溶血活性和磷脂酶活性降低蜡样芽胞杆菌的制备的制作方法

文档序号：18304538发布日期：2019-07-31 10:50阅读：545来源：国知局

本发明涉及生物技术领域中，溶血活性和磷脂酶活性降低蜡样芽胞杆菌的制备。

背景技术：

蜡样芽胞杆菌是一种常用的益生菌。在蜡样芽胞杆菌进入肠道后争夺环境中的氧，促进厌氧菌群的生长，进而起到改善肠道微生态环境，调整肠道菌群失调。目前，已有上市的人用蜡样芽胞杆菌微生物制剂，用于菌群失调引起的腹泻的治疗。蜡样芽胞杆菌也被用作动物饲料添加剂，用于促进动物生长。此外，蜡样芽胞杆菌还可能用作机体的免疫调节剂。总之，蜡样芽胞杆作为常用的一种微生态制剂生产菌株，在人、动物、食品和饲料领域有很大的应用潜力。

同时，蜡样芽胞杆菌作为一种条件致病菌，能够引起人类牙周炎、食物中毒及急性眼炎等多种疾病。它引起的食物中毒也是世界各地最常见的食物中毒之一。虽然蜡样芽胞杆菌引起食物中毒主要是由于其产生的致泻型或呕吐型肠毒素引起的，但蜡样芽胞杆菌产生的溶血素和磷脂酶也是不容忽视的致病风险因子。

广义蜡样芽胞杆菌群(bacilluscereussensulatogroup)包括七个关系密切的菌种：炭疽芽胞杆菌(bacillusanthracis)、蜡样芽胞杆菌(bacillus.cereus)、苏云金芽胞杆菌(bacillusthuringiensis)、蕈状芽胞杆菌(bacillus.mycoides)、假蕈状芽胞杆菌(bacillus.pseudomycoides)、韦氏芽胞杆菌(bacillus.weihenstephanensis)和近年发现的新种bacillus.cytotoxicus。它们的染色体具有极高的遗传相似性，并且该分类群的rrna序列也几乎是相同的，仅在单个物种预期的变异范围内有所不同。

crispr/cas系统是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构，被认为是原核生物防御外来噬茵体、质粒或其他外源dna侵染的获得性免疫系统，该系统中的crrna在一个反式激活crrna(tracrrna)的辅助下，募集效应蛋白(cas蛋白)并把它们带到靶标dna序列，cas蛋白利用其核酸酶的功能切割外源dna序列，引起dna双链断裂(doublestrandbreak,dsb)。目前该系统已经被广泛利用进行基因编辑。为了更方便简单的利用该系统，研究人员将ii性crispr/cas9系统中的crrna-tracrrna双链rna复合体人工改造为一条嵌合的单链rna，被称为单向导rna(singleguiderna，sgrna)，其5’端20nt(即为spacer序列，这里称为n20)的特异性的序列配对来靶向dna位点，靶dna序列3’末端的pam(5’-ngg-3’)为cas9识别位点，不能包含在sgrna之中。应用的时候只需更换sgrna的5’末端的n20序列就能够指导cas蛋白切割目标dna序列。2013年该系统率先应用到人类和小鼠胚胎干细胞的基因编辑中，目前已经成功应用到小鼠、猪、食蟹猴、斑马鱼、拟南芥、高粱、烟草、水稻、线虫、酵母、大肠杆菌等多种动植物和微生物中，成为生物学和医学各领域广泛应用的基因编辑工具。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何降低蜡样芽胞杆菌溶血活性和/或磷脂酶活性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蜡样芽胞杆菌突变体的构建方法，所述方法包括：利用基因编辑系统将出发蜡样芽胞杆菌中目的dna的第640-642位突变为tag或taa，得到蜡样芽胞杆菌突变体；

所述出发蜡样芽胞杆菌含有所述目的dna。

所述目的dna可为下述b1)、b2)或b3)：

b1)序列表中序列1所示的dna分子；

b2)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的dna分子；

b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的dna分子。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列1具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，2×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；也可为：在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×ssc,0.1％sds和1×ssc,0.1％sds各洗膜一次；也可为：2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述方法中，与所述出发蜡样芽胞杆菌相比，所述蜡样芽胞杆菌突变体溶血活性和/或磷脂酶活性下降。

