人乳腺癌细胞系及应用的制作方法

本发明属于微生物动物细胞系领域，具体涉及人乳腺癌细胞系及应用。

背景技术：

乳腺癌是世界上女性最常见的恶性肿瘤之一。在我国，乳腺癌的发病率有逐步上升的趋势，在一些沿海经济发达地区，乳腺癌的发病率已占妇女恶性肿瘤的首位。乳腺癌是一类具有高度异质性的恶性肿瘤，经过数十年的科学研究技术的发展，通过采用基因微阵列技术可将其分为5个亚型：导管a型、导管b型、基底细胞样、her2过表达型和正常乳腺样型，促进了临床乳腺癌患者的治疗效果显著提高，减少了患者在治疗疾病过程中所承受的身体和精神痛苦。

在过去的几十年间，数个病理和免疫组化亚分类的提出，有利于促进区分临床水平荷尔蒙受体和三阴性乳腺癌的广度和异质性特征。然而，这些分类不涉及对临床上her2+乳腺癌分类。her2+是指er-，pr-而her2为阳性者，在所有乳腺癌患者中占20％-25％。和其他类型乳腺癌相比，该类型组织学分级差，易复发和转移，预后性差。尽管赫赛汀药物在一定程度上对her2+的病人生存有效，但是还是出现大约15％her2+的早期病人和70％以上转移her2+病人表现出对该药物的耐受，该类型耐受的乳腺癌中往往病理表现为基底样型(basal-like)乳腺癌。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于，针对目前国内缺乏中国人群来源的basal/her2-positive乳腺癌细胞株，而提供了该类型的来源于中国人群乳腺癌细胞系。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

人乳腺癌细胞系，包括：分别命名为人乳腺癌her2+/basal细胞系zju-0327、zju-0725和zju-1127，且保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏编号分别为：cctccno:c2017171、cctccno:c2017172和cctccno:c2017173的人乳腺癌细胞系。

在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用以下进一步的技术方案：

优选地，所述人乳腺癌细胞系还包括：分别命名为人乳腺癌her2+/basal细胞系zju-0327、zju-0725和zju-1127，且保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏编号分别为：cctccno:c2017171、cctccno:c2017172和cctccno:c2017173的人乳腺癌细胞系的子代细胞系。

优选地，所述人乳腺癌细胞系在体外培养时，光镜下为典型的多边形上皮样细胞，电镜下为典型的恶性上皮特征；核型分析结果为亚三倍体核型，主流染色体数目为78-85。

优选地，所述人乳腺癌细胞系在乳腺癌临床诊断时具有浸润性乳腺癌特性，特征鉴定表型为basal/her2-positive。

优选地，所述人乳腺癌细胞系在对tp53突变基因的11个外显子进行测序下，外显子4的第72位编码子发生单核苷酸的多态性突变，外显子5的第126位编码子发生错义突变。

优选地，所述人乳腺癌细胞系在支原体检测试剂盒检测时，pcr结果为阴性，均未收到支原体污染。

本发明的第二个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供人乳腺癌细胞系的应用。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

根据前面所述人乳腺癌细胞系在her/basal的乳腺癌发病机制研究的细胞模型中的应用。

本发明还有一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种人乳腺癌细胞系的用途。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种人乳腺癌细胞系的用途，根据前面所述人乳腺细胞系用于制备在免疫缺陷哺乳动物中产生乳腺癌的模型，成瘤率为100％。

在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用以下进一步的技术方案：

优选地，所述免疫缺陷哺乳动物为免疫缺陷裸小鼠。

本发明的人乳腺癌细胞系zju-0725和zju-1127从一例浸润性导管癌乳腺癌65岁女性患者(er⁺,pr^—,her⁺)和zju-0327从另一例浸润性导管乳腺癌63岁女性患者(er⁺,pr⁺,her⁺)手术切除后的肿瘤标本组织。经原代培养并建系成功后，分别命名为人乳腺癌her2+/basal细胞系zju-0327、zju-0725和zju-1127。

