一种曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂的制作方法

本发明涉及生殖调控饲料添加剂领域，尤其是涉及一种曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂。技术背景曼氏无针乌贼(sepiellamaindroniderochebrune)是一年生的中型乌贼，俗名叫墨鱼，生长快，肉质鲜美，是受市场欢迎的海味食品。头足纲，乌贼科。胴部盾形。胴长为胴宽的2倍。胴背具许多近椭圆形的白花斑。肉鳍前狭后宽，位于胴部两侧全缘，仅在末端分离。无柄腕长度一般为4＞3＞1＞2，吸盘4行。雄性左侧第四腕茎化。触腕穗狭柄形，吸盘约20行，小而密。内科椭圆形。记录最大胴长0.19m，最大体重0.7kg。分布在西北太平洋和北印度洋沿岸海域。主要作业渔场在中国浙江和福建沿岸海域。最高年产量超过8万吨，是世界重要经济种。主要为鲜食。生殖调控技术也称繁殖调控技术，是动物繁殖学的中药组成弗恩，具体包括发情、排卵、受精、胚胎发育、性别发生、妊娠维持、分娩、泌乳等生殖活动的技术，是提高动物繁殖效率、加快育种速度的基本手段，通过这些调控技术的运用，可以大幅度地提高生产效率，提高畜种的质量，以及以较少的生产资料获取较多的养殖效益。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂，曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂的制备方法简单易行，本制备方法可以有效防止脑组织失水，延长脑组织活性，保持乌贼神经肽的生殖调控活性，生殖调控饲料添加剂能有效发挥促进细胞生长、分化、增殖等生殖调控作用。本发明针对
背景技术：
：中提到的问题，采取的技术方案为：一种曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂，其制备方法包括：预处理、分离、复合，具体包括以下步骤：预处理：选取性成熟、活力较强的曼氏无针乌贼个体置于冰上，低温条件下取乌贼脑组织，并小心剥离神经组织周围的结蹄组织，将乌贼脑组织置于冷冻液中，并于-80～-100℃超低温冷冻保存；将解冻后的乌贼脑组织放入离心管中，每50-60只乌贼脑组织加入20-25ml1.0‰三氟乙酸水溶液，高速匀浆5-6min，2-4℃温度下以15000-18000r/min离心25-30min，取上清液，浓缩至1/2-2/5体积后以0.45μm针头过滤器过滤，滤液在保存；预处理阶段不仅可以较好的保存离体脑组织，较大程度地保留曼氏无针乌贼脑组织的活性，而且通过将脑组织匀浆入三氟乙酸水溶液并离心分离，可以去除多余的脂肪、灰分等杂质，获得脑组织粗提液；分离：将脑组织粗提液通过rp-hplc高效液相系统进行分级分离，采用二元流动相梯度洗脱系统进行洗脱分离，分离条件如表1所示，所用流动相均超声处理，收集每min分离组分，收集组分浓缩后于-40～-55℃保存得神经肽gnrh；rp-hplc技术与其他液相方法不同，由于以组分之间极性差异为依据进行分离，因此可以进行分子量和结构十分接近组分的分离，而且分离过程中不受分子量大小限制，因此特别适用于低分子量多肽的分离纯化，同时不会影响多肽的结构与性质；表1脑组织粗提液rp-hplc分离条件项目分离参数流动相a1‰三氟乙酸水溶液流动相b1‰三氟乙酸乙腈溶液流速1ml/min进样量150μl检测波长238nm和214nm柱温25℃复合：将神经肽gnrh与神经肽gnrh类似物在10-樟脑磺酸与金属镧存在的条件下发生反应，即得曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂；曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂被机体吸收后，通过受体机制对垂体促性腺细胞分泌卵泡刺激素、黄体生成素进行调控，在整个细胞信号传导过程中，它与g蛋白结合受体家族gp结合，导致一系列不同信号在细胞内传导，并最终引起细胞内gnrh受体合成、卵泡刺激素、黄体生成素合成和分泌、细胞生长、分化、增殖等生殖调控。