本发明还提供了降低蜡样芽胞杆菌溶血活性和/或磷脂酶活性的方法，所述方法包括：利用基因编辑系统将出发蜡样芽胞杆菌中目的dna的第640-642位突变为tag或taa，得到与所述出发蜡样芽胞杆菌相比溶血活性和/或磷脂酶活性下降的蜡样芽胞杆菌突变体，实现蜡样芽胞杆菌溶血活性和/或磷脂酶活性的降低。

上文中，所述基因编辑系统可为crispr/cas系统，如crispr/cas9系统。

所述crispr/cas系统中sgrna的靶序列可为序列表中序列1的第726-745位。

利用基因编辑系统将出发蜡样芽胞杆菌中目的dna的第640-642位突变为tag或taa可包括：将基因编辑质粒导入所述出发蜡样芽胞杆菌中，得到重组菌；从所述重组菌中筛选得到目的dna的第640-642位突变为tag或taa的重组突变菌株；驱除所述重组突变菌株中的所述基因编辑质粒，即得到所述蜡样芽胞杆菌突变体；

所述基因编辑质粒含有cas9的编码基因和靶向序列表中序列1的第726-745位sgrna的编码基因。所述基因编辑质粒能表达cas9并能转录所述sgrna。

从所述重组菌中筛选得到目的dna的第640-642位突变为tag或taa的重组突变菌株可通过pcr扩增和对得到的pcr扩增产物进行测序完成。

所述基因编辑质粒可为温敏质粒。所述温敏质粒具体可在37℃下从宿主中丢失。

所述基因编辑质粒还可含有序列表中序列2所示的dna分子。

与所述出发蜡样芽胞杆菌相比，所述蜡样芽胞杆菌突变体中目的dna的第642位下游还可含有突变。

所述基因编辑质粒具体可为向pjoe8999质粒的两个bsal识别序列间插入序列表中序列1的第726-745位所示的dna片段、并向pjoe8999质粒的两个sfi1识别序列间插入序列表中序列2所示的dna片段得到的重组质粒。

所述驱除所述重组突变菌株中的所述基因编辑质粒可通过将所述重组突变菌株在37℃下培养实现。

在本发明的一个实施例中，所述出发蜡样芽胞杆菌为蜡样芽胞杆菌hn001。

利用所述蜡样芽胞杆菌突变体的构建方法制备的蜡样芽胞杆菌突变体，也属于本发明的保护范围。

所述基因编辑质粒，也属于本发明的保护范围。

所述基因编辑质粒在降低蜡样芽胞杆菌溶血活性和/或磷脂酶活性中的应用，

或所述基因编辑质粒在制备降低蜡样芽胞杆菌溶血活性和/或磷脂酶活性产品中的应用，也属于本发明的保护范围。

所述产品可为试剂盒。

本发明中，所述磷脂酶活性可为卵磷脂酶活性。

本发明利用蜡样芽胞杆菌突变体的构建方法构建了与出发蜡样芽胞杆菌相比溶血活性和/或磷脂酶活性下降的蜡样芽胞杆菌突变体，该突变体的溶血活性大幅减弱，卵磷脂酶完全丢失。该菌株的制备方法具有如下优势：使用crispr/cas9系统只进行1个核苷酸的编辑，最大程度的避免对原始菌株的影响，菌株的安全性高；不引入抗性标记，重组位点等外源dna，保证了菌株遗传背景清晰；目标位点的编辑可以稳定遗传。因此，本发明的蜡样芽胞杆菌突变体的构建方法及所得突变体具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为质粒pjhrt构建图。图中’grna表示sgrna骨架。

图2为hprm序列与目的dna相比的突变位点。原序列表示目的dna序列，突变后表示hprm序列。

图3为失去溶血活性蜡样芽胞杆菌筛选及确定。a图中箭头所示的3个克隆为失去溶血活性的蜡样芽胞杆菌阳性候选菌株pjhrt/hn1m；b为三个阳性候选菌株pjhrt/hn1m的目的dnapcr扩增凝胶电泳图，m为dna分子量标准，clone1-3分别为三个阳性候选菌株pjhrt/hn1m；c为阳性候选菌株测序比对结果图，3个阳性候选菌株目的dna阅读框的第640位核苷酸均由g突变为了t，与模板序列hprm序列一致。

