一种立克次氏体巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法与流程

本发明具体涉及生物学技术领域，具体涉及一种立克次氏体巢式pcr特异性引物及检测试剂盒与巢式pcr检测方法。

背景技术：

立克次氏体是一类依赖于宿主细胞和专性细胞内寄生的小型革兰氏阴性原核单细胞微生物，介于细菌和病毒之间，较接近于细菌。由立克次氏体引起的疾病统称立克次氏体病，是一种人畜共患的自然疫源性疾病，人被感染立克次氏体的媒介昆虫叮咬或接触其粪便可被感染。该病在历史上曾经严重威胁人类健康，造成灾难，目前已成为世界性关注的疾病。人类立克次氏体病的传染源主要是感染的家畜，特别是牛和羊。在动物之间，该病原体以蜱为传播媒介进行传播并可以经卵传代，从而形成自然疫源地。动物感染立克次氏体后多呈亚临床经过，但绵羊和山羊有时出现食欲不振，体质量下降，产奶量减少和流产、死胎等现象；牛可出现不育和散在性流产。立克次氏体的临床诊断主要的方法是直接镜检、血清学诊断(酶联免疫吸附实验和间接免疫荧光试验)、常规pcr检测及病原分离等。直接镜检只能用于对发病动物的检测，但对疫病普查和进出口检疫则有困难。血清学诊断主要是间接免疫荧光分析，但是此方法敏感性不高。敏感性更高的方法，例如常规pcr检测技术也是诊断寄生在蜱体内的立克次氏体最常用的方法，但是该方法具有很大的一个缺点一低特异性和低敏感性，扩增时容易产生假阳性、蜱虫体内立克次氏体含量较低时容易漏检。巢式pcr使用两套引物通过两轮pcr反应扩增靶基因dna片段，第一对pcr引物扩增片段和普通pcr相似，第二对引物结合在第一次pcr产物内部，反应特异性强、敏感性高。巢式pcr检测技术已广泛应用于病原体检测。

技术实现要素：

为了解决现有技术的缺陷及不足本发明提供了了一种立克次氏体巢式pcr特异性引物及检测试剂盒与巢式pcr检测方法，建立一种精准、高效、实用的dna检测方法。针对立克次氏体的pcs20为靶基因的特异性区域，设计4条特异性引物，提供了一种立克次氏体的巢式pcr特异性引物及检测试剂盒与巢式pcr检测方法，可用于立克次氏体病精准检测，应用前景广阔，该方法可用于双芽巴贝斯虫病流行病学调查及快速检测。

本发明采用的技术解决方案是：一种立克次氏体巢式pcr特异性引物，包括设计的两对特异性引物，具体为：

外引物ef1∶5′-ttt-ccc-tat-gat-aca-gaa-ggt-aac-3′；

内引物er1：5′-aaa-gca-agg-att-gtg-atc-tgg-acc-3′；

外引物ef2：5′-act-agt-aga-aat-tgc-aca-atc-tat-3′；

内引物er2：5′-tga-taa-ctt-ggt-gcg-gga-aat-cct-t-3″。

一种立克次氏体巢式pcr检测试剂盒，所述的巢式pcr检测试剂盒包括以下组分：

(一)权利要求1所述的两对特异性引物；

(二)阳性对照：所述的阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，该质粒含立克次氏体993bp基因片段；

(三)阴性对照：所述的阴性对照为去离子水；

(四)taq酶。

所述的阳性对照通过将扩增产物克隆至pucm-t转化dh5-α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得为阳性重组质粒的阳性对照。

一种立克次氏体巢式pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)被检标本dna提取：取花蜱数只，酒精清洗，每只蜱放入单独的1.5mlepdof管，200μlpbs液浸没蜱，用样品破碎仪破碎蜱的虫体，吸取破碎后的溶液，加入trizol试剂裂解，采用常规的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶解，-20℃保存备用；

(2)以权利要求1中的外引物ef1、er1扩增：在epdof管中加入处理后的蜱标本dna，同时设阴、阳性对照，10×pcrbuffer，mgcl2，dntp，taq酶，25pmol/μlef1，25pmol/μler1，dna模板，ddh2o混匀后稍离心的50μl反应体系中进行第一轮pcr；

(3)以权利要求1中的内引物ef2、er2扩增：以第一轮pcr产物dna为模板，以ef2、er2为第二套引物，在10×pcrbuffer5μl，mgcl22μl，dntp4μl，taq酶0.5μl，25pmol/μlef21μl，25pmol/μler21μl，dna模板2μl，ddh2o34.5μl混匀后稍离心的50μl反应体系进行第二轮pcr；

(4)pcr产物鉴定：取第二轮pcr产物2μl进行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定；

(5)测序：将第二轮pcr产物送测序公司进行序列测定。

所述的步骤(2)中的第一轮pcr反应条件为：

94℃预热5min；

94℃保持1min，55℃保持1min，72℃保持2min，该步骤进行共30个循环；

末次延伸至72℃，保持10min。

所述的步骤(2)中的第二轮pcr反应条件为：

94℃预热5min；

94℃保持1min，55℃保持1min，72℃保持2min，该步骤进行共30个循环；

末次延伸至72℃，保持10min。

所述的步骤(2)中第一轮pcr50μl反应体系中蜱样品基因组dna模板量为5μl，10×pcrbuffer为5μl，mgcl2为2μl，dntp为4μl，taq酶为0.5μl，25pmol/μlef1为1μl，25pmol/μler1为1μl，ddh2o为31.5μl。