作为优选，冷冻液为：二甲基亚砜2.0-2.05g/l、乙酰胺1.5-1.55g/l、1,2-丙二醇1.0-1.1g/l、聚乙二醇-8000.6-0.7g/l、色甘酸钠0.1-0.12g/l、还原性谷胱甘肽0.02-0.05g/l、磷酸盐缓冲液、卵磷脂3.5-6.5g/l、苯甲酸盐1-10g/l、硝酸钠10-20g/l、丙三醇5-10g/l、青霉素200-220iu/ml、链霉素150-180iu/ml，余量为双蒸水；以冷冻液保存曼氏无针乌贼脑组织，可实现高效的冷冻保存脑组织，有效防止乌贼脑组织液化、脑细胞自溶，其生物学特性能得以高效保存，冷冻保存的脑组织可直接用于组织分析，有助于神经肽的高效率、完整性提取。作为优选，曼氏无针乌贼神经肽gnrh参与调控生殖活动的分子生物学分析步骤包括：神经肽基因克隆和序列分析、神经肽组织特异性表达分析、神经肽脑组织表达定位分析，具体包括以下步骤：神经肽基因克隆和序列分析：提取总rna的步骤包括：1)取干净的离心管，用无rnaase枪头加入500μl4℃的trizol试剂，用depc水处理过的镊子夹取30mg解冻后的乌贼脑组织样品浸入trizol试剂，使用电动匀浆器匀浆30s，补加500μltrizol试剂，轻摇离心管，使脑组织充分溶解到trizol试剂中，室温静置5min；2)在离心管中加入200μl的氯仿，剧烈震荡15s后，室温静置5min，4℃、12000rpm条件下离心15min，取最上层的上清液于新离心管中；3)向离心管中加500μl的异丙醇，摇匀，室温静置10min，4℃、12000rpm条件下离心10min，除去上清液，在沉淀中加入1ml的75％的乙醇，用枪头吹吸沉淀；4)在4℃、7500rpm条件下离心5min，用枪头吸除液体部分，保留沉淀；室温静置约20min待rna呈半干的透明状态，用depc水溶解后备用。使用反转录试剂盒，利用总rna合成cdna第一条链；以曼氏无针乌贼脑组织cdna作为模板，简并引物gnrh-f和gnrh-r进行进行gnrh基因核心片段的pcr扩增，经纯化、连接与克隆后得到核心片段序列；分别以曼氏无针乌贼脑组织总rna为模板，获得扩增3′race片段、5′race片段所需的模板cdna后，分别经pcr扩增、切胶回收和克隆连接后得到3′端、5′端片段序列；使用lasergene软件对gnrh基因的3′端、5′端和核心片段序列进行拼接，获得曼氏无针乌贼gnrh基因的cdna全长序列；运用predictprotein和scratchproteinpredictor在线工具对gnrh基因进行开放阅读框(orf)进行预测，并推测该orf所编码的氨基酸序列；应用在线分析站点signalpv3.0对氨基酸序列进行信号肽预测；应用ncbi对氨基酸序列进行blast分析；应用clustalw2对gnrh及其同源基因的氨基酸序列进行比对分析，应用expasy-protparam在线分析软件对前体蛋白相对分子质量同等电点pi进行估算，使用megav5.0软件进行基于nj法的进化树构建，重复1000次循环；神经肽基因克隆和序列分析过程中所用到的引物序列如表2所示；表2gnrh基因克隆与序列分析所需引物primernameprimersequence(5′-3′)gnrh-fcagacncaagcacaraaytagnrh-rtytctatcaaagcytttgt5′-gnrh-outterttaccaccagggtgccatcc5′-gnrh-innerttgctaaaatggtaattctg3′-gnrh-outtercacctgtgctattcttcccctctctttc3′-gnrh-innertgcatatccaggcacagaattaccam13-ftgtaaaacgacggccagtm13-rcaggaaacagctatgacc5′raceadapterggccaggcgtcgactagtacgggggggggg5′raceouterprimeracuacuacuaggggcgtcgacgta5′raceinnerprimeracuacuacuaggggcgtcga3′raceadaptergcgagcacagaattaatatttttttttttt3′raceouterprimergcggatccgaattaatacgact3′raceinnerprimergcgagcacagaattaatacgact曼氏无针乌贼神经肽gnrh的基因cdna全序列长432bp，开放阅读框(orf)273bp，编码90个氨基酸，5′-utr86bp，3′-utr73bp，前体蛋白mw为10.1kda，等电点pi为7.73；通过对前体蛋白氨基酸序列进行信号肽预测分析发现，gnrh前体蛋白的n端含有一段长31个氨基酸的信号肽，gnrh成熟肽序列c端含有一个剪切位点以及一段长44个氨基酸的辅助序列，能结合到成熟肽上，起到稳定作用。gnrh氨基酸序列比对结果显示仅成熟多肽部分比较保守，在进化树分析中与无脊椎动物gnrh聚类为一支。其中，曼氏无针乌贼神经肽gnrh的基因cdna全序列为：acttcctttacactcgtccctcgcctaagacaaaagaacacttcaaatctccatcatcagctaaacatctaccagacagtgacatcatgtcaacctccacagcctcgtccagcctgagaagaatccaatttttcacctgtgctattcttcccctctctttctgcatgcatatccaggcacagaattaccattttagcaatggatggcaccccggtggtaaacgaagtggacttccagacatgcagtgtcatttcagaccacaaacaaaagctacaatcgagaaactcttagacgaggaaatcacacgtataattactacatgtaccaatacagtcaatgacatcgcagacttgcagtaatttttcacaggtcaagcaaattcactggatatacaactaccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。神经肽组织特异性表达分析操作为：选取处于ⅲ期、ⅳ期、ⅴ期3个不同发育阶段、体重健康、活力强的曼氏无针乌贼，迅速处死后取出各组织放入rna保存液中，雄性组织为：脑、视叶、肝、肌肉、精巢、心、鳃，雌性组织为：脑、视叶、肝、肌肉、卵巢、心、鳃、缠卵腺、副缠卵腺，置于-80～-100℃保存备用；用trizol试剂对曼氏无针乌贼的各组织提取总rna，使用试剂盒合成不同组织cdna，将曼氏无针乌贼β-actin基因(jn564496.1)作为内参基因，心脏的基因表达量作为参照标准，使用荧光定量pcr方法测定gnrh基因在不同发育阶段、不同组织中的特异性表达，荧光定量pcr方法具体操作如下：将八连管置于冰上，并加入以下反应体系：2×sybrpremixextaqtmⅱ10.0μl，cdna模板0.8μl，灭菌水7.2μl，rt-fmrf-f0.8μl，rt-fmrf-r0.8μl，roxreferencedyeⅱ0.4μl；混匀反应体系，轻微离心，将八连管置于pcr仪内，设定的程序为：94℃30s；94℃5s，60℃30s，40个循环；55-95℃逐渐升温2min，进行3次重复；使用2-△△ct方法测定不同组织gnrh基因的表达量水平，所用引物如表3所示；表3gnrh基因荧光定量pcr所用引物荧光定量pcr检测曼氏无针乌贼gnrh基因的mrna表达水平结果显示，gnrh基因在三个阶段的乌贼脑组织中均有显著表达。