本发明的人乳腺癌her2+/basal细胞系zju-0327、zju-0725和zju-1127细胞生长旺盛，细胞多呈扁平不规则多边形贴壁单层生长，胞浆内常可见空泡；ck-pan阳性率分别约在98.69％、98.2％和98.93；细胞经过冻存复苏后仍具有良好的活力；上述细胞系目前已传代至100代左右，生长状态良好，已能永生化。

本发明的人乳腺癌her2+/basal细胞系zju-0327、zju-0725和zju-1127细胞，细胞倍增时间分别为18.7h、57.5h和18.8h；染色体数目和结构均出现异常，染色体数目大多分布在78-85之间，结构异常包括染色体增加、缺失和易位等；gimesa染色显示细胞核分裂相明显活跃，胞核大，核浆比例增大，可见巨核细胞；电镜下有典型上皮特征，可见桥粒、微丝、丰富细胞器(线粒体、核糖体及粗面内质网)和核质比大。

本发明的人乳腺癌细胞系采用目前最权威的检测方法为atcc推荐的str检测法，检测结果确定三个人乳腺癌细胞系均是人源的，且发现zju-0725和zju-1127有相同的结果，而与zju-0327不同；与atcc和dsmz两个全球最著名的培养物保藏机构中的细胞遗传信息进行比对，发现均未受到其他细胞污染。

本发明的人乳腺癌细胞系对tp53抑癌基因进行检测，发现突变均发生外显子4和5，抑癌基因tp53测序发现均在外显子4的第72位编码子的出现了c→g的点突变，导致了原先编码的脯氨酸(pro)变为精氨酸(arg)，为非致病性突变，属于单核苷酸多态性；外显子5第126位编码子出现了t→a的点突变，导致了原先编码的酪氨酸(try)变为天冬酰胺(asn)，为致病性错义突变。

本发明的人乳腺癌细胞系经免疫蛋白印迹法(westernblot)鉴定乳腺癌表型相关蛋白和预后相关蛋白表达分析，与现有已建立的细胞系进行对比，发现所建立的细胞系属于basal/her2-positive类别。

放疗评估人乳腺癌细胞系的活性：不同剂量辐照用于zju-0725和zju-1127，施用后zju-0725与已报道的sk-br3(basal/her2-positive)均对放疗敏感而zju-1127不敏感，其中所述的细胞模型是zju-0725和zju-1127两株细胞系。

化疗药处理zju-0725和zju-1127：施用后显示只有多西他奇(docetaxel)和盐酸表柔比星(epirubicinhcl)能有效抑制zju-0725，而对zju-1127基本无效；而卡铂(carboplatin)、环磷酰胺(cyclophosphamidemonohydrate)、紫杉醇(paclitaxel)和5-氟尿嘧啶(5-fu)则对两株乳腺癌细胞系均无显著抑制效果。

本发明的人乳腺癌细胞系成瘤实验结果发现，所建立的细胞系在裸鼠体内均具有良好的体外成瘤性。通过将一定数量的上述人原代乳腺癌细胞系zju-0327、zju-0725和zju-1127细胞接种于裸小鼠的皮下，建立了乳腺癌的动物模型。

本发明有提供了所述的乳腺癌细胞系的子代细胞，所述的子代细胞基本或全部保留了亲代细胞的特性。

本发明又提供了所述的人乳腺癌细胞系在作为乳腺癌发生机理研究的细胞模型中的应用。由于本发明的人乳腺癌her2+/basal细胞系zju-0327、zju-0725和zju-1127是从中国人来源建立的，且建系时间较短，生物遗传性状稳定，以该乳腺癌细胞系作为研究模型，对于了解中国人群的原发性乳腺癌basal/her2-positive表型的发病机制有很大帮助。

再一方面，本发明提供了一种从一例乳腺癌样本组织中建立两种不同形态的乳腺癌细胞系的制备方法，包括以下步骤：

(1)标本采集及保存的方法：确定肿块在切除的乳腺组织中的位置，肿瘤组织取自瘤体增生活跃的表层部分。标本的采集均在病理科医师指导下进行，防止对病理报告的诊断产生影响；当标本暂不做后续操作时，可将其保存在4℃rpmi1640中，一般可放置24h左右。

