNA条形码数据库的白蚁COI基因PCR扩增电泳效果图；

图3是基于COI基因构建的NJ树。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。

如图1所示，一种基于DNA条形码的白蚁快速分类鉴定方法，包括以下步骤：

A、采集可以准确分类鉴定的白蚁样本，提取样本DNA，选择线粒体COI为特征片段，进行PCR扩增和Sanger测序，获得相应序列，从而建立白蚁样本DNA条形码数据库；

B、采集待测白蚁样本，提取样本DNA，选择线粒体COI为特征片段进行PCR扩增和Sanger测序，获得待测白蚁特征片段序列；

C、将步骤B获得的待测白蚁特征片段序列与步骤A建立的DNA条形码数据库进行比对，判断白蚁种类。其中，采集的白蚁样本用质量分数为75％的酒精浸泡于5ml离心管中。

具体地，所述步骤A和B中，提取样本DNA采用试剂盒法进行抽提。

其中，采用试剂盒法进行抽提具体包括如下过程：

DNA提取步骤如下：

(1)取待试验的白蚁样本，剔除腹部，留下头部和胸部，用蒸馏水漂洗干净，然后置于2mL Eppendorf管中。注意：夹取白蚁的镊子每次在夹取白蚁前，需用高温灭菌；

(2)加入200μL缓冲液GA；

(3)加入20μL Proteinase K溶液，充分颠倒混匀，置于56℃水浴锅2-3小时，期间间歇性振荡；

(4)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

(5)加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

(6)将上一步所得溶液和可能的絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(-13400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

(7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(-13400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm(-13400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(9)重复操作步骤(7)；

(10)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(-13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm(-13400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中，于零下20℃保存备用。

DNA条形码引物设计需要能够找到适用于同一类群大多数物种的引物序列，本发明根据NCBI数据库中已经报道的白蚁不同种类的COI序列，通过在保守区域设计通用引物，并针对不同种类样本进行扩增测序验证，最终获得了能够适用于绝大部分样本的引物。

具体地，所述步骤A和B中，线粒体COI特征片段的扩增通用引物序列为：

COI-F:CTTCGTATTTGGTGCATGAT；

COI-R:CWGGGTCRAAGAATGATGTA。

本发明中，PCR反应体系：在200μL离心管中进行，反应总体积为25μL，反应体系包括：髙保真PCR反应预混液I5Mix 12.5μL，COI-F 1μL，COI-R 1μL，DNA 1.5μL，ddH₂O 9μL。

具体地，步骤A和B中，所述的PCR扩增的反应条件为：98℃预变性2min，循环反应35次；每一循环包含98℃10s，56℃10s，72℃30s，72℃延伸3min，4℃保存。

PCR扩增后，进行制胶及PCR产物检测。

(1)按照样品：6X Loading buffer＝5:1加入5μL 6X Loading buffer，离心至4000rpm混匀。

(2)将样品点入事先准备好的1.2％纯化胶中。电泳仪电压设定160V，45min。

(3)将胶块放入凝胶成像仪器中采集图像。

(4)将有明显条带的PCR产物采用3730XL测序仪进行测序。

测序后进行DNA序列数据处理及分子系统树构建。

用CodonCodeAligner对所得序列峰图进行校对拼接，去除引物区和低质量的序列，将处理后的序列在GenBank中Blast搜索同源序列，与相似物种进行比较。然后，运用MEGA6.0软件对拼接后的序列及同源序列进行统一编辑、比对分析，计算保守位点(conserved sites)、变异位点(variable site)、简约信息位点数(parsimony information sites)、单突变位点(singleton sites)、碱基组(base composition)和平均碱基含量(average base composition)。采用MEGA6.0软件，基于邻接(NJ,Neighbor-Joining)进行发育树的构建，对系统发育树各进化枝进行Bootstrap 1000次的置信度检验。

实验结果与分析：

一、研究材料。

用于建立DNA条形码数据库的白蚁样本可采自但不限于成都市，包括锦江区、青羊区、金牛区、成华区、武侯区、温江区、新都区、龙泉驿区、青白江区、高新区、郫都区、双流区、天府新区、新津县、金堂县、大邑县、蒲江县、崃市、崇州市、彭州市和都江堰市；白蚁标本采集的年限为2009年至2017年，采集后用75％酒精浸泡于5ml离心管中，在常温条件下保存于标本室。

