一种基于随机表达元件倍增方式构建随机蛋白表达文库的方法与流程

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种构建随机蛋白表达文库的方法。

背景技术：

酶作为高效的催化剂，广泛应用于农业、环境、能源等多个方面。随着酶的应用范围进一步扩大和深入，对新酶的开发需求也越来越迫切。新酶的获得不仅能促进酶的应用，而且对酶催化机理、机制的研究有重要意义。随机文库结合展示技术、定向进化是目前获得全新功能多肽、酶或蛋白的重要手段之一。并且，从随机文库中筛选活性比较弱的“原始”酶，然后定向进化成活性较好的全新酶将是获得新酶开发的新方向。但目前随机文库表达的蛋白分子小，限制了从随机文库中筛选新酶或新蛋白的效率。或者说，随机表达分子量较小的蛋白表达文库在理论上是不可能包含所需的新酶或新蛋白。构建随机表达大分子量的蛋白表达文库目前比较困难，遇到的问题常常有：1.随机表达的蛋白分子量越大，也就是随机表达蛋白的氨基酸数目越多，则需要表达载体上插入的随机dna片段越大。但随机dna片段越大，在其翻译阅读框中出现的终止密码子的概率就越大。最终导致整个文库表达的随机蛋白的平均分子量仍然较小；2.dna合成技术限制了合成的dna的长度，通过dna合成技术很难获得大分子量的随机dna序列。例如只表达33个氨基酸的随机蛋白就需要合成长度约100bp的随机dna片段，这已经比较困难，更别说合成超过300bp的随机dna片段。因此，本发明通过随机表达元件的倍增方式建立一种构建随机表达大分子量蛋白表达文库的新方法。

技术实现要素：

本发明的目的是建立一种基于随机表达元件倍增方式构建随机蛋白表达文库的方法。随机dna序列的通式为(nnn)n，其中n＝a、t、c、g中的一种，n＝1至14中任一整数。本发明要求制备的随机表达序列包括5＇和3＇末端非随机序列及中间的随机dna序列；5＇末端依次携带内切酶1识别序列和内切酶2识别序列，3＇末端携带内切酶3识别序列，内切酶2和内切酶3是同尾酶，且由内切酶2酶切产生的末端与内切酶3酶切产生的末端连接后的序列与表达元件的阅读框融合后不能含有终止密码子；其中内切酶1不是内切酶2或3的同裂酶且内切酶1不能识别并切割由内切酶2酶切产生的末端与内切酶3酶切产生的末端连接后的序列。如图1所示，本发明的文库载体携带单拷贝抗生素抗性基因x，且抗性基因x的5＇端上游有内切酶1和内切酶3识别序列。通过内切酶1和内切酶3将随机表达序列克隆到文库载体上，经抗性基因x相应抗生素筛选后得到能完整表达的随机dna序列称之为随机表达元件，所有的克隆称之为初级随机表达元件文库。pcr扩增该文库的随机表达序列并经内切酶1和内切酶3处理，然后与内切酶1和内切酶2处理过的初级随机表达元件文库的载体dna酶连、转化以及抗性基因x相应抗生素筛选获得二级随机表达元件文库。同样，pcr扩增二级随机表达元件文库的所有随机表达元件(包括随机表达元件5＇端上游的内切酶1识别序列，内切酶2识别序列以及3＇端下游的内切酶3识别序列)，内切酶1和内切酶3处理后与内切酶1和内切酶2处理过的二级随机表达元件文库的载体dna酶连、转化以及抗性基因x相应抗生素筛选获得三级随机表达元件文库。最后，pcr扩增三级随机表达元件文库的所有随机表达元件(包括随机表达元件5＇端上游的内切酶1识别序列，内切酶2识别序列以及3＇端下游的内切酶3识别序列)，内切酶1和内切酶3处理后与内切酶1和内切酶2处理过的三级随机表达元件文库的载体dna酶连、转化以及相应抗生素筛选获得随机表达大分子量的蛋白表达文库。根据实际需要，本发明可以通过改变随机dna序列的长度调整随机表达蛋白的分子量。