图4为hn1m的三个克隆的pcr检测结果。m为dna分子量标准，clone1-3为hn1m的三个克隆。

图5为hn1m溶血活性和卵磷脂酶活性的检测结果。a图为溶血活性检测，b图为卵磷脂酶活性检测，a和b中心菌株为蜡样芽胞杆菌hn001，其上方菌株为炭疽芽胞杆菌a16pi2(无溶血的阴性对照)，左侧、下方和右侧菌株依次为hn1m三个克隆。

图6为溶血环宽度和磷脂环宽度的定量结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3′末端核苷酸。

下述实施例中的pjoe8999质粒(josefaltenbuchner.editingofthebacillussubtilisgenomebythecrispr-cas9system[j].appliedandenvironmentalmicrobiology,2016,82(17):5421-5427.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的蜡样芽胞杆菌hn001(王玉莲,田万红,喻钢,等.蜡样芽孢杆菌蔗糖代谢差异分析[j].中华微生物学和免疫学杂志,2015(6):429-430.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、溶血活性和卵磷脂酶活性减弱菌株的制备

本实施例利用crispr/cas9系统对蜡样芽胞杆菌hn001的目的dna(序列表中序列1，其名称为hpr)进行基因编辑，获得了一株溶血活性和卵磷脂酶活性大幅减弱的菌株。步骤如下：

一、基因编辑质粒pjhrt设计与构建

骨架质粒：pjoe8999质粒。

a.蜡样芽胞杆菌hn001染色体上目的dna靶标序列(n20)序列设计

利用crispr/cas9系统对蜡样芽胞杆菌hn001染色体上(genbankaccessionno.nz_cp011155.1)的目的dna进行编辑的sgrna的靶序列(即n20)为5′-aggtgaatgcctagggaagt-3′(序列1的第726-745位)，将该序列命名为htar序列(表1)。

b.将htar序列插入温度敏感型穿梭质粒pjoe8999两个bsal位点间(见图1)，方法如下：

(1)分别在htar序列和htar反向互补序列的两端加上4nt突出接头(tacg；aaac)，合成如下两条寡核苷酸：

fhtar:5’-tacgaggtgaatgcctagggaagt-3’；

rhtar:5’-aaacacttccctaggcattcacct-3’。

(2)将fhtar和rhtar先退火融合，得到含两个突出接头的双链dna。

(3)将步骤(2)得到的双链dna通过golden-gate方法连接到pjoe8999的两个bsal位点间，酶切/连接体系如下：

反应条件：37℃，30min；50℃，5min；80℃，5min。反应完成后，将连接产物转化大肠杆菌dh5α进行蓝白斑筛选，挑选白斑，提取质粒进行测序鉴定。将含有htar序列且序列正确的重组质粒命名为pjoe8999t。

c.将hprm插入pjoe8999t质粒两个sfi1位点间(见图1)。

全基因合成突变的目的dna(hprm，序列表中序列2)，并插入到pjoe8999t中，构建成功的质粒就是用于蜡样芽胞杆菌目的基因原位失活的基因编辑质粒，命名为pjhrt，该质粒为向pjoe8999t质粒两个sfi1位点间插入hprm得到的重组质粒。该质粒中插入的hprm序列中包含的目的dna阅读框的640位核苷酸g突变为t，相应位置的密码子gag(编码glu，e)，变为终止密码子tag；为防止cas9蛋白切割插入到pjoe8999t中的打靶序列，该插入序列中的sgrna识别序列的四个密码子第三位核苷酸均进行了同义突变，同时把cas9酶识别的pam序列(tgg)也突变为(tag)，使sgrna不能识别插入载体中的hprm，只能识别hn001染色体上目的dna的相应序列，并且cas9酶在插入载体中的hprm中也找不到pam序列(图2)。

