用于检测肉制品中猪肉成分的RPA引物、探针及方法与流程

本发明涉及用于检测肉制品中猪肉成分的RPA引物及方法，特别是肉食加工为主的食品。本方法尤其适用于鉴定清真食品认证的加工食品中是否存在猪肉(Sus scrofa)成分。

背景技术：

食品掺假，尤其是肉类掺假已经成为一个国际性问题，中国也很早就有“挂羊头卖狗肉”的说法。肉类掺假不仅是一个经济问题，还可能损害消费者健康甚至带来一系列宗教问题。因此，建立快速高效的检测技术是打击肉品掺假犯罪和市场监督执法的共同需求。

肉类食品营养价值高，是人们日常食物消费的重要组成部分，由于价格昂贵，成为食品掺假的重要对象。以廉价肉品代替或混入价格较高的肉品中进行的肉类掺假，尤其以猪肉替代牛、羊肉的现象时有发生。随着现代食品工业的快速发展和食品种类的多样化，掺假对象也从原来的冷鲜肉和简单加工肉品渗入到多个种类的产品，尤其是现代深加工肉品，掺假手段更加隐蔽，难以通过食品的外观判断其成分。为了打击这些食品掺假犯罪，维护消费者权益，监管部门和研究人员对掺假鉴定技术也在不断发展和完善。早期肉类的鉴别主要依赖于感官和形态学检验，但这些检验方法受仪器、人员经验和肉类处理过程等诸多因素的影响，且局限性大、准确性低，对于深加工肉类中添加的动物源性成分难以鉴别。随着分子生物学的发展，基于DNA分析的PCR技术在肉类和物种鉴定应用中得到了快速发展，成为肉类成分分析的主要技术。但是，PCR反应必须经过变性、退火、延伸3个步骤的多次循环，每个步骤均在不同的温度下进行，需要复杂的控制温度升降设备，必须在专业的实验室才可以实现，一定程度上限制了它的应用和推广。

重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)技术是基于T4噬菌体基因组DNA的复制机制开发的一种新型体外核酸等温扩增技术。其原理是，重组酶与合适长度的核酸片段(引物)结合形成的复合物能在模板上寻找同源序列，并与其发生链的置换反应，在体系中加入聚合酶可启动DNA合成，在恒温条件下即可实现对模板上目标片段的指数式扩增。与传统的聚合酶链式反应(PCR)相比，RPA技术能在恒温条件下扩增DNA，省去了反复升温和降温步骤，摆脱了对核酸扩增仪的依赖，使核酸扩增不再受仪器设备和场地限制，变得更加便捷。RPA的产物可直接通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，也可结合荧光探针进行实时定量检测，或与测流层析试纸条、微流控芯片等方法结合进行检测。目前，基于RPA技术建立的检测方法广泛应用于病原检测与疾病诊断、食品安全检测和转基因作物检测等多个领域。

技术实现要素：

本发明提供了恒温条件下准确、快速、灵敏地从肉制食品中检测猪肉成分的实时荧光RPA检测方法。包括用于RPA检测的试剂，引物及特异性荧光标记探针。

本发明的第一个目的是提供用于检测肉制品中猪肉成分的RPA引物对和探针，所述引物对为：

上游引物：5’-TAAATCTYGTGCCAGCCACCGCGGTCATAC-3’

下游引物：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTGGGYC-3’；

其中，引物中的Y为简并碱基，Y为C或T；

所述探针为：5’-CTAGTTAAAATAAAATAACCCACGAAAG[dT-Fam]G[THF]C-[dT-BHQ1]CTAATAATCCTGAC[C3spacer]-3’。

其中，dT-Fam表示携带荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸，THF表示四氢呋喃连接子，dT-BHQ1表示带有荧光淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸，C3spacer表示间臂。

本发明的第二个目的是提供一种用于检测肉制品中猪肉成分的RPA试剂，所述RPA扩增试剂包括权利要求1所述的引物对以及探针。

作为优选，所述上游引物、下游引物和探针在所述RPA试剂中的终浓度为10μM。

本发明的第三个目的是提供用于检测肉制品中猪肉成分的RPA试剂盒，所述RPA试剂盒包括权利要求1所述的引物对以及探针。

作为优选，所述RPA试剂盒还包括猪标准DNA质粒，所述猪标准DNA质粒的制备方法为：以标准猪DNA为模板，以权利要求1所述的引物对为上下游引物，进行PCR扩增，将扩增产物纯化后，连接载体，转化入感受态细胞培养，提取质粒。

