本发明属于医药技术领域，具体地说，是mir-184在自然流产预警作用中的应用。
背景技术：
成功妊娠是一个极其复杂的生理过程，作为胚胎和母体直接接触的前沿，母-胎界面的正常生物学功能是维持成功妊娠的关键，近年来母-胎界面的免疫调节机制及如何维持成功妊娠一直是生殖免疫学的研究热点。早孕期母-胎界面发生了一系列变化，主要包括子宫内膜蜕膜化、滋养细胞发育和胎盘形成以及母胎交互对话，这些事件主要以细胞为载体，同时以局部分泌的细胞因子和细胞外基质为媒介，从而构成一个复杂的相互作用网络，调控妊娠的进展。胚胎来源的滋养细胞(trophoblast)和母体的蜕膜共同组成了母-胎界面。同时，滋养细胞也是人类胎盘的主要构成细胞，其不仅能调控自身的增殖和侵袭，还能通过表面的一些分子作用于母体的免疫活性细胞，进而参与母-胎免疫耐受形成。母体蜕膜组织的细胞成份比较复杂，以蜕膜基质细胞(dsc)最多，占75％，其次为蜕膜免疫细胞(dic)，占15％。蜕膜基质细胞一方面为蜕膜提供所需营养，另一方面又能通过分泌一些激素和细胞因子参与调节蜕膜局部微环境，进而利于维持正常妊娠。蜕膜免疫细胞的组成不同于外周，其50-70％为cd56brightcd16-nk细胞，近20％的为巨噬细胞
反复自然流产(recurrentspontaneousabortion，rsa)是妇产科常见的病理妊娠之一,严重威胁着人类的生殖健康。其病因主要包括染色体异常、母体生殖道异常、母体内分泌异常、免疫功能异常、生殖道感染、宫颈机能不全及血栓形成倾向等，但是有50％反复自然流产患者，使用目前临床的诊断方法尚不能发现导致流产反复发生的病因，且疗效不理想，称为不明原因反复自然流产(unexplainedrecurrentspontaneousabortion)，是临床上疑难性的不育症。因此，探讨其可能的致病因素能为反复自然流产的临床诊断和治疗提供一些新思路和新方法。
microrna是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链rna分子，在多种生物学过程中具有重要的作用。至今已在人细胞中发现2000多种microrna，这些microrna调节了将近人体1/3的基因，已然成为人类最大的调节基因群。根据与目的基因互补的程度，microrna主要以两种方式下调目的基因的表达：一是当与目的靶基因完全互补时，以sirna相同的方式降解靶基因mrna；另一种即与靶基因的3’utr结合，在不改变靶基因mrna表达水平的情况下，抑制其翻译。研究表明反复自然流产的发生与microrna表达异常密切相关。例如，hla-g基因在母胎界面的表达对母胎免疫耐受和维持正常妊娠有着重要的作用，而mir-133a可以通过下调人类白细胞抗原hla-g基因调节反复自然流产。并且一些microrna还可以通过其自身的多态性(mir-146ac>g，mir-149t>c，mir-196a2t>c，andmir-499a>g)影响反复自然流产的发生。mir-184是一个短的非编码单链rna分子，在哺乳动物中，其主要表达在大脑、睾丸及角膜上皮中。现已发现mir-184与神经发育、凋亡及发育等功能密切相关。有研究表明，mir-184在法令综合征、家族性圆锥角膜、缺血诱导的视网膜新生血管形成、rett综合征及一些肿瘤(如，肿瘤舌鳞状细胞癌、神经母细胞瘤)中具有一定的调控作用。
基于现有技术的现状，本发明拟通过实验研究母胎界面mir-184过表达在反复自然流产中的作用，提供又一个建立自然流产模型的方法，同时评估mir-184作为评估自然流产发生风险的可行性，为临床上自然流产的诊断和治疗提供新靶点和新思路。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供mir-184或其检测试剂的用途。
本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供一种建立自然流产动物模型的方法。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
