多肽IMB-M2的异源表达及其在增强NK细胞杀瘤活性中的应用的制作方法

本发明涉及一种多肽在增强nk细胞杀瘤活性中的应用，属于生物制药和生物治疗领域。

背景技术：

恶性肿瘤严重威胁人类的生命健康，近年来肿瘤发病率在世界范围内普遍上升。目前，肿瘤的常规治疗手段主要包括手术治疗、化学治疗、放射治疗等，但均存在局限性。因此，研发新型抗肿瘤治疗手段，已在世界范围内成为各国政府投资的重点。

生物治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，临床应用属于自体免疫细胞的抗癌症治疗方法，已被国家卫生计生委列入允许临床应用的三类技术。生物治疗包括细胞因子治疗、免疫细胞治疗、基因治疗、分子靶向治疗和抗体靶向治疗等。目前用于生物治疗的细胞种类有以下几个：细胞因子诱导的杀伤细胞(cik)，自然杀伤细胞(nk)，肿瘤浸润淋巴细胞(til)等。用于回输给患者的以上各类细胞体外制备的共同瓶颈是性能优异的细胞因子的出现，以使各类细胞具有效率更高、活性更强的扩增及杀伤潜力。

肽类物质是一类或天然存在于动、植物和微生物等生物体内，或动、植物蛋白质经过蛋白酶解以及人工化学合成、生物工程等三种方式存在的肽类混合物。众所周知，肽的作用涉及机体的激素、神经、细胞生长和生殖各领域，其重要性在于调节体内各个系统器官和细胞的功能活动。与生物体内其他物质比较，肽的最大特点是具有极强的活性和多样性，而且具有特殊的生物学功能，如血管活性肽及其相关肽段可以以内分泌方式发挥循环激素的作用。新近研究表明肽类物质的有效成分多以细胞因子(cytokine)的方式发挥活性，鉴于细胞因子在生物体内含量甚微、成分复杂、来源极为有限，应用于临床的诸多细胞因子类药物基本都经历了从天然获取到基因工程菌株制备的过程，如促红细胞生成素(epo)是一种主要由肾脏和中枢神经系统等部位合成分泌的多功能糖蛋白激素，其为首个经历从天然获取到基因工程高效制备并成功应用于临床的细胞因子类基因工程药物。

抗癌活性肽(anticancerbioactivepeptide，acbps)，以下简称“acbps”，是用人胃癌细胞碎片免疫山羊，从其脾脏中分离获得的具有良好抗肿瘤活性的分子量单一的(16.7kd)肽类混合物(该方法已获得发明专利，no：zl96/22236)，其良好的抗癌活性已在体内外实验中得到验证。本专利发明人所在课题组应用2d-nano-lc-esiltq-orbitrapms/ms技术对acbps进行生物合成信息的解析，并获得其中一个单组分goatperoxiredoxin-5(gprdx5)的序列信息，同时实现了其在大肠杆菌中的异源表达及活性确证。据此，采用相同策略对于acbps单组分化、寻找活性优异的细胞因子具有可行性。

综上，本发明人在acbps单组分化的基础上，采用nk细胞活性评价体系筛选获得一活性成分，命名为imb-m2。随后构建多肽imb-m2表达体系，获得单一的多肽imb-m2。最终，以多肽imb-m2为细胞因子添加至nk细胞培养体系中，以期提高nk细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。结果显示多肽imb-m2可以提高nk细胞的杀瘤活性。本发明所述的多肽imb-m2可增强nk细胞的杀瘤活性尚属首次发现。

技术实现要素：

第一方面，本发明提供一种多肽imb-m2的异源表达系统，所述表达系统由多肽imb-m2基因、携带多肽imb-m2基因的重组质粒及异源表达多肽imb-m2的单克隆细胞株构成。

所述多肽imb-m2基因为seqidno：1所示的核苷酸序列。

所述多肽imb-m2的氨基酸序列为seqidno：2所示的氨基酸序列。

所述重组质粒由多肽imb-m2基因和表达载体构成。

所述表达载体为pet-21a、pet-21b、pet-23b、pet-28a、pet-30a、pet-41a、pet-41ah、pe-41ahnt、pet-41am、pgex-4t-1、pacycduet、pcdfduet、petduet、prsfduet、ppic9k、ppic35k和pwb980中的一种；优选为pet-21a。