(2)原代培养：组织经pbs洗涤三次，机械剪碎，胶原酶消化，离心及洗涤，接种及传代培养和观察培养。

(3)纯化细胞：采取有限稀释法，具体为待传代几次后，将细胞按照1:6或更高倍数传代至培养皿中培养，镜下观察并标记上皮特征的细胞团，无菌条件下刮除其周围细胞，pbs洗涤三次，加入新培养基继续培养至长出肉眼可见斑块。

(4)扩大培养：胰酶消化细胞团，离心收集细胞后接种至96孔板，随后依次接种至48孔板、24孔板、12孔板、6孔板和t-25培养瓶中。

附图说明

图1为人乳腺癌her2+/basal细胞系zju-0328、zju-0725和zju-1127细胞的光学显微镜图；

图2为人乳腺癌her2+/basal细胞系zju-0328、zju-0725和zju-1127细胞的透射电镜图；

图3为人乳腺癌her2+/basal细胞系zju-0327、zju-0725和zju-1127细胞的流式鉴定结果图；

图4为人乳腺癌her2+/basal细胞系zju-0327、zju-0725和zju-1127细胞的细胞周期分布图(a-e)、统计图(f)和生长曲线图(g-i)；

图5为人乳腺癌her2+/basal细胞系zju-0327、zju-0725和zju-1127细胞的表型分析图(a)、支原体检测琼脂糖电泳图(b)、放疗敏感检测统计图(c)和化疗敏感统计图(d)；

图6为人乳腺癌her2+/basal细胞系zju-0327、zju-0725和zju-1127细胞的成瘤试验结果；

图7为人乳腺癌her2+/basal细胞系zju-0327、zju-0725和zju-1127细胞的tp53突变检测结果；

图8为人乳腺癌her2+/basal细胞系zju-0327、zju-0725和zju-1127细胞的代表性单细胞的核型分析。

具体实施方式

参照附图和具体实施例对本发明作进一步详细地描述。

实施例1

从一例浸润性导管癌乳腺癌65岁女性患者(er⁺,pr^-,her⁺)和另一例浸润性导管癌乳腺癌63岁(er⁺,pr⁺,her⁺)手术切除后的原位肿瘤组织中取样，剔除坏死和脂肪等组织，用含双抗的生理盐水洗3次。将组织置入无菌培养皿中，组织块表面滴加少许胶原酶消化液，用不同的无菌眼科小剪刀充分剪碎至体积约1-2mm³大小；将剪碎的肿瘤组织用胶原酶消化液收集后置于15ml离心管中，加入一定量的消化液，并放入37℃co2培养箱中消化过夜；消化过夜的标本组织及细胞悬液离心(300×g，7min)，弃去上清，再用生理盐水洗涤离心3次；rpmi1640+10％fbs+双抗重悬沉淀置于培养皿中，置入37℃co2培养箱培养，至少2天内不要移动培养皿，利于原代肿瘤细胞贴壁；待细胞在皿中长至70-80％时传代至6个10mm培养皿中，每日镜下观察，待观察到镜下细胞为卵圆形、片状分布细胞团时，刮除周围成纤维细胞，生理盐水洗3次，加入新的培养基继续培养；待细胞团块长至肉眼可见时，胰酶消化液消化细胞传至96孔板中，之后依次传至48孔板、24孔板、12孔板、6孔板和t-25培养瓶中。建系成功后，分别命名为人乳腺癌her2+/basal细胞系zju-0327，zju-0725和zju-1127，于2017年9月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏编号分别为：cctccno:c2017171、cctccno:c2017172和cctccno:c2017173。

