一种紫色红曲菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种紫色红曲菌及其应用。

背景技术：

中国的黄酒是世界上最古老的饮料酒之一，在世界三大酿造酒(黄酒、葡萄酒和啤酒)中占有重要的一席。红曲黄酒因添加了红曲进行发酵而具有与众不同的功效。此外，红曲还用于酱油、醋等的酿造中，对于酿造基质的风味、色泽和功能性成分等均有一定的贡献。红曲霉在代谢的过程中会产生桔霉素，桔霉素可能诱发突变，导致肿瘤，影响了酿造食品的安全性。

黄酒等在酿制的过程中，由于红曲的发酵产生色素，使得发酵基质具有特殊的色泽，优良的色泽能够有效提高产品品质。因此，本领域技术人员迫切需要筛选获得一种高产色素且低产桔霉素的菌株，在改善产品色泽的基础上，增加生物安全性。

技术实现要素：

发明人通过对紫色红曲菌的研究、筛选和验证，提供了一种高产色素且低产桔霉素的紫色红曲菌fjmr36。该菌株和包含该菌株的红曲发酵剂可有效应用于黄酒的发酵中，高产色素可改善红曲黄酒发酵基质的色泽，其低产桔霉素可降低致癌风险，增加黄酒的安全性；同时，该菌株还可提高酿造原料的生物转化利用率。

本发明提供了一种紫色红曲菌，分类命名为：紫色红曲菌fjmr36，拉丁名为monascuspurpureus；由中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏号为m2017313，保藏日期为2017年6月8日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。该紫色红曲菌fjmr36高产色素且低产桔霉素，具有高糖化液化能力。

本发明还提供了一种红曲发酵剂，所述红曲发酵剂中含有紫色红曲菌fjmr36。

本发明还提供了紫色红曲菌fjmr36在红曲黄酒酿造上的应用。

本发明还提供了一种红曲黄酒的酿造方法，酿造中所用的红曲发酵剂为紫色红曲菌fjmr36发酵制备。

进一步地，所述红曲发酵剂的制备包括如下步骤：

将活化的紫色红曲菌孢子液以4-6％(v/m)接种于固体发酵培养基中，孢子液与培养基混合均匀后，29-31℃培养至培养基米粒上出现红曲霉菌丝体时，将长有红曲霉菌丝体的米粒混匀，并吸附容器壁上的冷凝水后摊平，继续培养；待米粒表面铺满红色菌丝体成为红曲后，摇瓶1次，并根据米粒表面干燥程度补加适量无菌水；之后每天摇瓶2至3次，以调整红曲通气性状并使红曲生长均匀；将培养8-10天的红曲44-46℃烘至水分含量＜15％，制成所述红曲发酵剂；

所述固体发酵培养基为市售籼米制备。

进一步地，所述固体发酵培养基的制备方法为：15-25℃下将市售籼米用体积百分比为0.8-1.0％的乳酸或7-9％的红曲醋浸泡过夜，淋清、沥干水分后105℃灭菌18-22min。

在浸米过程中，乳酸或红曲醋可有效调节籼米的ph值，确保紫色红曲菌接入后，孢子能够迅速萌发，并明显提高菌体生长量及代谢产酶或产色素水平，且不影响后续红曲黄酒的风味。

区别于现有技术，本发明所提供的紫色红曲菌fjmr36的产色水平达7600u/g以上，分别比标准菌株紫色红曲菌41450和常用生产菌株紫色红曲菌fm23提高了17.7％和26.7％；桔霉素产量分别比标准菌株紫色红曲菌41450和常用生产菌株紫色红曲菌fm23降低93.1％和89.3％。紫红色红曲菌fjmr36可制备红曲发酵剂，应用于红曲黄酒的酿造，在改善酒体色泽、增加产品安全性的同时还能提高发酵原料的生物转化利用率。

附图说明

图1为本发明fjmr36筛选过程中，7株高产色素的红曲菌菌株产桔霉素能力图；

图2为本发明fjmr36菌落形态图；

图3为本发明fjmr36在光学显微镜下的个体形态图；a为分生孢子与无性产孢结构，b为闭囊壳结构；

图4为本发明fjmr36在扫描电子显微镜下的个体形态图；a为无性产孢结构，b分生孢子结构，c为闭囊壳结构；

图5为本发明fjmr36基于itsrdna基因序列构建的系统发育树；

图6为本发明fjmr36基于β-tubulin基因序列构建的系统发育树。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施方式详予说明。

