氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物的应用及聚合酶链式反应的方法与流程

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物的应用及聚合酶链式反应的方法。

背景技术：

自从聚合酶链式反应(PCR)问世以来，人们就不断尝试着通过添加外来物质对它进行优化改良。传统添加剂改进PCR的空间越来越小，表现出难以克服的局限性。因此，人们试图转变观念，从新兴材料中寻求突破，寻找替代品。2012年，Sun课题组首次研究并报道了石墨烯能增强PCR的特异性：以pET-32a质粒为模板，比较了氧化石墨烯和还原石墨烯对PCR的影响，发现在一定浓度范围内，均能增强PCR特异性，并表现出明显的浓度依赖性和模板依赖性。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物的应用及聚合酶链式反应的方法。

本发明提供了一种氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物在聚合酶链式反应中的应用。

本发明还提供了一种氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物作为聚合酶链式反应特异性增强剂的应用。

优选的，所述聚合酶链式反应的体系中氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物的浓度为0.8～8.0μg/ml。

本发明还提供了一种聚合酶链式反应的方法，包括：

S1)将聚合酶链式反应体系依次进行热变性、退火与延伸，完成DNA的半保留复制；所述聚合酶链式反应体系中包括氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物；

S2)反复重复热变性、退火与延伸的步骤，完成聚合酶链式反应。

优选的，所述氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物按照以下步骤制备：

S)在引发剂存在的条件下，将氧化石墨烯与丙烯酰胺单体混合反应，得到氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物。

优选的，所述步骤S)具体为：

将氧化石墨烯与丙烯酰胺单体混合，除去混合体系中的氧气后，加入引发剂，加热反应后，得到氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物。

优选的，所述氧化石墨烯与丙烯酰胺单体的质量比为(0.01～0.1)：1。

优选的，所述氧化石墨烯以氧化石墨烯溶液的形式与丙烯酰胺单体混合；所述氧化石墨烯溶液的浓度为0.5～5mg/ml。

优选的，所述加热反应后，加水稀释反应体系，超声后透析，离心，得到氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物。

优选的，所述氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物中聚丙烯酰胺的接枝率为10％～40％。

本发明提供了一种氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物在聚合酶链式反应中的应用。与现有技术相比，本发明在聚合酶链式反应中添加氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物，在低浓度的氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物的条件下，PCR各组分能够被吸附在氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物表面，使反应在其表面上进行，特异性明显增强，不会有其他扩增产物产生。

附图说明

图1为本发明提供的氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物的制备流程示意图；

图2为聚合酶链式反应的流程示意图；

图3为本发明实施例中PCR产物的电泳图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物在聚合酶链式反应中的应用。

聚丙稀酰胺(PAM)表面带有大量的氨基(-NH₂)，在溶液中极易发生电离碱性，改变PCR扩增的环境，影响PCR扩增中聚合酶的活性，破坏了PCR最适宜的扩增体系，从而影响PCR中延伸阶段的扩增效率，抑制PCR的扩增。

另外，氨基本身是一种带正电荷的官能团，而GO表面含有大量带负电荷的羧基(-COOH)，当把PAM接枝到GO表面，GO的电负性会明显增大，并且随着接枝量增大，电负性也相应增加，因此能够把带正电的材料吸附到GO片上进行PCR扩增，也会增强对带负电荷的材料的排斥作用，并且随着PAM的接枝量增加，静电排斥作用增强。

根据文献报道，Pfu聚合酶是一种带负电荷的DNA聚合酶，Pfu聚合酶能够吸附在纳米材料表面，除了静电作用，还有物理吸附，因此Pfu聚合酶吸附在GO片上的量是一个动态平衡的过程，在低浓度的氧化石墨烯聚丙烯酰胺(GO-PAM)条件下，物理吸附力大于静电排斥的作用力，Pfu聚合酶能够被吸附在GO-PAM表面，PCR扩增能够GO-PAM片上进行，特异性明显增强，不会有其他扩增产物产生；当GO-PAM浓度增大，静电排斥力越强，越少的Pfu聚合酶能够被吸附在GO-PAM表面，在延伸阶段无法大量识别引物；同时，单位面积的GO片上的PCR各组分相对减少，PCR扩增效率受到影响，当浓度过大时，甚至无法完整的进行一轮PCR扩增，从而影响PCR扩增产率从而影响PCR中延伸阶段的扩增效率，抑制PCR的扩增。