本发明提供的一种基于随机表达元件倍增方式构建随机蛋白表达文库的方法，包括以下步骤(为了便于描述，以下将抗生素抗性基因表述为抗生素抗性基因x,与图1中描述对应)：

(a)准备随机表达序列：通过dna合成技术或pcr方法使随机dna片段的5＇末端依次携带内切酶1识别序列和内切酶2识别序列，3＇末端携带内切酶3识别序列，其中内切酶2和内切酶3是同尾酶，且由内切酶2酶切产生的末端与内切酶3酶切产生的末端连接后的序列与表达元件的阅读框融合后不能含有终止密码子；其中内切酶1不是内切酶2或3的同裂酶(同裂酶的定义模糊，本发明指的是来源于不同物种但能识别相同的序列，产生相同的末端)且内切酶1不能识别并切割由内切酶2酶切产生的末端与内切酶3酶切产生的末端连接后的序列；准备好的随机序列包括5＇和3＇末端非随机序列及中间的随机dna片段；

(b)准备文库载体：将抗生素抗性基因x克隆到不携带该抗生素抗性基因且能正常表达x基因的克隆载体上，其中该抗生素抗性基因的5＇端上游依次有内切酶1和内切酶3识别序列；构建完成的载体可以用于随机表达文库的构建，在这里称之为文库载体；

(c)筛选随机表达序列的和构建初级随机表达元件文库：将随机表达序列经内切酶1和内切酶3处理后与同样经过内切酶1和内切酶3处理的文库载体酶连并转化相应的宿主菌，转化的宿主菌通过抗生素抗性基因x相对应的抗生素筛选，得到的阳性菌落群称之为初级随机表达元件文库，其文库载体携带的随机dna序列称之为随机表达元件；

(d)构建二级随机表达元件文库：用pcr方法扩增初级随机表达元件文库中的随机表达元件，pcr扩增的区域应包括随机表达元件5＇端上游的内切酶1识别序列，内切酶2识别序列以及3＇端下游的内切酶3识别序列；利用内切酶1和内切酶3处理pcr产物；提取初级随机表达元件库的载体dna，并利用内切酶1和内切酶2处理；将都经过酶切处理后的pcr产物和初级随机表达文库的载体dna酶连并转化相应宿主菌；转化的宿主菌通过抗生素抗性基因x相对应的抗生素筛选，得到的阳性菌落群称之为二级随机表达元件文库；文库载体上将携带2个随机表达元件；

(e)构建三级随机表达元件文库：用pcr方法扩增二级随机表达元件文库中的所有随机表达元件，pcr扩增的区域应包括随机表达元件5＇端上游的内切酶1识别序列，内切酶2识别序列以及3＇端下游的内切酶3识别序列；内切酶1和内切酶3处理pcr产物；提取二级随机表达元件文库的载体dna，利用内切酶1和内切酶2处理；将都经过酶切处理后的pcr产物和二级随机表达元件文库的载体dna酶连并转化相应宿主菌；转化的宿主菌通过抗生素抗性基因相对应的抗生素筛选，得到的阳性菌落群称之为三级随机表达元件文库；文库载体上将携带4个随机表达元件；

(f)构建四级随机表达元件文库：用pcr方法扩增三级随机表达元件文库中的所有随机表达元件，扩增的区域应包括随机表达元件5＇端上游的内切酶1识别序列，内切酶2识别序列以及3＇端下游的内切酶3识别序列；内切酶1和内切酶3处理pcr产物；提取三级随机表达元件文库的载体dna，利用内切酶1和内切酶2处理；将都经过酶切处理后的pcr产物和三级随机表达元件文库的载体dna酶连并转化相应宿主菌。转化的宿主菌通过抗生素抗性基因相对应的抗生素筛选，得到的阳性菌落群称之为四级随机表达元件文库；

其中，步骤(c)、(d)、(e)、(f)构建的随机表达元件文库均能作为随机蛋白表达文库用于筛选目的蛋白或其他功能蛋白。

具体地，步骤(a)中随机dna片段通式为(nnn)*n，n＝a、t、c、g中的一种，n为1-14中的任一整数。

进一步地，本发明提供的一种基于随机表达元件倍增方式构建随机蛋白表达文库的方法，通过改变步骤(a)中随机表达序列的大小，改变(c)(d)(e)(f)步骤中随机表达元件文库表达的蛋白分子量大小，尤其适合构建各种表达蛋白分子量大小不同的随机表达文库。