二、菌株的制备

1、重组菌的制备

步骤一得到的pjhrt导入蜡样芽胞杆菌hn001中，得到重组菌，将该重组菌记为pjhrt/hn001。

2、诱导筛选目的基因的失活蜡样芽胞杆菌

将步骤1得到的pjhrt/hn001，接种到5mllb液体培养基(含25μg/ml卡那霉素)30℃，220rpm摇床培养3小时，然后向培养体系中加0.4mg/100ml的d-甘露糖37℃220rpm摇床诱导cas9表达，诱导培养13小时，得到诱导培养液；将所得诱导培养液按1％(体积比)的接菌量转接至5mllb液体培养基中，相同条件再重复诱导1代，得到培养产物。将所得培养产物稀释10⁵倍后涂于绵羊血平板(thermofisherscientific)后，放置在30℃培养箱中培养，18h后观察挑取无溶血环的单克隆即为阳性候选菌株pjhrt/hn1m(表2；图3中a)。

挑取三个阳性候选菌株pjhrt/hn1m(图3中a箭头所示三个单克隆)，以蜡样芽胞杆菌目的dna序列设计引物prhm-f/r进行pcr扩增(表1；图3中b)，将得到的扩增片段送商业公司测序(北京天一辉远生物科技有限公司)，结果显示这些菌株的目的dna阅读框的640位核苷酸均由g突变为t(图3中c)。

将阳性候选菌株pjhrt/hn1m接种于5ml无抗lb液体培养基中，37℃传代驱除温敏性质粒pjhrt，对得到的菌液进行梯度稀释，涂布无抗平板。放置在30℃培养箱中培养，次日挑取平板上的单克隆进行点板，每一个单克隆分别点板于lb无抗板和lb(含25μg/mlkan)琼脂平板，将点板后的平板置于30℃培养箱中培养。次日，挑取三个在无抗性平板上生长而在kan(含25μg/mlkan)抗性琼脂平板上不生长的单克隆使用引物pjoe8999-f/r进行pcr(表1)，利用pjhrt作为阳性对照，验证pjhrt已被驱除，将驱除了pjhrt的菌株命名为hn1m(表2；图4)，该菌株即为将蜡样芽胞杆菌hn001的目的dna阅读框的640位核苷酸g突变为t得到的菌株。

三、hn1m溶血活性和卵磷脂酶活性检测

待测菌株：步骤二得到的hn1m三个克隆，蜡样芽胞杆菌hn001(阳性对照)，炭疽芽胞杆菌a16pi2(阴性对照)(wangh,liux,fenge,zhul,wangd,liaox,wangh.curingtheplasmidpxo2frombacillusanthracisa16usingplasmidincompatibility.currmicrobiol,2011,62(3):703-709.)。

挑稍许待测菌株制成菌悬液，涂于绵羊血平板(thermofisherscientific)后，放置在30℃培养箱中培养，18h后观察菌株的生长情况(表2；图5中a，图6中a)。

在250ml固体lb培养基中加入1瓶(5ml)50％卵黄乳液(北京奥博星生物技术有限责任公司)得到卵磷脂平板。挑稍许待测菌株制成菌悬液，将灭过菌的滤纸片贴在卵黄平板上，吸取5μl菌悬液分别滴在滤纸片上，晾干后倒置放在30℃恒温箱培养18h，观察并拍照(图5中b，图6中b)。

结果显示：蜡样芽胞杆菌hn1m溶血活性大幅度减弱(hn001和hn1m的溶血环半径分别为0.57±0.013cm和0.24±0.012cm)，卵磷脂酶活性完全丢失(hn001和hn1m的磷脂环半径分别为0.54±0.026cm和0cm)，且挑选的三个独立克隆表型一致，该结果稳定可重复。

表1.本发明中使用的寡核苷酸序列及引物

表2.本发明中使用的菌株及获得的菌株

<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120>溶血活性和磷脂酶活性降低蜡样芽胞杆菌的制备

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1291

<212>dna

<213>蜡样芽胞杆菌（bacillus.cereus）

<400>1

atgcacgcagaaaaattaggaagtgaaattaagaaaattagggtgatgagaggattaaca60

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<212>dna

<213>人工序列

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