MIM396在增大水稻穗形及提高水稻株高中的应用的制作方法

本发明属于植物学及基因技术领域，更具体地，本发明涉及mim396在增大水稻穗形及提高水稻株高中的应用。

背景技术：

随着地球上耕地面积的逐年减少，农作物的产量难以维持人类的发展。虽然粮食作物的亩产在增加，但总产量难以维持增势。根据联合国粮农组织发布的报告，全球面临较大的粮食危机。一些主要粮食作物、油料作物的品种改良显得极为迫切。

稻为世界上超过半数的人口提供了粮食，是为世界提供了一半以上的食物的三大作物(玉米、小麦和水稻)之一，是举足轻重的粮食作物。随着人民生活水平的提高和稻米市场的开放，中国稻米的品质问题显得日益突出。稻米品质关系到食品安全、粮食出口量和人民生活水平的提高，改良我国稻米品质已经成为一项意义重大且十分紧迫的任务。因此，从分子角度研究稻米品质形成的机制和遗传特性，有利于为水稻优质品种选育提供理论和实践指导。稻米的品质与粒形紧密关联，品质的改变会影响到粒形，反之亦然。因此，对水稻粒形的研究和品质研究往往密不可分。

随着人口的膨胀和可耕地面积的日趋减少，如何在有限的耕地上种出更多的粮食，一直是农业工作者的研究重心。因此研究调节水稻株型、优化水稻种植的手段，是非常重要的工作。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供mim396在增大水稻穗形及提高水稻株高中的应用。

在本发明的第一方面，提供一种mir396或其前体的下调剂的用途，用于改良水稻的性状，包括：增大水稻穗形或提高水稻株高。

在一个优选例中，所述的下调剂是特异性下调mir396或其前体表达的干扰分子，或是基于targetmimicry技术的mir396沉默体。

在另一优选例中，所述的水稻是籼稻或粳稻。

在另一优选例中，所述的籼稻是秀水134；或所述的粳稻是r8015。

在另一优选例中，所述的增大水稻穗形包括：提高穗长，增加穗宽。

在本发明的另一方面，提供一种增大水稻穗形或提高水稻株高的方法，所述方法包括：下调水稻中mir396或其前体的表达。

在一个优选例中，所述的水稻是籼稻或粳稻；较佳地，所述的籼稻是秀水134；或所述的粳稻是r8015。

在另一优选例中，所述的下调水稻中mir396或其前体的表达还增加水稻种子的粒长或粒形，增加水稻种子的千粒重。

在另一优选例中，所述的下调水稻中mir396或其前体的表达包括：利用干扰分子特异性下调mir396或其前体的表达，或利用基于targetmimicry技术的mir396沉默体下调mir396或其前体的表达。

在另一优选例中，所述利用基于targetmimicry技术的mir396沉默体下调mir396表达的方法包括：

(1)将mimicrymir396序列置于ips基因序列中，获得ips-mim396b序列片段；

(2)将ips-mim396b序列片段转入水稻中，获得转基因植物，其为改良的水稻。

在另一优选例中，步骤(1)中，将mimicrymir396序列置于ips基因序列中的cctctagaaa和agcttcggtt之间的位点内；或

所述的mimicrymir396序列如seqidno:14所示。

在本发明的另一方面，提供一种mir396或其前体的用途，用于作为鉴定水稻性状的分子标记；所述的性状包括：水稻穗形或水稻株高。

在一个优选例中，所述的水稻是籼稻或粳稻；较佳地，所述的籼稻是秀水134，或所述的粳稻是r8015。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、mim396转化秀水134的转基因植株对株型和穗形的影响。