不同是的，在ⅲ期，gnrh在视叶中微量表达，在ⅴ期，gnrh在雌性乌贼卵巢、缠卵腺和副缠卵腺中微量表达。然而在成体剑尖枪乌贼中，半定量pcr被用来检测不同组织的gnrh表达水平，但结果显示仅在脑组织中扩增出pcr产物，雌性乌贼的卵巢与其他组织一样，均没有gnrh的表达。成体曼氏无针乌贼和真蛸也仅在雌性乌贼的脑和卵巢中有表达。神经肽脑组织表达定位分析：以乌贼脑组织cdna为模板进行pcr扩增，pcr扩增反应程序为：94℃2min；94℃20s，64℃40s，10个循环；94℃20s，62℃退火40s，15个循环；94℃20s，60℃30s，72℃30s，10个循环；72℃8min；电泳检测产物；将扩增得到的pcr产物进行切胶纯化、酶切、连接、转化和筛选，使用digrnalabelingkitsp6/t7试剂盒制备反义探针与正义探针；对曼氏无针乌贼完整脑组织切片进行原位杂交处理，拍片后封存。能特异性扩增曼氏无针乌贼gnrh基因的引物为：ish-gnrh-f：ccgtcacgtccatcatcaggtaaacatc、ish-gnrh-r：ccggaagggagtgatttcctcgtctaag；曼氏无针乌贼完整脑组织石蜡切片的制备步骤为：1)固定：将解冻后的乌贼脑组织样品浸泡在4％多聚甲醛中，4℃固定16h；pbs中漂洗5min；2)脱水：将脑组织分别在盛有70％、80％、90％、100％乙醇梯度的染色缸中脱水各1h，期间可更换一次试剂；3)透明：将脑组织转移至二甲苯：乙醇＝1:1中浸泡处理30min，然后浸入有机溶剂二甲苯中30min，使组织透明；4)浸蜡：先将脑组织转移至石蜡：二甲苯＝1:1中1h，后转移至石蜡中1h；5)包埋：事先预热金属盒，将已充分浸蜡的脑组织放入金属盒进行石蜡包埋；6)修块：将包埋好的蜡块进行修块；7)切片：将修好的蜡块置于石蜡切片机上切片，纵切，切片厚度为7μm；8)展片和烘片：42℃展片机上展片5min；50℃烘片机上烘片30min；可以将烘干的的石蜡切片置于-20℃冰箱保存备用；9)脱蜡：将切好的脑组织切片置于二甲苯脱蜡30min，期间更换一次试剂；10)复水：将脑组织分别在盛有100％、90％、80％、70％乙醇梯度的染色缸中复水各10min；pbs中漂洗10min，期间更换一次试剂；然后进行原位杂交，原位杂交步骤为：1)前处理：将脑组织石蜡切片浸入4％多聚甲醛固定10min；pbs漂洗10min；0.1mpbs/甘氨酸中5min；0.3％tritonx-100/pbs中15min；pbs漂洗，10min；2)通透处理：37℃，蛋白酶k溶液中处理20min；0.1m氨基酸/pbs冲洗1min；pbs漂洗10min；0.1m三乙醇胺(含0.25％醋酸铵)中10min；最后用盐溶液2×ssc漂洗10min；3)预杂交和杂交：45℃预杂交液孵育1h；46℃杂交液孵育6h；4)后处理：杂交液孵育后，4×ssc漂洗1min；37℃，2×ssc漂洗30min；1×ssc漂洗30min；5)抗体杂交：blocking缓冲液室温封闭1h；ap标记抗dig抗体(1:500)，37℃条件下，孵育1h；之后用pbs冲洗1min；6)显色：加入显色底物nbt/bcip，暗处显色30min-24h；depc水冲洗3min，最后用甘油封片，两天后拍照，保存。通过原位杂交方法进行曼氏无针乌贼gnrh基因mrna在脑组织中的表达位点的细胞定位，如图6所示，在乌贼脑组织的多个区域均能观察到清晰的gnrh基因mrna阳性杂交信号，而用正义探针进行杂交的图6a中不能观察到信号。