本发明的第四个目的是提供上述的引物对和探针、RPA试剂、RPA试剂盒在如下任一中的应用：

(1)检测或辅助检测猪肉成分；

(2)制备检测或辅助检测猪肉成分的产品；

(3)检测或辅助检测肉制品中是否含有猪肉成分；

(4)制备检测或辅助检测肉制品中是否含有猪肉成分的产品。

本发明的第五个目的是提供一种检测或辅助检测肉制品中是否含有猪肉成分的方法，包括以下步骤：提取肉制品中的DNA作为待检DNA，以待检测DNA为模板，采用权利要求1所述的引物对和探针进行重组酶聚合酶扩增，读取荧光数值，当反应管中荧光值高于阈值时，则判定肉制品中含有猪肉成分。

作为优选，所述重组酶聚合酶扩增时的温度为39-40℃，恒温20min。

本发明具有以下优点：

(1)只需要在39-40℃下恒温反应即可，不需要额外的设备；

(2)反应时间仅需20min；

(3)结果易于判断；

(4)特异性好，灵敏度高。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为分别以标准猪、牛、羊、马、鸡、狗源性DNA 1.0μL和水为模板，进行恒温实时荧光反应。S型扩增曲线对应的样品为猪标准DNA。

图2为以系列标准品为模板，进行恒温实时荧光反应的扩增曲线。

图3为以系列标准品为模板，进行恒温实时荧光反应，根据Cq值绘制的标准曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。在下述实施例中，所使用的主要材料包括RPA exo检测试剂，DNA提取试剂盒等，如无特殊说明，均可从公司购买获得。

实施例1 用于检测肉制品中猪肉成分的RPA引物、探针及试剂盒

一、用于检测肉制品中猪肉成分的RPA引物及探针的设计与合成

在GenBank中获取猪、牛、羊、马、鸡、狗等多种动物的线粒体全基因组序列，通过序列比对，根据RPA检测法中对引物的要求(RPA对引物长度要求为30-35nt，这就容易导致在恒温条件下产生大量的引物二聚体从而影响实验效果，RPA实验需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化，筛选，个别碱基的替换或增减都会对实验结果产生重要影响)，经比对后筛选出12S rDNA上的一段序列，设计出一对通用性引物12S-F和12S-R，根据不同物种这段序列的差异，筛选猪特异性探针序列，对探针序列内部碱基进行必要的荧光基团、错配和3’末端终止修饰以适合RPA exo试剂的检测要求。序列如下：

12S-F：5’-TAAATCTYGTGCCAGCCACCGCGGTCATAC-3’

12S-R：5’-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTGGGYC-3’

12S-P：5’-CTAGTTAAAATAAAATAACCCACGAAAG[dT-Fam]G[THF]C-[dT-BHQ1]CTAATAATCCTGAC[C3spacer]-3’

其中，引物中的Y为简并碱基，Y为C或T。

dT-Fam表示携带荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸，THF表示四氢呋喃连接子，dT-BHQ1表示带有荧光淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸，C3spacer表示间臂，用于而阻止3’端外切酶和3’端聚合酶发挥作用。

引物及探针序列有上海生工生物工程有限公司合成。

二、用于检测肉制品中猪肉成分的RPA方法

1、用于检测肉制品中猪肉成分的RPA试剂

用于检测肉制品中猪肉成分的RPA试剂包括含exo冻干酶反应管，再水化缓冲液(Rehydration Buffer)，醋酸镁溶液(280mmol/L)，上述步骤一设计的上游引物12S-F、下游引物12S-R和探针12S-P，自备的猪标准DNA质粒以及ddH₂O。上述含冻干酶粉反应管、再水化缓冲液(Rehydration Buffer)和醋酸镁溶液(280mmol/L)的RPA检测试剂购买自英国TwistDx公司。

其中，猪标准DNA质粒样品制备方法为：

以12S-F和12S-R为上下游引物，以标准猪DNA为模板，用普通PCR法扩增猪线粒体12S rDNA中包含检测区域的DNA片段。PCR扩增产物用商品化的PCR产物纯化试剂盒纯化后，与pMD18T载体(TaKaRa)按照说明书提供的方法进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞培养，挑取单克隆，摇菌，提取完整的含有目的片段的质粒，对该质粒进行扩增，测序鉴定正确后，测定浓度，计算每微升中检测区域的DNA片段的拷贝数，确定目的片段拷贝数的的质粒为标准品。对质粒标准品进行10倍的倍比稀释，制备系列标准品。具体的，本发明从3×10⁷copies/μL进行10倍倍比稀释，稀释至3×10⁰copies/μL。