a：转基因植株的株型；

b：转基因植株的株高和分蘖数统计分析，统计数据经t-检验后呈现显著差异和极显著差异分别用*(p<0.05)和**(p<0.01)表示；

c：转基因植株的穗形。

图2、mim396转化秀水134对粒形造成的影响。

a：转基因植株的粒形；

b：转基因植株的千粒重统计，统计数据经t-检验后呈现显著差异和极显著差异分别用*(p<0.05)和**(p<0.01)表示；

c：转基因植株的粒长、粒宽和长宽比统计，统计数据经t-检验后呈现显著差异和极显著差异分别用，*(p<0.05)，**(p<0.01)表示。

图3、mim396转化籼稻品种r8015造成的粒形变化。

a：mim396转化r8015的转基因植株的粒形；

b：mim396转化r8015的转基因植株的千粒重统计，统计数据经t-检验后呈现显著差异和极显著差异分别用*(p<0.05)和**(p<0.01)表示；

c：mim396转化r8015的转基因植株的粒长、粒宽和长宽比统计，统计数据经t-检验后呈现显著差异和极显著差异分别用，*(p<0.05)，**(p<0.01)表示。

图4、mim396b质粒构建的示意图。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，发现mir396与水稻的穗形、株高性状密切相关，下调mir396可增大水稻穗形或提高水稻株高。因此，mir396或调节mir396的物质和方法可应用于实现植物品种的改良。

如本文所用，水稻穗形是一种育种性状，穗形的大小与末端分蘖长度、密度等有关，其是独立于水稻种子粒长、粒宽、产量的一种性状。

如本文所用，所述的“植物”是表达mir396或其前体的植物，包括禾本科植物。所述的禾本科植物包括：禾本科稻属植物如水稻，禾本科小麦属植物如小麦，禾本科玉米属植物如玉米等。作为本发明的优选方式，所述的禾本科植物为水稻。

如本文所用，所述的“mir396”指稻属植物的mir396。多种来源于稻属植物的mir396的基因以及相应的成熟mir396的序列被列于表1中。本领域技术人员可以理解，鉴于这些mirna(或它们的前体)之间具有很高的序列相同性，下调这些mirna均能实现对水稻性状的调节，实现与本发明实施例中所验证的下调mir396b相同的技术效果。

表1、源于水稻(osa)的编码mir396的基因以及相应的成熟mir396的序列

本发明提供了一种增大水稻穗形或提高水稻株高的方法，所述方法包括：下调水稻中mir396或其前体的表达。

在得知了所述的mir396的功能后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来下调所述的mir396的表达，这些方法均可被包含在本发明中。比如，可以采用本领域人员熟知的多种方法来干扰mir396的表达或使之缺失表达。

作为本发明的一种实施方式，提供了一种降低植物中mir396的表达的方法，所述的方法包括：

(1)构建基于targetmimicry技术的mir396沉默体，其包括ips基因序列中以及位于该序列的cctctagaaa(seqidno:10)和agcttcggtt(seqidno:11)之间的位点内的mimicrymir396序列；

(2)将(1)获得的mir396沉默体转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；

(3)将步骤(2)获得的转入了所述mir396沉默体的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。

较佳地，所述方法还包括：

(iii)选择出转入了所述载体的植物细胞、组织或器官；和

(iv)将步骤(iii)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。

其它抑制mir396或其前体的方法是本领域周知的。

发明还提供了用于下调所述的mir396或其前体的物质，其通过下调mir396或其前体从而发挥改良植物的性状的功能。所述物质可以是：核酸抑制物、拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等，只要它们能够下调mir396或其前体的表达水平。所述的生物分子可以是核酸水平(包括dna、rna)的，也可以是蛋白水平的。

用于下调所述的mir396或其前体的物质可以是任何可阻止mir396(特别是其中的结合关键位点)或其前体与其靶向序列结合、降低mir396或其前体的活性、降低mir396或其前体的稳定性、下调mir396或其前体的表达、减少mir396或其前体有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调mir396有用的物质。例如，所述的抑制剂是：核酸抑制物，蛋白抑制剂，抗体，配体，核酸酶，核酸结合分子，只要其能够下调mir396的表达。

作为本发明的优选方式，所述物质包括特异性下调mir396或其前体的干扰分子或基于targetmimicry技术的mir396沉默体。更佳地，将mimicrymir396序列置于ips基因序列中的cctctagaaa(seqidno:10)和agcttcggtt(seqidno:11)之间的位点内，获得ips-mim396b序列片段，将该片段置于合适的载体中，转化植物，从而获得性状改良的转基因植物。