本发明还提供了一种氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物作为聚合酶链式反应特异性增强剂的应用。

其中，所述氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物中聚丙烯酰胺的接枝率优选为10％～40％，更优选为20％～30％，再优选为22％～28％，再优选为24％～26％，最优选为24.6％；所述聚合酶链式反应的体系中氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物的浓度优选为0.8～8.0μg/ml；在本发明提供的一些实施例中，所述聚合酶链式反应的体系中氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物的浓度优选为0.8μg/ml；在本发明提供的一些实施例中，所述聚合酶链式反应的体系中氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物的浓度优选为1.6μg/ml；在本发明提供的一些实施例中，所述聚合酶链式反应的体系中氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物的浓度优选为3.2μg/ml；在本发明提供的一些实施例中，所述聚合酶链式反应的体系中氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物的浓度优选为4.8μg/ml；在本发明提供的一些实施例中，所述聚合酶链式反应的体系中氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物的浓度优选为6.4μg/ml；在本发明提供的另一些实施例中，所述聚合酶链式反应的体系中氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物的浓度优选为8.0μg/ml。

本发明在聚合酶链式反应中添加氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物，在低浓度的氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物的条件下，PCR各组分能够被吸附在氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物表面，使反应在其表面上进行，特异性明显增强，不会有其他扩增产物产生。

本发明还提供了一种聚合酶链式反应的方法，包括：S1)将聚合酶链式反应体系依次进行热变性、退火与延伸，完成DNA的半保留复制；所述聚合酶链式反应体系中包括氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物；S2)反复重复热变性、退火与延伸的步骤，完成聚合酶链式反应。

其中，本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。

所述氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物同上所述，在此不再赘述，在本发明中，其优选按照以下步骤制备：S)在引发剂存在的条件下，将氧化石墨烯与丙烯酰胺单体混合反应，得到氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物。

所述氧化石墨烯为本领域技术人员熟知的氧化石墨烯即可，并无特殊的限制，本发明中优选为改进的Hummers法制备的氧化石墨烯，更优选按照以下步骤进行制备：

A)将石墨、硝酸钠与浓硫酸在冰浴条件下混合，缓慢加入KMnO₄并在冰浴条件下反应，然后加热至30℃～40℃进行反应；再缓慢添加去离子水并升温至90℃～100℃继续反应，最后加入水终止反应，并用双氧水中和未反应的KMnO₄，过滤后得到氧化石墨。

B)将所述氧化石墨用稀盐酸与水清洗，除去残留的金属离子和盐酸，并将固体分散在水中得到氧化石墨溶液。

C)将所述氧化石墨溶液超声剥离，离心后，将上清液在纯水中透析，除去残留的盐，得到氧化石墨烯水溶液。

所述氧化石墨烯水溶液的浓度优选为0.5～5mg/ml，更优选为1～4mg/ml，再优选为1～3mg/ml；所述引发剂为本领域技术人员熟知的聚合引发剂即可，并无特殊的限制，本发明中优选为过氧化物引发剂，更优选为过硫酸铵。

在引发剂存在的条件下，将氧化石墨烯与丙烯酰胺单体混合反应；在本发明中优选按照：将氧化石墨烯与丙烯酰胺单体混合，除去混合体系中的氧气后，加入引发剂，加热反应。所述氧化石墨烯与丙烯酰胺单体的质量比优选为(0.01～0.1)：1，更优选为(0.03～0.08)：1，再优选为(0.05～0.08)：1；所述除去混合体系中的氧气的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制，本发明中优选通入保护气体，更优选通入氮气；所述通入保护气体的时间优选为20～40min，更优选为25～35min，再优选为30min；除氧之后，加入引发剂；所述引发剂与丙烯酰胺单体的质量比优选为(0.03～0.2)：1，更优选为(0.05～0.15)：1，再优选为(0.08～0.1)：1；所述加热反应的温度优选为60℃～80℃，更优选为65℃～70℃；所述加热反应的时间优选为1～6h，更优选为2～4h，再优选为3h。

加热反应后，优选冷却至室温，加入水稀释反应体系，超声后透析，离心，得到氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物；所述稀释用的水与反应体系的体积比优选为(1～10)：1，更优选为(2～8)：1，再优选为(4～6)：1；所述超声的时间优选为0.5～2h，更优选为1～1.5h。