所述的步骤(4)中第二轮pcr50μl反应体系中第一轮pcr产物dna模板量为2μl，10×pcrbuffer为5μl，mgcl2为2μl，dntp为4μl，taq酶为0.5μl，25pmol/μlef21μl，25pmol/μler2为1μl，ddh2o为34.5μl。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种立克次氏体巢式pcr特异性引物及检测试剂盒与巢式pcr检测方法，本方法的模板dna制备步骤简单费用低，本方法检测非常方便快捷，并能提高检测方法的特异性及敏感性，单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组dna即可作为模板进行鉴定，针对立克次氏体的pcs20为靶基因的特异性区域，设计4条特异性引物，解决了现有pcr检测技术低特异性和低敏感性，扩增时容易产生假阳性、蜱虫体内立克次氏体含量较低时容易漏检的缺陷，本发明方法反应特异性更强、敏感性更高，该方法专用于立克次氏体精准检测，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明方法对pcs20基因第一轮(由外引物扩增)pcr和第二轮(由内引物扩增)pcr产物的凝胶电泳图，其中1为ef1和er1pcr扩增结果；2为ef2和er2pcr扩增结果。

图2为巢式pcr敏感性试验结果。

图3为巢式pcr特异性试验结果。

基因序列表为pcs20基因巢式pcr产物的测序结果，共277bp。

具体实施方式

设置巢式pcr检测试剂盒，该试剂盒包括：

(1)epdof管：反应管内含10×pcrbuffer、脱氧核糖核苷三磷酸(dntp)、氯化镁(mgcl2)。

(2)引物f1、引物r1、引物f2、引物r2。引物f1、引物r1、引物f2、引物r2分别是按下述碱基序列由dna合成仪合成的dna片段：

外引物ef1：5′-ttt-ccc-tat-gat-aca-gaa-ggt-aac-3′；

内引物er1：5′-aaa-gca-agg-att-gtg-atc-tgg-acc-3′；

外引物ef2：5′-act-agt-aga-aat-tgc-aca-atc-tat-3′；

内引物er2：5′-tga-taa-ctt-ggt-gcg-gga-aat-cct-t-3″。

(3)阳性对照：该对照为含有目的基因片段的重组质粒，由本实验室构建。其方法是：将扩增产物克隆至pucm-t转化dh5-α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得阳性重组质粒，该质粒含立克次氏体993bp基因片段。

(4)阴性对照，该对照为去离子水(ddh2o)；

(5)taq酶。

操作程序：

(1)被检标本dna提取：取蜱虫数只，75％的酒精清洗，每只蜱虫放入单独的1.5mlepdof管，200μlddh2o液浸没蜱，用样品破碎仪破碎蜱的虫体，吸取破碎后的溶液，加入trizol试剂裂解，采用常规的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(tris-edtate)溶解，-20℃保存备用；

(2)外引物ef1、er1扩增：在epdof管中加入处理后的标本dna，同时设阴、阳性对照，50μl反应体系为：10×pcrbuffer5μl，mgcl2(25mm)2μl，dntp(2.5mm)4μl，taq酶(5u/μl)0.5μl，25pmol/μlef11μl，25pmol/μler11μl，dna模板5μl，ddh2o31.5μl，混匀后稍离心。

扩增条件为：

(3)内引物ef2、er2扩增：以第一轮pcr产物dna为模板(1μl)，以ef2、er2为第二套引物，50μl反应体系为：10×pcrbuffer5μl，mgcl2(25mm)2μl，dntp(2.5mm)4μl，taq酶(5u/μl)0.5μl，25pmol/μlf21μl，25pmol/μlr21μl，dna模板2μl，ddh2o34.5μl，混匀后稍离心。

扩增条件为：

(4)pcr产物鉴定

取第二轮pcr产物5μl进行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

(5)测序

将第二轮pcr产物送测序公司进行序列测定。

(6)立克次氏体的核酸浓度为1.1×10⁹copies/μl。将100倍稀释后的立克次氏体核酸模板进行10倍倍比稀释，单独使用ef1和er1引物进行常规pcr扩增；按照优化好的反应条件，以第1轮pcr产物为模板，使用ef2和er2引物进行巢式pcr扩增，灭菌去离子水作为阴性对照。经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析巢式pcr的敏感性，结果如图2所示，证明本发明专利对立克次氏体具有很高的敏感性。

(7)用本发明建立的巢式pcr检测方法对立克次氏体、双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、牛环形泰勒虫和弓形虫的基因组dna样品进行检测，灭菌去离子水作为阴性对照，检验此方法的特异性，结果如图3所示，证明本发明专利对立克次氏体具有很强的特异性。

本发明提供了一种立克次氏体巢式pcr特异性引物及检测试剂盒与巢式pcr检测方法，可快速、准确地检测出被检标本中的立克次氏体，也可用于立克次氏体的分子流行病学调查及疗效监测。本方法的模板dna制备步骤简单费用低，常规的方法需经溶菌酶、蛋白酶k、sds(十二烷基硫酸钠)、ctab(十六烷基三甲基溴化胺)等试剂处理，时间长费用高。本方法检测非常方便快捷，并能提高检测方法的特异性及敏感性。内侧引物扩增的模版是外侧引物扩增的产物，第二阶段反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定，保证了整改反应的准确性和可行性，建立的巢式pcr检测方法可满足临床检测的需要，应用前景广阔。

现有的技术中，血涂片镜检技术仍是诊断立克次氏体病最常用的方法，但该方法不能应用于外周血内病原体含量很低的动物。而采集牛体表寄生的蜱虫，通过提取蜱的dna，利用设计的立克次氏体外引物和内引物，巢式pcr扩增目的基因，可以准确、快速的判断牛是否感染了立克次氏体。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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<110>王素华，帅江冰，张晓勇，吕继洲，袁淑辉，张晓峰，吴绍强

<120>一种立克次氏体巢式pcr特异性引物及检测试剂盒与巢式pcr检测方法

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