具体地，所述n为大于14的整数，现有技术水平完成可以合成更长的随机表达序列，不存在现有技术障碍。

具体地，上述方法步骤(c)、(d)、(e)、(f)中的文库的随机表达序列的增长是通过随机表达元件的倍增实现的。

进一步地，本发明提供的一种基于随机表达元件倍增方式构建随机蛋白表达文库的方法，根据需要构建表达更大分子量的随机蛋白表达文库，可以将步骤(f)所获得的随机蛋白表达文库作为随机表达元件文库来进一步逐级倍增构建随机蛋白表达文库。

进一步地，本发明提供的一种基于随机表达元件倍增方式构建随机蛋白表达文库的方法，可以通过改变随机表达序列的大小和调整倍增的级数来改变随机蛋白表达文库中随机表达的蛋白分子量大小。

附图说明

图1为基于随机表达元件倍增方式构建随机蛋白表达文库的方法的原理示意图；

图2为本发明一实施例中获得的puc18-kanr质粒图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明创造的技术方案进一步说明，但并不以任何形式限制本发明。本发明的原理参见图1。

本发明的生物材料来源：克隆载体puc18，购自takara大连生物有限公司。pet28a质粒(含有卡那抗性基因kanr，pet28a序列参见genbankid:kj782405.1)作为卡那抗性基因的模板购自novagen公司。所有引物和随机序列模板由发明人自行设计并委托上海生物生工有限公司合成。所有的premixextaq、限制性内切酶、t4连接酶、pcr产物回收试剂盒、快速酶连试剂盒和dh5a感受态细胞购自takara大连生物有限公司。

在本发明提供的一种基于随机表达元件倍增方式构建随机蛋白表达文库的方法的具体实施例中利用卡那抗性基因kanr筛选随机表达元件，并利用随机表达元件进一步构建随机表达大分子量蛋白的文库。包括以下步骤:

(a)随机表达序列的准备。申请人设计了随机序列random-tem序列，random-tem5＇端非随机序列如seqidno.17所示，random-tem3＇端非随机序列如seqidno.18所示，该序列含有42((nnn)*14)个随机序列，其上游依次携带了xbai识别序列，其下游携带有spei识别序列，spei和xbai为同尾酶。random-tem序列委托上海生物生工有限公司合成。以random-tem为模板，通过引物randombamhif(序列如seqidno.15所示)和randomr(序列如seqidno.16所示)进行pcr。pcr反应体系为：premixextaq10μl，randombamhif和randomr(10mm)，各1μl，random-tem(1mm)1μl，无菌水7μl。pcr反应条件：95℃3min后接着35个循环，循环为95℃30s，60℃30s，72℃60s，循环后4℃处理。pcr反应得到约100bp大小的条带。由于引物randombamhif(序列如seqidno.15所示)有bamhi识别序列，因此pcr产物的5’端有bamhi识别序列，3’端包含有spei识别序列。由此获得随机表达序列。

(b)构建文库载体puc18-kanr载体

(1)挑起含有puc18的单菌落接种于含50ng/ml氨苄青霉素的50mllb液体培养基中，37℃、180r/min恒温摇床培养过夜，

(2)收集菌体，使用碱性裂解法提取puc18质粒，通过nanodro2000测定质粒浓度；

(3)ecori和hindiii酶切puc18质粒：使用ecori酶切puc18质粒，乙醇沉淀回收dna后再使用hindiii酶切，乙醇沉淀回收双酶切后的质粒。使用nanodro2000测定酶切后的质粒浓度。

(4)卡那抗性基因kanr的克隆：设计和合成引物puc-kanf(序列如seqidno.13所示)和puc-kanr(序列如seqidno.14所示)。以50ngpet28a质粒为模板，pcr扩增kanr基因片段。pcr反应体系为：premixextaq10μl，puc-kanf和puc-kanr(10mm)，各1μl，pet28a质粒1μl，无菌水7μl。pcr反应条件：95℃3min后接着35个循环，循环为95℃30s，58℃30s，72℃60s，循环后4℃处理。pcr反应后dna琼脂糖电泳回收820bp左右条带，使用ecori和hindiii酶切该片段，乙醇沉淀回收酶切后的pcr条带。使用nanodro2000测定酶切后的pcr产物浓度。