实施例2

取传代培养的乳腺癌细胞系zju-0327、zju-0725和zju-1127细胞，在光学显微镜下(niko倒置显微镜)观察细胞生长情况。

giemsa显带：

①预处理：将制好的中期染色体标本玻片置入60-80℃烤箱中烤片3h；

②胰酶消化：将标本置入37℃的0.025％胰酶溶液(把0.25％胰蛋白酶用pbs稀释10倍)中消化1min后pbs洗涤玻片；

③giemsa染色：将标本置入giemsa染液中染色10min，自来水冲洗干净，晾干后封片。

镜检：在显微镜高倍目镜下检查显带标本，在染色体上若出现清晰的深浅相间的带型，即为可取标本，可供摄像分析。

如图1(j-l)zju-0327，zju-0725和zju-1127核质比大且时常有多核巨细胞出现。

如图1所示，细胞学形态图片，细胞折射性好，细胞生长状态良好，背景清晰，细胞多呈扁平不规则多边形，胞浆内常可见空泡和多核细胞，核质比大，无成纤维细胞污染。图1为zju-0327，zju-0725和zju-1127细胞相差显微镜下的图片及gimesa染色。图中a-c为肿瘤单细胞悬液直接培养48后的贴壁细胞；d-i为第72代乳腺癌原代细胞形态；j-l为gimesa染色后的细胞形态。

实施例3

样品准备：将1×10⁷个培养的zju-0327、zju-0725和zju-1127细胞胰酶消化后收集于15ml离心管中，离心收集细胞后再次洗涤离心收集；

固定：向细胞中加入2.5％戊二醛固定液固定2h，0.1m磷酸缓冲液洗涤3次，加入1％饿酸固定液固定2h，0.1m磷酸缓冲液洗涤3次；

脱水：在4℃冰箱内进行分别50％乙醇→→70％乙醇→→90％乙醇→→90％乙醇+90％丙酮(1:1)→→90％丙酮→→100％丙酮(3次)，每道工序维持15-20min；

包埋：纯丙酮+包埋液(2:1)室温3-4h→→纯丙酮+包埋液(1:2)室温过夜→→纯包埋液37℃2-3h；

固化：37℃烘箱过夜→→45℃烘箱12h→→60℃烘箱24h；

超薄切片制备：用超薄切片机切取50-60nm厚度切片；

染色：3％醋酸铀-枸橼酸铅双重染色；

观察拍片：用透射电镜(日立ht7700)观察及拍片。

结果如图2所示，胞浆内可见张力纤维，丰富细胞器(线粒体、核糖体及粗面内质网)，细胞链接之间可见桥粒和微绒毛样突起。图2为zju-0327，zju-0725和zju-1127细胞透射电镜照片。(a-c)细胞间连接的桥粒；(d-f)凹陷的核膜；(g-i)细胞质内微丝。

实施例4

培养的zju-0327、zju-0725和zju-1127细胞胰酶消化后离心(300×g,7min)收集细胞，pbs洗3次；加入足量的4％多聚甲醛固定液室温固定10-15min，固定后细胞pbs洗3次；细胞在10％山羊血清+0.03％triton-x100的pbs中固定和通透化40min；离心去除上清，fitc荧光标记的pan-ck流式抗体与细胞常温避光孵育30min，无添加抗体的孵育液作为阴性对照；pbs洗涤离心3次；30μm细胞滤网过滤后上机检测。结果如图3所示，zju-0725纯度约为97％，zju-1127纯度在98％左右；zju-0328纯度为99％。图3为流式鉴定zju-0327，zju-0725和zju-1127细胞纯度。(a-c)isotypecontrol流式分析图；(d-f)ck-pan流式分析图；(g-i)ck-pan阳性率统计图。

实施例5

收集约1×10⁶个处于指数分裂的zju-0327、zju-0725和zju-1127细胞、mcf-7和淋巴细胞分离液分离的人淋巴细胞；加入0.3mlpbs缓冲液吹打成细胞悬液，再逐滴加入-20℃冰冻的乙醇0.7ml,边加边摇晃均匀，将标本置入4℃冰箱过夜；次日取出pbs洗1次；加入rnasea于37℃水浴消化30min,再加入400μlpi混匀，4℃避光反应30min；过30μm滤网获得单细胞悬液后上机检测。