一、紫色红曲菌fjmr36的筛选

1材料与方法

1.1材料

1.1.1分离样品来源

由本实验室人员从福建、广东和浙江等地收集的红曲黄酒酿造常用红曲发酵剂或红曲制备场地的土样等。

1.1.2对照菌株来源

(1)紫色红曲菌(monascuspurpureus)41450：购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，以下简称41450；

(2)紫色红曲菌(monascuspurpureus)fm23：由福建古田微生物研究所提供，为红曲黄酒生产常用菌株之一，以下简称fm23。

1.1.3培养基

(1)麦芽汁培养基：麦芽汁8o，琼脂2％(配固体培养基时加入)，ph5.6。

(2)孟加拉红培养基：蛋白胨0.5％，葡糖糖1.0％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，琼脂1.5％，孟加拉红0.0033％，氯霉素0.01％。

(3)种子培养基：葡萄糖6﹪，蛋白胨2％，玉米淀粉5.0％，nano30.2％，kh2po40.2％，mgso40.1％，ph5.4。

(4)固体发酵培养基：籼米，市售。

1.2方法

1.2.1样品处理

无菌操作将分离样品研碎，取5g于45ml无菌水中，150r/min摇床振荡2h，备用。

1.2.2单菌株分离纯化

用对数稀释涂布法，将合适的稀释梯度(使每个平板上的菌落数在10至50个)样品涂布于孟加拉红培养基平板上，30℃培养1至2天，根据培养基平板上的菌落形态特征(如：颜色、大小、菌落边缘的完整性、菌丝长短及产孢子情况等)挑出不同菌株，接入另一空白孟加拉红培养基平板中继续培养，反复多次直至菌株完全纯化，并转接于麦芽汁琼脂斜面，30℃培养6至7天，待菌丝长满后置4℃冰箱保存，备用。

1.2.3菌种活化

挑取斜面孢子至无菌水中，用玻璃珠打散，使孢子浓度达到0.5×10⁶个/ml左右。将孢子液以10％接种于种子培养基，150转/分钟，30℃培养2至3天，并将其孢子量调节至5×10⁷个/ml左右，备用。

1.2.4固体发酵培养基的制备

15-25℃下将市售籼米用0.9％(v/v)乳酸浸泡过夜，淋清、沥干水分后分装入500ml三角瓶内，每瓶约装90g，包扎8层纱布封口，105℃灭菌20min。摇动三角瓶使米粒松散，同时吸附瓶壁的冷凝水。

1.2.5红曲发酵剂的制备

将活化的紫色红曲菌孢子液以5％(v/m)接种于固体发酵培养基中，摇动三角瓶使孢子液与培养基混合均匀，然后将其堆在瓶底一脚，29-31℃培养至米粒上出现红曲霉菌丝体，摇瓶1次，吸附瓶壁上的冷凝水，将米曲摊平；待米粒表面铺满红色菌丝体，摇瓶1次，并根据米粒表面干燥程度补加适量无菌水；之后每天摇瓶2至3次，以调整红曲通气性状并使生长均匀。将培养8-10d的红曲放于44-46℃烘箱烘至水分含量＜15％。

1.2.6色价和色调的测定

采用gb1886.19-2015《食品添加剂红曲米》方法，在505nm波长处测定红色组分色价，根据红曲色素中黄色组分和橙色组分各410nm和465nm处有吸收峰的特征，还分别在410nm和465nm测定吸光值，色价＝(od410+od465+od505)×稀释倍数；色调＝od505/od410(红黄比)。

1.2.7桔霉素的测定

按照gb/t5009.222-2008《红曲类产品中桔青霉素的测定》进行。

1.2.8糖化力、液化力测定

按照qb/t4257-2011《酿酒大曲通用分析方法》进行。

2结果与分析

2.1霉菌单株的分离与筛选

从收集的样品中共分离到39株红曲霉菌株，编号为fjmr33-fjmr71，各菌株在籼米固态培养基上产色情况如表1所示。39株分离菌产色素水平差异显著，fjmr61、fjmr36、fjmr33、fjmr42、fjmr51及对照菌41450和fm23色价值均达6000u/g以上。其中fjmr61色价最高，产色水平分别比对照菌41450和fm23提高了18.3％和41.2％，其次为fjmr36，产色水平分别比对照菌41450和fm23提高了17.7％和26.7％，显著高于国内外其它红曲霉代谢产醇溶性色素的色值。