(5)使用快速酶连试剂盒将酶切之后的puc18质粒和pcr产物进行酶连，转化dh5a，通过含50ng/ml卡那霉素的lb平板筛选阳性菌落。获得的阳性菌落委托上海生物生工有限公司测序进行确认。获得的puc18-kanr质粒图谱，如图2。含有puc18-kanr质粒的菌株能在50ng/ml卡那霉素和50ng/ml氨苄青霉素的lb培养基中生长。

(c)筛选随机表达元件和构建初级随机表达元件文库。

将步骤(a)准备好的随机表达序列，使用bamhi和spei进行酶切处理后经pcr产物试剂盒纯化，nanodro2000测定浓度。将puc18-kanr质粒使用bamhi和spei进行酶切处理后经pcr产物试剂盒纯化，nanodro2000测定浓度。将酶切处理后的pcr产物与酶切处理后的puc18-kanr质粒按照分子数比为1/3-1/10之间进行酶连，然后转化dh5a菌。通过含50ng/m卡那霉素的lb平板筛选阳性菌落，由此得到了初级随机表达元件文库。阳性克隆子携带的外源dna片段认为是随机表达序列。挑取3个阳性菌落委托上海生物生工有限公司测序。结果如序列seqidno.1，seqidno.2，seqidno.3所示。这3个序列都含有xbai和spei识别序列，在这个识别序列之间是42bp的随机表达元件,编码14个氨基酸。这说明利用puc18-kanr载体能从随机序列中筛选随机表达元件。

(d)构建二级随机表达元件文库。

(1)将初级随机表达元件文库所有克隆子混合在一起接种于含50ng/ml氨苄青霉素和50ng/ml卡那霉素的50mllb液体培养基中，37℃、180r/min恒温摇床培养2-6h，取5ml菌液提取质粒。该质粒就是随机表达元件混合模板。

(2)根据puc18-kanr载体序列设计引物vectorf(序列如seqidno.19所示)和vectorr(序列如seqidno.20所示)，用于扩增其乳糖操纵子到kanr基因上游之间的序列。以随机表达元件混合模板为模板，通过引物vectorf和vectorr进行pcr反应。pcr反应体系为：premixextaq10μl，vectorf和vectorr(10mm)，各1μl，随机表达元件混合模板1μl，无菌水7μl。pcr反应条件：95℃3min后接着35个循环，循环为95℃30s，50℃30s，72℃60s，循环后4℃处理。pcr产物经dna琼脂糖电泳后纯化约200bp的条带。将该条带bamhi和spei进行酶切处理后经pcr产物纯化试剂盒纯化，nanodro2000测定浓度。将随机表达元件混合模板使用bamhi和xbai进行酶切处理后纯化，nanodro2000测定浓度。将酶切处理后的pcr产物与酶切处理后的随机表达元件混合模板按照分子数比为1/3-1/10之间进行酶连，然后转化dh5a。通过含50ng/m卡那霉素的lb平板筛选阳性菌落，由此得到了二级随机表达元件文库。挑取3个菌落委托上海生物生工有限公司测序。测序结果如序列seqidno.4，seqidno.5，seqidno.6所示。这3个序列5＇和3＇端都分别含有xbai和spei识别序列。这两个识别序列之间的序列被actaga分成2个42bp随机序列。这2个随机序列都编码14个氨基酸。actaga是同尾酶xbai和spei酶切末端相互连接后的特征序列。这表明测序序列含有2个随机表达元件并通过xbai和spei酶切后酶连形成。

(e)构建三级随机表达元件文库。

(1)将二级随机表达元件文库所有克隆子混合在一起接种于含50ng/ml氨苄青霉素和50ng/ml卡那霉素的50mllb液体培养基中，37℃、180r/min恒温摇床培养2-6h，取5ml菌液提取质粒。该质粒就是二级随机表达文库混合质粒。