图4为人乳腺癌her2+/basal细胞系zju-0327、zju-0725和zju-1127细胞的细胞周期分布图(a-e)、统计图(f)和生长曲线图(g-i)。(a)人血单核细胞周期分布图；(b)mcf-7细胞周期分布图；(c)zju-0327细胞周期分布图；(d)zju-0725细胞周期分布图；(e)zju-1127细胞周期分布图；(f)细胞周期统计图；(g)zju-0327细胞倍增图；(h)zju-0725细胞倍增图；(i)zju-1127细胞倍增图。

图4中(a-f)所示，正常人淋巴细胞为2倍体，几乎全部细胞均处于细胞周期g0/g1期；mcf-7及zju-0328、zju-0725细胞均为多倍体，大多数细胞位于g0/g1期，其次时s期，最少为g2/m；统计分析表明，与mcf-7细胞相比，g0/g1期比例：zju-0725下降而zju-1127和zju-0327细胞升高；s期比例(spf)和增殖指数(pi)：zju-0725细胞增高而zju-1127和zju-0328细胞下降；g2/m期比例均下降。

实施例6

将培养的zju-0327、zju-0725和zju-1127细胞胰酶消化后，重悬于rpmi1640+10％fbs培养基中并进行计数，经浓度调整后获得终浓度为2.5×10⁴/ml和5×10⁴/ml的细胞悬液；将其分别接种在96孔板中，每孔200μl,每组设6个复孔，只加培养基的孔作为空白对照；将培养板放入37℃培养箱中培养，于0、12、24、36、48、60和72h时间点加入cck-8孵育2.5h，随后450nm处测定吸光值。结果如图4(g-i)所示，群体倍增时间分别：zju-0725为57.5h；zju-1127为18.8h和zju-0327为18.7h，与初始的接种细胞密度无关。

实施例7

将生长接近汇合的zju-0725、zju-1127、zju-0327、hbl-100、mcf-10a、mcf-7、t-47d、bt-549、mda-mb-231的细胞，pbs洗3遍；加入1mlripa裂解液(终浓度为1nmpmsf),用枪吹打数下，收集裂解物；4℃12000g离心5min，取上清，分装保存。bca法测定各个裂解物浓度，调整浓度一致，加入4倍体积上样缓冲液，沸水煮5min。制备sds-page胶，上样20μg，80v电泳至分离胶和浓缩胶界面，110v电泳至溴酚蓝接近胶的底部；转膜仪转至pvdf膜；5％脱脂奶粉(tbst)室温缓慢摇动封闭2h；加入一抗抗体4℃孵育过夜，tbst洗涤3次，5min/次；加入稀释的二抗室温孵育2h；ecl发光液孵育，westernblot成像分析系统成像显影。

图5中：(a)hbl-100，mcf-10a，mcf-7，t-47d，bt549，mda-mb-231，zju-0327，zju-0725和zju-1127细胞的wb检测图；(b)支原体检测琼脂糖电泳图；(c)放疗敏感检测统计图；(d)docetaxel、carboplatin、cyclophosphamidemonohydrate、paclitaxel、epirubicinhcl和5-fu化疗敏感检测统计图。

如图5a结果所示，建立起来的zju-0327，zju-0725和zju-1127表型均为basal/her2-positive，且多潜能干性强且预后性差。

实施例8

对生长出癌细胞需要同时进行支原体感染情况的检测，本研究采用的是pcr法，利用杭州华安生物公司的支原体pcr检测试剂盒(huaanpcrmycoplasmatestkit)，可同时检测常见的48种支原体，步骤如下：

1.试剂盒组成：

①pcr反应液400μl(20μl/次，20次反应)

②taq酶20μl(1μl/次，20次反应)

③dna释放液1000μl(40μl/次，25次反应)

④dna阳性对照1管(冻干粉末)