二、所使用的仪器设备。

Applied Biosystems生产的3730XL测序仪、Thermo生产的Legend Micro17离心机、AppliedBiosystems生产的2720thermal cyclerPCR仪、君意东方生产的JY300C电泳仪、君意东方生产的JYDF(定制)电泳槽、君意东方生产的JY04S-3C凝胶成像仪、北京中兴伟业生产的DFD-700水浴锅、cence湘仪生产的L550板式离心机、超低温冰箱。

三、材料与试剂。

一次性组织研磨棒、DNA提取试剂盒、Agarose琼脂糖、Takara DL2000DNA Marker、溴化乙锭(EB)、TaKaRa Ex-附加反应缓冲液、dNTP混合液、上下游引物、PCR聚合酶、Tris、乙二胺四乙酸(EDTA)、硼酸、TBE缓冲液、0.2ml/0.6ml/1.5ml/2.0mlEP管、1000uL/200uL/10uL枪头、一次性塑料手套。

四、按照上述方法实验，实验结果如下：

(1)PCR扩增实验结果。

将白蚁COI基因PCR产物进行1.2％的琼脂糖凝胶电泳，以北京擎科新业有限公司DL2000Marker作为分子量标准，条带大小分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp和2000bp。由图2可知，PCR扩增产物条带清晰、整齐，基本无杂带，COI基因扩增产物分子量大小在750bp左右，所研究的白蚁COI基因扩增结果均很好，将扩增结果进行双向测序，且测序成功。

(2)基因序列分析。

用CodonCodeAligner对所得序列峰图进行校对拼接，去除引物区和低质量的序列，获得长度为576bp的序列。对测序结果进行初步分析判断发现，500个成都地区常见白蚁同一种类中，测序结果大多数都保持一致，为了便于后续分析选择其中46个测序结果进行分析，具体见表1。运用MEGA 6.0软件进行多序列比对分析，进行分析的序列中共有保守位点433个，变异位点143个，简约信息位点141个，单突变位点2个。A、C、T和G的平均含量分别为32.1％、24.7％、26.0％和17.2％，G+C含量为41.9％，A+T含量为58.1％，A+T含量高于G+C含量。

表1本实施例分析中涉及的白蚁种类

(3)基因系统发育分析。

用MEGA 6.0软件基于Kimura 2-parameter model模型，利用邻接法(NJ)构建系统发育树。系统发育树显示如图3，所有种类主要分成三个大枝，且置信度均较高。其中，成都杆白蚁和台湾乳白蚁分别单独聚为一支。大别山散白蚁、细颚散白蚁、尖唇散白蚁和狭胸散白蚁聚为一小枝；锥颚散白蚁、黑翅散白蚁、黄胸散白蚁、圆唇散白蚁、新中华散白蚁、似暗散白蚁和黑胸散白蚁聚为一小枝；江城散白蚁、小头散白蚁、卵唇散白蚁和舌唇散白蚁聚为一小枝；长颏散白蚁聚为一小枝；陇南树白蚁、双斑树白蚁、花胸散白蚁、贵州散白蚁聚为一小枝，然后聚在一大枝。

(4)基于COI设计的DNA条形码。

线粒体DNA序列对于研究昆虫的系统演化、种群遗传变异及分化非常有效，可以区分不同种类之间的关系，甚至推测出新种和种间的隐含种。线粒体COI基因被广泛用于白蚁的研究中。理想的DNA条形码通常需要满足以下3个标准：①在物种水平具有显著的遗传变异和分化，能够鉴别不同物种；②合适的长度，便于DNA扩增、测序、拼接及排序时不需要手动调整；③目的片段两端具有保守位点，可用于通用引物设计。

根据成都地区常见白蚁COI基因的进化树来看，可将成都杆白蚁和台湾乳白蚁区分开。大别山散白蚁、细颚散白蚁、尖唇散白蚁和狭胸散白蚁聚为一小枝，说明这四种散白蚁在亲缘关系上比较接近。锥颚散白蚁、黑翅散白蚁、黄胸散白蚁、圆唇散白蚁、新中华散白蚁、似暗散白蚁和黑胸散白蚁聚为一小枝，特别是黄胸散白蚁和圆唇散白蚁，它们在形态上非常相似难以区分，分子水平上说明它们亲缘关系也比较接近；江城散白蚁、小头散白蚁、卵唇散白蚁和舌唇散白蚁聚为一小枝；陇南树白蚁、双斑树白蚁、花胸散白蚁、贵州散白蚁聚为一小枝，说明树白蚁与花胸散白蚁和贵州散白蚁在亲缘关系上比较接近。

整体上来看，COI基因条形码基本上可以将成都地区常见的白蚁种类鉴定到种的水平上，可进行成都地区常见白蚁DNA条形码数据库的建设。

以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。