表1分离菌株产色素能力

注：1)本表只显示色价值达2000u/g以上的菌株产色素情况；2)小写字母“a-o”表示差异显著(p≤0.05)，大写字母“a-l”表示差异极显著(p≤0.01)。

对分离菌fjmr61、fjmr42、fjmr33、fjmr36、fjmr51、对照菌41450和fm23的产桔霉素能力作进一步研究，结果如图1所示。7株红曲霉均有不同程度产桔霉素能力，其中fjmr36桔霉素含量最低，分别比对照菌41450和fm23降低93.1％和89.3％，其次为fjmr61桔霉素含量为19.07mg/kg，两菌株色调值均大于1，说明醇溶性色素中红曲组分比例高，应用于红曲黄酒酿造，将有利于改善酒体色泽。

作为酿造用曲中的菌株，须具备一定的糖化液化能力，因此在上述工作的基础上，进一步测定分析了菌株fjmr61、fjmr42、fjmr33、fjmr36、fjmr51、对照菌41450和fm23的糖化、液化力，结果如表2所示。fjmr36的液化力达2213.1±8.1g/g·h，显著优于对照菌41450和fm23以及其它分离菌株；糖化力达2126.4±13.0mg/g·h，与活力最高的fjmr42间无显著性差异，即fjmr61是一株糖化、液化力均较高的优良菌株。

表2高产色素菌株的糖化、液化力

从产色、产桔霉素及糖化液化力水平综合评判，宜选择fjmr36作为改善酿酒基质色泽、提高生物安全性提高原料利用率的优良菌株。

二、紫色红曲菌fjmr36的形态学特征、基因序列分析

1培养基与孢子悬液的制备

1.1培养基

1.1.1mea培养基：粉状麦芽提取物2％，蛋白胨1％，葡萄糖2％，琼脂1.5％。

1.1.2麦芽汁培养基：麦芽汁8o，琼脂2％(配固体培养基时加入)，ph5.6。

1.2孢子悬液的制备

将fjmr36划线接种于麦芽汁琼脂斜面，30℃恒温培养7天，用10ml无菌生理盐水将斜面上的孢子洗下，漩涡振荡器混匀，4层擦镜纸过滤，并通过血球计数板法计数，将滤液调整成1×10⁶个/ml的孢子悬液。

2fjmr36的形态学特征

2.1菌落及显微形态观察方法

2.1.1菌落形态观察：采用点种法，将活化的fjmr36接种于mea平板，30℃恒温培养，连续观察14天内菌落形态、生长情况，并及时进行记录。

2.1.2个体形态观察：利用载玻片培养法，将fjmr36的孢子液接种在mea琼脂薄片周围，30℃恒温培养6-7天后，用光学显微镜及电子显微镜观察菌丝形态、分生孢子、子囊孢子、闭囊壳等形态特征，并通过图像处理软件进行拍照、分析。

2.2菌落形态特征

在mea培养基上培养fjmr36，温度为30℃，培养10天。fjmr36的菌落形态如图2所示，直径55-60mm，边缘完整，橙黄色；表面平坦；质地丝绒状；反面橙黄色；无渗出液体产生，无可溶性色素产生。

2.3个体形态特征

菌株fjmr36在光学显微镜及扫描电子显微镜下的形态，如图3-4所示。菌丝不规则分支，分隔，内含明显油滴，壁上具疣状结晶，宽度为4-8μm；分生孢子单生或链生，着生在菌丝顶端或侧枝顶端，倒梨形或近球形，长轴直径8-15μm；闭囊壳近球形，着生于短柄顶端，20-50μm。

3fjmr36的基因序列分析

3.1基于itsrdna基因序列构建的系统发育树

fjmr36的itsrdna测序长度为501bp，在ncbi上比对并构建系统进化树如图5。fjmr36与monascuspurpureusatcc16379(ay498573)、monascusaurantiacuscicc5014(ay629435)聚在同一分支上，且同源性分别达100％与99.6％，该菌属于红曲菌属(monascussp.)。