⑤液体石蜡1000μl

⑥使用说明书1份

2.样本收集及处理：

①收集细胞：将生长至近汇合的癌上皮细胞用细胞刮刀从培养皿中刮落，将含癌细胞的培养液移至15ml离心管中；

②离心：将以上细胞悬液离心(12000rpm，5-l0min)；

⑨提取dna：去上清，加入dna释放液40μl，移入2mlep管中，充分吹打，煮沸5min；

④再次离心(12000rpm，5～l0min)，取上清作为pcr反应样品模板备用。

3.配制pcr反应试剂：

①阳性对照准备：将dna阳性对照粉末小瓶先在离心机上离心(5000rpm，5min)，再打开瓶盖加入25μl去离子水，充分溶解，备用；

②配制pcr反应液：从-20℃冰箱中取出pcr反应液，3个重复检测样品加上阳性对照(阳性dna)和阴性对照(pbs)共应配制5个反应液，取pcr反应液l00μl，加入5μltaq酶。一次性配制所需反应体系，保持pcr反应的均一性。

③充分混匀pcr反应液和taq酶，并以21μl/管分装至5个pcr反应管中；

④5个pcr反应管中各加入4μl备用样品(3个重复管)、dna阳性对照及pbs阴性对照；

⑤将pcr反应管离心(10000rpm，l0s)。

4.pcr反应及参数设置：将pcr反应管放入pcr仪，按以下参数进行pcr反应：

5.pcr产物的电泳检测：

①1×tae缓冲液配制：取lml50×tae电泳缓冲液加入49ml去离子水；

②2.0％琼脂糖凝胶制备：称取1.09g琼脂糖于三角烧杯中，加入50mll×tae；

电泳缓冲液，微波炉溶化琼脂糖，稍冷后加入5μlgelred核酸染料，倒入凝胶模中，冷却凝固，备用；

③上样：每个pcr管取8μlpcr扩增产物，加入琼脂胶板的胶孔中，扩增产物包含溴酚蓝指示剂；

④电泳：110v电泳20min后根据溴酚蓝指示剂停止电泳。

6.凝胶成像分析：将电泳后的胶板取出放入bio-rad凝胶成像分析仪中观察并拍照保存，出现与阳性对照相同的条带即为支原体阳性样本。如图5中b所示，所建立的zju-0327，zju-0725和zju-1127均未受支原体污染。

实施例9

细胞准备：将培养的原代乳腺癌细胞zju-0725和zju-1127用胰酶消化后悬浮于rpmil640培养液中并进行计数，经浓度调整后获得终浓度为2.5×10⁴/ml的细胞悬液；

细胞接种：将以上浓度的细胞悬液分别接种到96孔板中，每孔0.2ml(含5000个细胞)，每组6个复孔，只加培养液不含细胞的孔作为空白对照；

对于射线照射组：待接种的细胞贴壁后对每组细胞分别施加0、2、5、10和15gy的x线照射，再将照射后的细胞置入培养箱继续培养72h；

化疗药处理组：待接种细胞贴壁后对每组分别加入适量的化疗药多西他奇(docetaxel)、卡铂(carboplatin)、环磷酰胺(cyclophosphamidemonohydrate)、紫杉醇(paclitaxel)、盐酸表柔比星(epirubicinhcl)和5-氟尿嘧啶(5-fu)，设置不同浓度药物，放入培养箱中继续培养特定时间；

cck-8检测：在特定的处理时间后分别对以上每组细胞用cck-8(1:10稀释，37℃孵化2.5h)进行活性检测，并记录每组细胞在450nm的吸光度值，利用gradpad软件绘制曲线。如图结果5c所示，sk-br3和zju-0725均对放疗敏感，随着辐射剂量增加，抑制率上升，而zju-1127对放疗不敏感。如图5中d所示，不同浓度的化疗药除docetaxel和epirubicinhcl对zju-0725有部分抑制作用外，其他化疗药均对zju-0725和zju-1127没有明显抑制作用。