所述单克隆细胞株是通过将重组质粒转入表达宿主中而获得。

所述表达宿主为为e.colibl21、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌(wb600)中的一种，优选为e.colibl21。

第二方面，本发明提供了一种构建多肽imb-m2异源表达系统的方法，包括以下步骤：

(1)扩增获得多肽imb-m2基因序列；

(2)构建包含多肽imb-m2基因的核苷酸序列与表达载体的重组质粒；

(3)将重组质粒转入表达宿主并进行发酵培养。

步骤(1)中所述的多肽imb-m2基因为seqidno：1所示的核苷酸序列；

多肽imb-m2基因表达的氨基酸序列为seqidno：2所示的氨基酸序列；

步骤(2)中所述的表达载体为pet-21a、pet-21b、pet-23b、pet-28a、pet-30a、pet-41a、pet-41ah、pe-41ahnt、pet-41am、pgex-4t-1、pacycduet、pcdfduet、petduet、prsfduet、ppic9k、ppic35k和pwb980中的一种；优选为pet-21a；

步骤(2)中所述表达宿主为为e.colibl21、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌(wb600)中的一种；优选为e.colibl21。

第三方面，本发明提供了一种多肽imb-m2提高nk细胞杀瘤活性的评价方法，该方法可快速准确的评价多肽imb-m2提高nk细胞杀瘤活性的作用。

所述的多肽imb-m2提高nk细胞杀瘤活性的评价方法的技术方案是，向nk细胞培养液中添加多肽imb-m2，以k562为靶细胞、脐带血来源nk细胞为效应细胞，进行以cellcountingkit-8(简称cck-8)方法为基础的nk细胞杀伤活性的检测和以溶酶体相关膜蛋白-1(lamp-1或cd107a)为代表的nk细胞表型的检测。优选地，所述的多肽imb-m2的给药浓度为0.1μm～1mm。

第四方面，本发明提供了利用本发明的多肽、其变体或衍生物制备抗肿瘤药物或药物组合物的用途，所述药物或药物组合物还包含赋形剂或药用载体。

第五方面，本发明提供了抑制个体的肿瘤细胞或治疗个体的癌症的方法，包括对所述个体进行有效量的本发明的多肽、其变体或衍生物、药物或药物组合物的给药。

附图说明：

图1多肽imb-m2表达载体构建图。

图2多肽imb-m2的sds-page图。

图3多肽imb-m2对nk细胞杀瘤活性的影响(^*p＜0.05差异有统计学意义)。

图4多肽imb-m2对nk细胞表型的影响，其中a为nk细胞表型流式分析结果，b为多肽imb-m2对cd16⁺cd56⁺、cd107a⁺nk细胞频率的影响(^*p＜0.05差异有统计学意义)。

具体实施方式：

一方面，本发明提供了多肽imb-m2的核酸序列和氨基酸序列，该多肽具有提高nk细胞杀瘤活性的作用。

另一方面，提供了具有抗肿瘤活性或抑制肿瘤生长的多肽，其包含imb-m2的氨基酸序列，或其具体相同功能的变体或衍生物。

本发明的另一方面涉及所述的多肽imb-m2作为细胞因子类药物或药物组合物用于提升肿瘤生物治疗常用细胞，诸如细胞因子诱导的杀伤细胞(cik)、自然杀伤细胞(nk)、肿瘤浸润淋巴细胞(til)等的活性，使其具有效率更高、活性更强的扩增及杀伤潜力。所述细胞因子类药物或药物组合物用于提高肿瘤生物治疗常用细胞活性，优选nk细胞。所述的多肽可以与脂质体、赋形剂或药用载体组成药物或药物组合物。

在本发明的实施方案中，所述肿瘤或癌症选自肝癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、诸如骨肉瘤的肉瘤、白血病、卵巢癌、输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、肾癌、内分沁腺癌、皮肤癌、黑色瘤、血管瘤以及脑或中枢神经系统癌症。在优选的实施方案中，所述的癌症是白血病。所述癌症可以为原发肿瘤，也可以是转移性癌症。

以下实施例进一步帮助本领域技术人员更好地了解本发明，但不以任何方式限制本发明。

《实施例1》多肽imb-m2序列的扩增

在前期acbps单组分化基础上，将其中一具有提高nk细胞杀瘤活性的成分命名为imb-m2，经序列比对发现其为肌球蛋白轻链6(genbankid：eu370541)，依照密码子偏好性设计合成核苷酸序列，沿用名称imb-m2。依据imb-m2序列设计扩增引物imb-m2-f和imb-m2-r。