本发明还提供包含所述ips-mim396b序列的表达载体，优选植物表达载体；更优选适合于进行后续转基因操作(如应用农杆菌的转基因操作)的表达载体。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

本发明还提供遗传工程化的宿主细胞，其含有ips-mim396b序列或含有包含ips-mim396b序列的载体。宿主细胞通常是植物细胞。转化植物一般可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等；优选的是农杆菌法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得相对于野生型而言性状发生改变的植物。

在本发明的优选实施方式中，所述的“mir396”是mir396b”，其是具有seqidno:2序列的rna。

在本发明的具体实施例中，本发明人将mim396质粒转化了两种主要栽培水稻品种，粳稻秀水134和籼稻r8015。转基因植株分别呈现出明显的大穗表型、长粒表型，证明mim396在水稻中增大粒形具有普遍性。

此外，本发明还涉及利用强mim396作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用mim396作为一种分子标记，通过检测植物中mim396的表达情况，早期确定植物的穗形、株高等的特点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、mim396b转基因植株的构建

用ipsf和ipsr扩增拟南芥的ips基因(其核苷酸序列如seqidno:18)，通过bamhi和saci酶切，构建到克隆载体pbsk的bamhi和saci位点中。

ipsf(bamhi)序列：5’-gtggatccaagaaaaatggccatcccctagc-3’(seqidno:12)。

ipsr(saci)序列：5’-ctggagctcgaggaattcactataaagagaatcg-3’(seqidno:13)。

设计mimicrymir396b序列如下：

5’-ttccacagctttagatcttgaactg-3’(seqidno:14)。

序列中，“taga”的加入使得mim396结合靶基因的能力大大加强，从而使得正常的mir396在结合靶基因的时候不具备竞争力，达到下调正常的mir396的目的。

根据所述的mimicrymir396b以及ips基因中相关序列，设计如下mim396-i和mim396-ii序列：

mim396-i序列：

5’-cgaagctttccacagctttagatcttgaactgtttctagagggagataa-3’(seqidno:15)；

mim396-ii序列：

5’-cctctagaaacagttcaagatctaaagctgtggaaagcttcggttcccctcg-3’(seqidno:16)。

然后，以得到的质粒为模板，以ipsf和mim396-i匹配、ipsr和mim396-ii匹配，进行overlappingpcr，将mimicrymir396b替换到ips基因中mir399的不完全靶位点的位置(图4中虚线框内的碱基)。

之后，将该ips-mim396的片段克隆到超表达载体p1301-35snos的35snos上(位于p1301-35snos的bamhi和saci之间)，并采用农杆菌法转化水稻品种秀水134和籼稻品种r8015，将该ips-mim396片段进行超表达，从而构建成mir396的targetmimcry转基因植株。其中，所述的targetmimcry简写为mim396。

ips-mim396的片段的完整序列为(seqidno:17)：

aaaacaccacaaaaacaaaagaaaaatggccatcccctagctaggtgaagaagaatgaaaacctctaatttatctagaggttattcatcttttaggggatggcctaaatacaaaatgaaaactctctaattaagtggttttgtgttcatgtaaggaaagcgttttaagatatggagcaatgaagactgcagaaggctgattcagactgcgagttttgtttatctccctctagaaattccacagctttagatcttgaactgagcttcggttcccctcggaatcagcagattatgtatctttaattttgtaatactctctctcttctctatgctttgtttttcttcattatgtttgggttgtacccactcccgcgcgttgtgtgttctttgtgtgaggaataaaaaaatattcggatttgagaactaaaactagagtagttttattgatattcttgtttttcatttagtatctaataagtttggagaatagtcagaccagtgcatgtaaatttgcttccgattctctttatagtgaattcctctt

实施例2、mim396过表达植株的性状变化

水稻品种秀水134是上海周边地区种植的晚粳品种。该品种生长整齐，株高适中，株型较紧凑，叶色中绿，茎秆粗壮，穗直立，谷粒椭圆形。

如实施例1所述，本发明人获得了水稻品种秀水134的转基因植株，培育该转基因植株。

结果如图1，转基因植株呈现出株高略增高的表型，分蘖数变化不大(图1a，b)，同时穗形显著增大(图1c)。

除了上述性状变化，本发明人进一步发现，转基因植株的粒形变大(图2a)。对种子的千粒重进行统计，发现转基因植株的粒重增加均在18％以上，其中表型明显的mim396-1，可以增加到34％，mim-2增加19％，mim-4增加18.4％(图2b)。