3.2基于β-tubulin基因序列构建的系统发育树

为进一步确认fjmr36的菌种类型，对该菌的β-tubulin进行测序得到901bp的序列，与相关种β-tubulin序列的系统发育树如图6。fjmr36与monascuspurpureusatcc16379(ay498573)聚在同一分支上，且同源性达100％，结合itsrdna分析结果及形态学特征，可以确定fjmr36为紫色红曲菌(monascuspurpureus)。

三、紫色红曲菌fjmr36在红曲黄酒酿造中的应用

1材料

1.1培养基

1.1.1种子培养基：葡萄糖6﹪，蛋白胨2％，玉米淀粉5.0％，nano30.2％，kh2po40.2％，mgso40.1％，ph5.4。

1.1.2麦芽汁培养基：麦芽汁8^o，琼脂2％(配固体培养基时加入)，ph5.6。

1.1.3籼米：市售；红曲醋：为紫色红曲菌发酵制备。

1.2试验菌：紫色红曲菌(monascuspurpureus)fjmr36、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)jh301，均来自福建省农产品(食品)加工重点实验室；紫色红曲菌(monascuspurpureus)41450，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；紫色红曲菌(monascuspurpureus)fm23，由福建古田微生物研究所提供，为红曲黄酒生产常用菌株之一。

2方法

2.1孢子悬液的制备

将试验菌株划线接种于麦芽汁琼脂斜面，30℃恒温培养7天，用10ml无菌生理盐水将斜面上的孢子洗下，漩涡振荡器混匀，4层擦镜纸过滤，并通过血球计数板法计数，将滤液调整成1×10⁶个/ml的孢子悬液。

2.2种子培养

向250ml三角瓶中装入50ml种子培养基，10％接种试验菌株孢子悬液，30℃、150r/min摇床培养2-3天，4层纱布滤去菌丝后备用。

2.3固体发酵培养基的制备

15-25℃下将市售籼米用用8％(v/v)红曲醋浸泡过夜，淋清、沥干水分后分装入500ml三角瓶内，每瓶约装90g，包扎8层纱布封口，105℃灭菌20min。摇动三角瓶使米粒松散，同时吸附瓶壁的冷凝水。

2.4红曲发酵剂的制备

将活化的紫色红曲菌孢子液以5％(v/m)接种于固体发酵培养基中，摇动三角瓶使孢子液与培养基混合均匀，然后将其堆在瓶底一脚，30±1℃培养至米粒上出现红曲霉菌丝体，摇瓶1次，吸附瓶壁上的冷凝水，将红曲摊平；待米粒表面铺满红色菌丝体，摇瓶1次，并根据米粒表面干燥程度补加适量无菌水；之后每天摇瓶2至3次，以调整红曲通气性状并使生长均匀。将培养8-10d的红曲放于45±1℃烘箱烘至水分含量＜15％，备用。

2.5红曲发酵剂发酵性能评判

以fm23和41450制备的红曲发酵剂为对照，进行红曲黄酒的酿造试验。取5kg装陶缸，加入2.0kg净化水，分别加入红曲发酵剂100.0g，浸泡过夜，次日加入经浸泡、蒸煮、摊凉的糯米饭2.0kg，搅拌混匀后置于20±2℃下至发酵结束，压榨出原酒用80℃水浴杀菌30min，冷却后密封，于20-25℃陈酿，成为红曲黄酒基酒。取样检测各基酒的酒精度、色价等理化指标，对fjmr36红曲发酵剂的发酵性能进行综合评判。

2.6色价的测定

将红曲黄酒样品用滤纸过滤澄清后，采用分光光度计测定样品在505nm处的吸光值。

2.7酒精度的测定

按照gb/t13662-2008《黄酒》进行。

3结果

分别用fjmr36、41450和fm23制备的3种红曲发酵剂在红曲黄酒酿造中的应用效果如表3。41450和fm23对酒体色泽的贡献与其产色能力相一致，而fjmr36与其相比则表现出显著的增益性能，原因分析可能为，红曲黄酒的酿造体系是一个复杂的微生物混菌体系，其中的非主导微生物促进了fjmr36的生长，从而提高了该菌的产色性能。从三种处理的酒精度来看，高糖化、液化力的fjmr36最高，其次为fm23，41450红曲发酵剂酿制的红曲黄酒酒精度最低，即高糖化、液化力菌株可提高酿造原料的生物转化利用率。

表3红曲黄酒的理化指标

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容或者说明书附图所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。