引物序列如下：

imb-m2-f：cgcggatccatgaccgcagagttcaaagaggc-bamhi

imb-m2-r：cccaagcttaccgttcagaaccatgcgc-hindiii

pcr扩增体系为：2×pcrbufferforkodfxneo25μl，kodfxneo(1.0u/μl)1μl，ddh2o10μ1，2mmdntps10μl，模板dna1μl(约50ng～200ng)，上、下游引物各1.5μl(浓度为20μm)。pcr反应条件为：94℃预变性5min；96℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min；30个循环，68℃延伸7min，结束反应。

《实施例2》多肽imb-m2重组质粒的构建

pcr扩增结束后，将所得产物进行1％琼脂糖电泳，120v30min，凝胶成像仪照相，紫外灯下切胶，并按胶回收试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)进行目的片段的回收。然后用bamhi和hindiii进行双酶切，将所获得的dna片段和载体pet-21a进行连接(宝生物工程有限公司)，连接产物转化入大肠杆菌dh5a感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，在含氨苄青霉素的lb平板上筛选。重组子用菌落pcr验证和双酶切验证。表达imb-m2多肽重组质粒的构建如图1所示。

《实施例3》表达多肽imb-m2单克隆细胞株的获得

用质粒提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)提取重组子质粒，然后按常规方法转化入表达宿主e.colibl21(北京全式金生物技术有限公司)，获得多肽imb-m2的表达工程菌株。

《实施例4》多肽imb-m2的纯化与富集

将获得的多肽imb-m2的表达工程菌接种于含氨苄青霉素的lb培养基中，37℃摇床过夜培养，以3％接种量转接至含氨苄青霉素的lb培养基中，37℃培养4h，待od600为0.6～1时，加入iptg(1m)，使其终浓度为1mm，18℃诱导表达10h。发酵结束后收集菌体，用50mmtris-hcl(ph8.0)重悬，经高压均质破碎仪破碎后，12000rpm离心45min，获得含酶上清液。随后，通过ni柱纯化获得单一的多肽imb-m2，并对其含量进行测定。

《实施例5》多肽imb-m2提高nk细胞杀瘤活性的评价方法

将k562细胞培养在含10％胎牛血清(comingcellgro，mediatech，usa)的rpmi1640培养液(comingcellgro，mediatech，usa)中，于37℃、5％co2条件下培养。常规换液、传代，培养至对数生长期，细胞计数仪计数。

按照效靶细胞比2∶1将nk细胞(1×10⁴个)和相对应的k562细胞接种于6孔板上，多肽imb-m2给药浓度为25μm，并设效靶细胞孔、靶细胞孔、效应细胞孔及空白对照孔，每孔总体积均为2ml，各设置3个复孔，充分振荡混匀后，于37℃、5％co2条件下培养16小时。

培养结束后，取出100μl培养物于96孔板中，1000g离心5min，去掉上清，向每孔加入100μl含10％胎牛血清的rpmi1640培养液和10ulcck-8溶液(日本同仁化学)，充分振荡混匀，于37℃、5％co2条件下培养4小时后用酶标仪检测各孔在波长为450nm处的od值。

按下述公式计算nk细胞杀伤率：

细胞杀伤率(％)＝[1-(效靶细胞孔od值-效应细胞孔od值)/靶细胞孔od值]×100％

将剩余培养物移至25mlep管中，1000g离心5min，去掉上清，每管加入1ml预冷的pbswashbuffer，1000g离心5min，重复2次。向每孔加入预冷的pbswashbuffer100μl重悬细胞。

各组取其中一管加入各10μl特异性表面抗体anti-humancd3fitc、anti-humancd16pe、anti-humancd56apc、anti-humancd107apercp/cy5.5(bectondickinson)，同时再取一管加入各10μl同型对照抗体mouseigg1fitc、mouseigg1pe、mouseigg1apc、mouseigg1percp/cy5.5(bectondickinson)，冰上避光孵育20min。

用1ml预冷的pbswashbuffer清洗细胞2次，1000g离心5min，去掉上清。向每孔加入预冷的pbswashbuffer500μl重悬细胞，流式细胞仪(bdfacscalibur)检测。