上述以12S-F和12S-R为上下游引物，以标准猪DNA为模板，用普通PCR法扩增猪线粒体12S rDNA中包含检测区域的DNA片段的具体方法为：

PCR反应体系如下：

PCR反应条件为，95℃预变性30s，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，设35个扩增循环，扩增循环结束后72℃继续反应10min，结束程序。

扩增产物的核苷酸序列为：

TAAATCTCGTGCCAGCCACCGCGGTCATACGATTAACCCAAATTAATAGATCCACGGCGTAAAGAGTGTTTAAGAAAAAAAAACCACAATAGAGTTAAATTATAACTAAGCTGTAAAAAGCCCTAGTTAAAATAAAATAACCCACGAAAGTGACTCTAATAATCCTGACACACGATAGCTAGGACCCAAACTGGGATTAGATACCCCACTATG。

2、用于检测肉制品中猪肉成分的RPA方法

(1)RPA扩增

以待检测DNA或者步骤1制备的含猪12S rDNA片段的标准质粒为模板进行扩增，反应体系为向RPA exo冻干酶粉反应管依次加入如下试剂：

具体的，先将Mg²⁺以外的其他成分按体积预先混合，加入RPA exo冻干酶粉反应管中，之后再加入Mg²⁺。一旦Mg²⁺加入，DNA扩增反应即可开始。将反应管立即放入荧光定量PCR仪中，按设定的程序运行。荧光定量PCR仪设定的反应程序为39-40℃恒温20min，每隔30s读取荧光值1次。

其中，待检测DNA的提取可以用商品化的试剂盒进行提取，本发明以TaKaRa公司通用DNA提取试剂盒(TaKaRaMiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit)为例说明：

对来源清晰的，标准的猪、牛、羊、马、鸡、狗等肉制品，取100mg，加180μL Buffer GL，再加入10μL Proteinase K和10μL RNaseA溶液，加热震荡混匀，至样本完全裂解。混合液变澄清透明即为裂解完全。加入200μL Buffer BD，充分颠倒混匀。加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀。将吸附柱放回收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再12000r/min室温离心1min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱放回收集管，加入500μL Buffer WA，12000r/min离心1min，倒掉滤液。将吸附柱放回收集管，加入700μL Buffer WB，12000r/min离心1min，倒掉滤液。重复此步骤1次。将吸附柱放回收集管，于12000r/min室温离心2min，离去残留的Buffer WB。取出吸附柱，放入一个新的1.5mL离心管中，加入50μL Elution Buffer，静置3min，12000r/min室温离心2min，收集DNA溶液，-20℃保存备用。

(2)结果的读取

在反应过程中，从荧光定量PCR仪或荧光检测仪上可实时读取荧光数值，当反应管中荧光值高于阈值时，即可判定阳性，即样品中含有猪肉成分；阈值为40。

实施例2 本发明的RPA引物和探针的特异性实验

采用本发明实施例1中试剂盒及其使用方法，分别以标准猪、牛、羊、马、鸡、狗源性DNA 1.0μL为扩增模板，并设以水为模板的阴性对照，在39℃条件下反应，共反应20min，实时读取结果。结果显示，在这个反应过程中，仅在含猪源性样品的反应管中检测到荧光值，呈典型的S型扩增曲线，以牛、羊、马、鸡、狗源性DNA及水为模板的反应管中均未检测到荧光值变化，具体结果见图1。说明本发明的RPA引物和探针的特异性高。

实施例3 本发明的RPA引物和探针的灵敏性实验

配制系列浓度的标准品：3×10⁷copies/μL、3×10⁶copies/μL、…、3×10⁰copies/μL，分别以1.0μL的系列浓度的标准品为模板，采用本发明实施例1中试剂盒及使用方法，在39℃条件下反应，共反应20min，在荧光定量PCR仪上读取结果。结果显示，各系列稀释梯度的标准品均可检测到荧光信号，包括浓度最小的标准样品(3×10⁰copies/μL)，其在反应体系中仅含3个拷贝的检测片段，见图2，3，这表明本发明的方法灵敏性高。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 西北民族大学

<120> 用于检测肉制品中猪肉成分的RPA引物、探针及方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 213

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taaatctcgt gccagccacc gcggtcatac gattaaccca aattaataga tccacggcgt 60

aaagagtgtt taagaaaaaa aaaccacaat agagttaaat tataactaag ctgtaaaaag 120

ccctagttaa aataaaataa cccacgaaag tgactctaat aatcctgaca cacgatagct 180

aggacccaaa ctgggattag ataccccact atg 213