(2)以二级随机表达文库混合质粒为模板，通过引物vectorf和vectorr进行pcr反应。pcr反应体系为：premixextaq10μl，vectorf和vectorr(10mm)，各1μl，二级随机表达文库混合质粒1μl，无菌水7μl。pcr反应条件：95℃3min后接着35个循环，循环为95℃30s，50℃30s，72℃60s，循环后4℃处理。pcr产物经dna琼脂糖电泳后纯化约250bp的条带。将该条带bamhi和spei进行酶切处理后经pcr产物试剂盒纯化，nanodro2000测定浓度。将二级文库混合质粒使用bamhi和xbai进行酶切处理后经pcr产物试剂盒纯化，nanodro2000测定浓度。将酶切处理后的pcr产物与酶切处理后的二级随机表达元件文库混合质粒按照分子数比为1/3-1/10之间进行酶连，然后转化dh5a。通过含50ng/m卡那抗生素的lb平板筛选阳性菌落，由此得到了三级随机表达元件文库。随机挑取3个菌落委托上海生物生工有限公司测序。测序结果如序列seqidno.7，seqidno.8，seqidno.9所示。这3个序列5＇和3＇端都分别含有xbai和spei识别序列。每个序列都是5＇末端xbai位点之后的42bp序列紧接着actaga序列，总共有4个42bpdna序列。这4个42bpdna序列都编码14个氨基酸。这表明测序序列都含有4个随机表达元件并通过xbai和spei酶切后酶连形成。

(f)构建四级随机表达元件文库

(1)将三级随机表达元件文库所有克隆子混合在一起接种于含50ng/ml氨苄青霉素和50ng/ml卡那霉素的50mllb液体培养基中，37℃、180r/min恒温摇床培养2-6h，取5ml菌液提取质粒。该质粒就是三级随机表达元件文库混合质粒。

(2)以三级随机表达元件文库混合质粒为模板，通过引物vectorf和vectorr进行pcr反应。pcr反应体系为：premixextaq10μl，vectorf和vectorr(10mm)，各1μl，三级随机表达文库混合质粒1μl，无菌水7μl。pcr反应条件：95℃3min后接着35个循环，循环为95℃30s，50℃30s，72℃60s，循环后4℃处理。pcr产物经dna琼脂糖电泳后纯化约350bp的条带。将该条带bamhi和spei进行酶切处理后经pcr产物试剂盒纯化，nanodro2000测定浓度。将三级文库混合质粒使用bamhi和xbai进行酶切处理后经pcr产物试剂盒纯化，nanodro2000测定浓度。将酶切处理后的pcr产物与酶切处理后的三级随机表达文库混合质粒按照分子数比为1/3-1/10之间进行酶连，然后转化dh5a。通过含50ng/m卡那抗生素的lb平板筛选阳性菌落，由此得到了三级表达文库。挑取3个菌落委托上海生物生工有限公司测序。测序结果如序列seqidno.10，seqidno.11，seqidno.12所示。这3个序列5＇和3＇端都分别含有xbai和spei识别序列。每个序列都是5＇末端xbai位点之后的42bp序列紧接着actaga序列，总共有8个42bpdna序列。这8个42bpdna序列都编码14个氨基酸。这表明测序序列都含有8个随机表达元件并通过xbai和spei酶切后酶连形成。

以上步骤(c)、(d)、(e)、(f)构建的随机表达元件文库均能作为随机蛋白表达文库用于筛选目的蛋白或其他功能蛋白。

在本发明的构思框架下，本领域技术人员可以在步骤(a)中合成更长或更短的随机表达序列，并结合构建随机表达元件文库级别的调整，获得合适的随机蛋白表达文库。

在具体实施过程中，由于具体使用不同内切酶，文库载体与随机dna序列酶链后导致随机表达元件不能与上述抗性基因的表达框完整融合，也就是随机表达元件的插入使上述抗性基因的表达框发生移码突变，可以根据具体使用酶酶切是否产生非3的整数倍的序列，在步骤(a)中设置随机dna片段通式为(nn)a(nnn)n，其中n＝a、t、c、g中的一种，a＝0-2中任一整数，n为大于等于1的整数。这一合成按照常规实验操作方法完成或委托生物公司进行合成。

本发明涉及到的引物：

序列表

<110>广州医科大学

<120>一种基于随机表达元件倍增方式构建随机蛋白表达文库的方法

<150>201910134946x

<151>2019-02-24

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<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>19

ccccaggctttacacttt18

<210>20

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>20

tcccgttgaatatggctc18