图1为氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物的制备流程示意图。

将包含氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物的聚合酶链式反应体系依次进行热变性、退火与延伸，完成DNA的半保留复制。

所述热变性的温度为本领域技术人员熟知的热变性温度即可，并无特殊的限制，本发明中优选为93℃～96℃；所述热变性的时间优选为20～40s，更优选为25～35s；模板DNA在高温下经过一定时间会发生双螺旋结构的氢键断裂而变形，形成单链，同时引物的局部双链也会消除，为下一步退火做准备。

所述退火的温度优选为40℃～65℃；当温度降低至引物的半解链温度时，上一步中变性模板的相应区域与引物通过碱基互补配对结合，形成局部双链。

最后是延伸：在体系温度升温至70℃左右时，上一步形成的局部双链会被Pfu聚合酶识别，以四种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)为原料，按照碱基互补配对原则，从5′到3′方向合成一条新链，完成DNA的半保留复制。

反复重复热变性、退火与延伸的步骤，完成聚合酶链式反应。热变性、退火与延伸三个步骤的反应进行，便能使得目标DNA产物呈指数级增长，短短2～3h即可完成30～40次热循环，产物量能达到起始模板量的230倍以上。

图2为聚合酶链式反应的流程示意图。

本发明提供的聚合酶链式反应中，氧化石墨烯聚丙烯酰胺对PCR的扩增产率有抑制作用，浓度越高抑制效果越强，低浓度的氧化石墨烯聚丙烯酰胺对PCR的特异性有增强作用。

本发明对GO原位聚合带正电荷的丙烯酰胺得到氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物，同时以质粒Pet-32a和人类基因组为模板进行多轮PCR，在PCR体系内加入氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物，以探究表面电荷对PCR的影响以及氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物对PCR特异性的增强作用。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物的应用及聚合酶链式反应的方法进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售。

实施例

准确称取2g天然石墨粉和1g硝酸钠加入圆底烧瓶，在冰浴条件下与46mL预冷的浓硫酸混合均匀；再将6g高锰酸钾逐次缓慢地加入到上述混合液中，在冰浴中搅拌反应2h，然后将混合液转移至35±5℃的油浴中继续反应30min，此时反应体系为棕褐色粘稠状液体；继而向混合液中逐次缓慢地加入92mL去离子水，并将温度升至95±5℃继续反应3h，混合液由棕褐色变成亮黄色，最后加入400mL纯水终止反应，同时加入6mL质量分数为30％的H₂O₂溶液中和未反应的高锰酸钾。待上述溶液冷却至室温后进行抽滤，依次用100mL稀盐酸(1：10)和大量纯水反复洗涤滤饼，除去残留的金属离子和盐酸。再将滤饼重新分散在纯水中得氧化石墨溶液。将上述溶液在500W功率下超声3h，4000rpm低速离心10min除去未剥离的氧化石墨，上清液在纯水中透析一周，除去残留的盐，最后得到分散均匀的氧化石墨烯水溶液(GO溶液)。

将50mL 1.0mg/mL氧化石墨烯水溶液与1g丙烯酰胺单体混合，通氮气30min以除去溶液中的残留的氧，继而加入80mg过硫酸铵，同时加热到70℃反应3h,反应结束后冷却到室温，加入200mL水进行稀释，超声1h，透析一周，除去未接上石墨烯的聚丙烯酰胺，离心收集固体，即得氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物。

以质粒Pet-32a为模板进行多轮PCR，在PCR体系内加入接枝率12.5％的氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物，并对得到的产物进行电泳，得到电泳图如图3所示，其中M为蛋白marker，泳道1～7中加入氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物的浓度依次为0，0.8，1.6，3.2，4.8，6.4，8.0μg/mL。由图3可以看出，1号对应的是不加氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物进行的PCR扩增，得到的条带除了主条带，还有亮度较弱的副条带，对应的就是PCR副产物，可以看出PCR一轮扩增结束后，会有少量的副产物生成，随着氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物浓度的递增，副条带消失，副产物减少，特异性增强。随着氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物浓度递增，条带的亮度逐渐减弱，反映出PCR产量逐渐减少，可以得出随着氧化石墨烯聚丙烯酰胺复合物浓度递增，对PCR的抑制效果增强。