mir-184或其检测试剂的用途，用于制备判断反复自然流产的试剂盒。
作为本发明的一个优选实施方案，所述检测试剂包括引物、反义核酸、探针或芯片。
作为本发明的一个优选实施方案，所述检测是指外周血检测。
作为本发明的一个优选实施方案，所述检测的对象为孕早期孕妇。
进一步，本发明的试剂盒通过检测受试者外周血中mir-184的表达水平对受试者自然流产风险进行早期诊断。
进一步，将受试者外周血mir-184的表达水平与正常妊娠妇女的进行比较，若受试者mir-184水平显著增高，则提示所述受试者患有反复自然流产。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种建立自然流产动物模型的方法，包括对建模动物静脉注射mir-184-3pagomir的步骤。
作为本发明的一个优选实施方案，所述建模动物为balb/c雌性小鼠。
作为本发明的一个优选实施方案，所述mir-184-3pagomir注射剂量为15nmol。
本发明通过microrna芯片分析发现mir-184在反复自然流产患者的绒毛和蜕膜组织中均高表达，并且反复自然流产患者的外周血中mir-184的表达水平也升高，进一步体外研究发现mir-184表达增加可以促进滋养细胞凋亡，体内实验发现小鼠体内mir-184过表达后孕鼠胚胎吸收率增加。这提示静脉注射mir-184-3pagomir可以使小鼠体内mir-184过表达，进而诱导自然流产的发生，该发现为临床上反复自然流产的诊断和治疗提供了新方法。
本发明对正常妊娠妇女和反复自然流产患者的绒毛和蜕膜组织进行microrna芯片分析，结果发现mir-184在反复自然流产患者的绒毛和蜕膜组织中均高表达(如图1所示)。检测正常妊娠妇女和反复自然流产患者的外周血发现，mir-184在反复自然流产患者的外周血中表达也升高(如图2所示)。滋养细胞系htr8过表达mir-184后细胞凋亡增加(如图3所示)。之后经静脉给小鼠注射mir-184的激动剂agomir，使小鼠体内mir-184过表达，结果证实mir-184在小鼠的外周血及孕鼠的子宫中高表达(如图4所示)，待小鼠孕11天观察胚胎吸收率发现，mir-184过表达可以增加小鼠的胚胎吸收率(如图5所示)。
本发明从体内体外实验均说明了mir-184高表达可以导致自然流产的发生，从而为自然流产模型的建立提供了一种新的方法；并且通过检测早孕期外周血中mir-184可以评估自然流产的风险，这就为临床上反复自然流产的诊疗提供了一种新策略。
附图说明
附图1是正常妊娠妇女和反复自然流产患者的绒毛和蜕膜组织中mir-184的表达。其中，lr：反复自然流产患者的绒毛组织；zr：正常妊娠妇女的绒毛组织；lt：反复自然流产患者的蜕膜组织；zt：正常妊娠妇女的蜕膜组织；villi：早孕绒毛组织；deciduas：早孕蜕膜组织；normal：正常妊娠；abortion：反复自然流产。***p<0.001，ns：无显著差异。
附图2是正常妊娠妇女和反复自然流产患者的外周血中mir-184的表达。其中，normal：正常妊娠；abortion：反复自然流产；peripheralblood：外周静脉血。*p<0.05。
附图3是mir-184过表达促进htr8细胞凋亡。其中，nc：感染阴性对照(negativecontrol)病毒的htr8细胞；mir-184：感染mir-184过表达病毒的htr8细胞。*p<0.05，****p<0.0001。
附图4是小鼠体内过表达mir-184。其中，negativecontrol：静脉注射阴性对照(negativecontrol)的小鼠；mir-184-3pagomir：静脉注射mir-184-3pagomir的小鼠；peripheralblood：小鼠外周静脉血；uterus：孕鼠子宫。**p<0.01，****p<0.0001。
附图5是注射mir-184-3pagomir的小鼠胚胎吸收率增加。其中，negativecontrol：静脉注射阴性对照(negativecontrol)的小鼠；mir-184-3pagomir：静脉注射mir-184-3pagomir的小鼠；吸收胚胎常伴有缺血、出血、坏死，体积会明显小于正常存活胚胎，并且从胚胎的色泽来看，吸收胚胎呈黑褐色(黑色箭头所示)，存活胚胎则呈粉红色。据此统计存活胚胎数和吸收胚胎数。按照胚胎个数/(存活胚胎个数+死亡胚胎个数)计算小鼠胚胎吸收率，ns：无显著差异，*p<0.05。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1分析正常妊娠妇女和反复自然流产患者的绒毛和蜕膜组织中mir-184的表达
分别收集正常妊娠妇女和反复自然流产患者的绒毛和蜕膜组织进行microrna芯片分析(博奥生物有限公司)，利用sam程序包按照q-value≤5％且foldchange≥5或≤0.2的标准筛选差异基因，结果发现反复自然流产患者的绒毛组织中mir-125b-2、mir-187、mir-184特异性高表达，mir-4672、mir-3175、mir-520f特异性低表达(图1a)，而反复自然流产患者的蜕膜组织中mir-520h、mir-517c、mir-519a-1//mir-519a-2、mir-522、mir-184特异性高表达(图1b)。可以看出mir-184在反复自然流产患者的绒毛和蜕膜组织中均特异性高表达。rt-pcr结果表明反复自然流产患者的绒毛组织中mir-184的表达比正常妊娠的高(图1c)，但由于个体差异的存在，反复自然流产患者的蜕膜组织中mir-184的表达与正常妊娠相比有升高的趋势但没有显著的统计差异(图1d)。
实施例2分析正常妊娠妇女和反复自然流产患者的外周血中mir-184的表达
同时，收集正常妊娠妇女和反复自然流产患者的外周静脉血检测mir-184的表达水平(上海其明信息技术有限公司)，结果发现mir-184在反复自然流产患者的外周血中表达同样升高(图2)。
实施例3mir-184过表达可以促进滋养细胞凋亡
利用带gfp荧光蛋白的阴性对照慢病毒及mir-184过表达慢病毒(购于苏州吉玛基因股份有限公司)感染人滋养细胞系htr8细胞，构建mir-184过表达的htr8细胞(图3a-b)，通过annexinv染色检测细胞凋亡(annexinv凋亡试剂盒购自biolgend公司)，结果发现mir-184过表达可以促进htr8细胞的凋亡(图3c)。
实施例4mir-184过表达小鼠模型的建立
给balb/c雌鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)分别静脉注射negativecontrol和mir-184的激动剂mir-184-3pagomir(购自锐博生物)，每三天一次，结果显示与注射negativecontrol的对照组相比，注射mir-184-3pagomir之后小鼠外周血中mir-184的表达升高(图4a)，并且注射mir-184-3pagomir之后孕鼠子宫mir-184的表达水平也增加了(图4b)，表明mir-184过表达小鼠模型构建成功。
实施例5小鼠体内mir-184过表达显著促进胚胎吸收
将静脉给药的balb/c雌鼠与balb/c雄鼠合笼，每天观察雌鼠的阴栓情况并判断其孕龄。孕11天观察胚胎吸收情况，统计胚胎吸收率，结果可见当注射剂量为5nmol时，虽然mir-184过表达小鼠的胚胎吸收率跟对照组相比有上升的趋势，但是没有显著差异；而加大给药剂量到15nmol时，mir-184过表达小鼠的胚胎吸收率显著高于对照组(图5)。
本发明通过体内体外实验证实mir-184过表达可以导致自然流产的发生，从而为自然流产模型的建立提供了一种新的方法；同时mir-184在自然流产患者的外周血中表达增加，这就为临床上反复自然流产的风险评估提供了一种新策略。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。