实施例10

1.细胞准备：将指数生长期的三株乳腺癌细胞胰酶消化后离心(800rpm，5min)后用无血清培养基洗涤离心3次；

2.将细胞重新悬浮于pbs缓冲液中，计数调整细胞密度为5×10⁷/ml；

3.将0.2ml的以上细胞悬液(含约1×10⁷个细胞)注射到4-6周的babl/c小鼠背部皮下(n＝3)，小鼠饲养于spf级的层流间内；

4.观察4周，每周触诊并测量瘤体直径大小；

5.4周后将小鼠安乐死，取出瘤体测量拍照，取部分瘤体浸泡于10％福尔马林溶液，进行常规石蜡包埋及切片制作，备用。

图6为zju-0327，zju-0725和zju-1127细胞在无胸腺的裸鼠(nu/nu，babl/c)小鼠皮下所成瘤体及瘤体生长曲线。(a)zju-0327细胞接种两周后皮下所长出的肿瘤，左下角为瘤体大体图。右侧上方为he染色病理图，提示该肿瘤为低分化癌；(b)zju-0725细胞接种两周后皮下所长出的肿瘤，左下角为瘤体大体图。右侧上方为he染色病理图，提示该肿瘤为低分化癌；(c)zju-1127细胞接种两周后皮下所长出的肿瘤，左下角为瘤体大体图。右侧上方为he染色病理图，提示该肿瘤为低分化癌。

如图6所示，zju-0327，zju-0725和zju-1127在裸鼠上均成瘤，且随着接种时间的延长，移植瘤瘤体体积逐渐增大；病理检查显示均为低分化乳腺肿瘤。

实施例11

引物设计：引物参照文献报道；

基因组dna提取：qiagendna试剂盒提取全基因组dna；

pcr：pcr条件参照各自引物的tm温度在pcr仪进行pcr；

外显子测序：经凝胶电泳后，切取目标凝胶条带交由杭州擎熙科生物公司完成测序工作。

图7为tp53突变检测结果图。(a，b)外显子4点突变：单核苷酸多态性；(c，d)外显子5点突变：错义突变。

如图7结果所示三株乳腺癌肿瘤tp53均在外显子4的第72位密码子发生c突变成g，氨基酸由脯氨酸(pro)变为精氨酸(arg)，该突变属于单核苷酸多态性；外显子5第126位密码子出现了t突变成a，氨基酸由酪氨酸(try)变为天冬酰胺(asn)，属于错义突变。

实施例12

①向指数生长期的三株乳腺癌细胞培养液中加入秋水仙素(终浓度为0.05mg/ml)作用6h；

②弃去培养液后洗涤并用胰酶消化收集细胞，pbs洗涤离心后将细胞收集于15ml离心管底部；

③低渗处理：加入已于37℃水浴锅中充分预热的低渗kcl溶液(0.075mol/l)4-5ml，于37℃水浴中作用20min，充分膨胀细胞；

④预固定：于上述低渗液中直接加入lml新鲜配制的固定液(甲醇：冰醋酸，3：l，v/v)，轻轻吹打均匀，固定5min后离心(1500rpm，10min)，弃上清；

⑤再固定：加入6-8ml新鲜配制的固定液，常温固定30min；

⑥吹片：将以上标本离心后再加5-6滴固定液，试取1滴，滴在4℃蒸馏水玻片上，在酒精灯火焰上迅速烘烤并吹片；

⑦giemsa染色：将吹好的以上玻片表面滴加适量giemsa工作液染色10-15min，自来水冲洗玻片后自然晾干即得到中期染色体标本。

图8为zju-0327，zju-0725，zju-1127细胞代表性单细胞的核型分析。(a)zju-0327第35代单细胞代表性的核型；(b)zju-0725第25代单细胞代表性的核型；(c)zju-1127第23代单细胞代表性的核型。

如图8所示，核型图谱显示在染色体数目和结构上所建立的三株细胞均出现异常，染色体数为亚三倍体核型，大多分布在78-85之间，结构异常包括染色体增加、缺失和易位等。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。