本发明人进一步分析了粒形的构成因素，发现其中对粒长的影响更加明显，而对粒宽几乎没有影响，从而造成长宽比明显加大(图2c)。

因此，本发明制备的粳稻品种秀水134转基因植物，与野生型相比，株型增高，穗形增大，粒长增长，粒形增大。从图中可见，该穗形的增大体现为：穗长的显著增加，以及穗宽度增加。

实施例3、mim396质粒转化籼稻品种r8015，增大了粒形

粳稻粒形的特点在于圆粒形，相对而言，籼稻的粒形偏向于长粒形。mim396质粒转化粳稻品种秀水134明显增大了粒形，而且对粒长的增长更加明显。为进一步证明mim396质粒是否能够增加本身具有长粒特点的籼稻的粒形，本发明人获得了水稻籼稻品种r8015的转基因植株，如实施例1所述，培育该转基因植株。

结果如图1，水稻籼稻品种r8015的转基因植株也呈现明显的粒长增加的表型(图3a)，统计千粒重，也呈现明显增加，mim396-1千粒重增加幅度在5.8％，而mim396-2的增加幅度在8.4％(图3b)。

本发明人进一步分析了粒形的构成因素，发现其中对粒长的影响更加明显，而对粒宽几乎没有影响，从而造成长宽比明显加大(图3c)。

据此，本发明人认为，无论在籼稻还是粳稻中，mim396具有明显的增大粒形从而提高千粒重的功能；在粒形的构成因素中，mim396又偏向于增长粒长，而对粒宽的影响不明显。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>mim396在增大水稻穗形及提高水稻株高中的应用

<130>17a224

<160>18

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna/rna

<213>水稻(oryzasativa)

<400>1

uuccacagcuuucuugaacug21

<210>2

<211>21

<212>dna/rna

<213>水稻(oryzasativa)

<400>2

uuccacagcuuucuugaacuu21

<210>3

<211>21

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<213>水稻(oryzasativa)

<400>3

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<210>4

<211>24

<212>dna/rna

<213>水稻(oryzasativa)

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<210>5

<211>21

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<213>水稻(oryzasativa)

<400>5

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<210>6

<211>22

<212>dna/rna

<213>水稻(oryzasativa)

<400>6

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<210>7

<211>24

<212>dna/rna

<213>水稻(oryzasativa)

<400>7

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<210>8

<211>21

<212>dna/rna

<213>水稻(oryzasativa)

<400>8

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<210>9

<211>21

<212>dna/rna

<213>水稻(oryzasativa)

<400>9

uccacaggcuuucuugaacgg21

<210>10

<211>10

<212>dna/rna

<213>水稻(oryzasativa)

<400>10

cctctagaaa10

<210>11

<211>10

<212>dna/rna

<213>水稻(oryzasativa)

<400>11

agcttcggtt10

<210>12

<211>31

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

gtggatccaagaaaaatggccatcccctagc31

<210>13

<211>34

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

ctggagctcgaggaattcactataaagagaatcg34

<210>14

<211>25

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

ttccacagctttagatcttgaactg25

<210>15

<211>49

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

cgaagctttccacagctttagatcttgaactgtttctagagggagataa49

<210>16

<211>52

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

cctctagaaacagttcaagatctaaagctgtggaaagcttcggttcccctcg52

<210>17

<211>543

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

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ggagaatagtcagaccagtgcatgtaaatttgcttccgattctctttatagtgaattcct540

ctt543

<210>18

<211>542

<212>dna/rna

<213>拟南芥(arabidopsisthaliana)

<400>18

aaaacaccacaaaaacaaaagaaaaatggccatcccctagctaggtgaagaagaatgaaa60

acctctaatttatctagaggttattcatcttttaggggatggcctaaatacaaaatgaaa120

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