在食道上神经团，脑亚脚叶和亚垂直叶(图6b)处的阳性杂交信号最为强烈，整个亚垂直叶边缘的髓质区域也均能观察到明显的杂交信号。在亚垂直叶上方的垂直叶(图6b)也能观察到阳性信号，但信号较弱。清晰的阳性信号在前基叶(图6c)和后基叶(图6d)同样能够观察到。在下额叶(图6c)中也能观察到经反义探针杂交染色而成的杂交信号，但上额叶(图6c)则没有观察到。食道下神经团的各个功能小叶：巨细胞叶、外套内脏叶、前色素细胞、足叶和腕叶(图6e)中杂交信号着色很深、信号非常强烈。在视叶(图6f)髓质区中亦能观察到清晰的杂交阳性信号，而皮质区则没有观测到阳性信号。通过对曼氏无针乌贼脑组织进行gnrh基因mrna的原位杂交实验，发现在乌贼脑组织3个主要组成部中，gnrh基因均有表达。在食道上神经团的脑亚脚叶、垂直叶、亚垂直叶、前基叶、后基叶和下额叶中能够观察到不同强度的阳性杂交信号。食道下神经团的巨细胞叶、外套内脏叶、前色素细胞叶、足叶和腕神经叶，以及视叶中也均能观察到有效的阳性杂交信号。与现有技术相比，本发明的优点在于：1)运用分子生物学手段分析了曼氏无针乌贼神经肽的基因序列、基因的组织表达特异性，并对其mrna在乌贼脑组织中的特异表达位点进行了细胞定位，研究数据可为以后深入研究头足类生殖调控机制提供一定的理论依据；2)以冷冻液保存曼氏无针乌贼脑组织，可实现高效的冷冻保存脑组织，有效防止乌贼脑组织液化、脑细胞自溶，其生物学特性能得以高效保存，冷冻保存的脑组织可直接用于组织分析，有助于神经肽的高效率、完整性提取；3)曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂被机体吸收后，通过受体机制对垂体促性腺细胞分泌卵泡刺激素、黄体生成素进行调控，最终引起细胞内gnrh受体合成、卵泡刺激素、黄体生成素合成和分泌、细胞生长、分化、增殖等生殖调控。附图说明图1是本发明中gnrh基因pcr电泳结果示意图；图2是本发明中5′race扩增电泳条带示意图；图3是本发明中3′race扩增电泳条带示意图；图4是本发明中gnrh基因cdna全长示意图；图5是本发明中gnrh不同组织表达特异性示意图；图6是本发明中gnrh基因mrna的脑组织原位杂交示意图。附图标记：图4中，预测的氨基酸序列显示在碱基序列下方，推测的信号肽序列用黑色下划线标出，预测的gnrh成熟肽用黑色双下划线标出，基本剪切位点用黑色双虚线标出，c-端酰胺化的甘氨酸用圆圈标示，辅助序列用黑色虚线划出，预测的起始密码子为atg、终止密码子为taa；图6中a：正义探针对照；b：亚垂直叶；c：下额叶；d：后基叶；e：食道下神经团；f：视叶；abl：前基叶；asem：前食道下神经团；msem：中食道下神经团；pbl：后基叶；psem：后食道下神经团；svl：亚垂直叶；黑色尖头指示阳性区域，黑色标尺表示长度1000μm。具体实施方式下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：实施例1：曼氏无针乌贼gnrh神经肽，其基因的cdna序列全长432bp，开放阅读框273bp，编码90个氨基酸，5′非编码区86bp，3′非编码区73bp。前体蛋白预测相对分子质量10.1kda，等电点pi为7.73。曼氏无针乌贼神经肽gnrh参与调控生殖活动的分子生物学分析步骤包括：神经肽基因克隆和序列分析、神经肽组织特异性表达分析、神经肽脑组织表达定位分析，具体包括以下步骤：神经肽基因克隆和序列分析：(1)提取总rna：1)取干净的离心管，用无rnaase枪头加入500μl4℃的trizol试剂，用depc水处理过的镊子夹取30mg解冻后的乌贼脑组织样品浸入trizol试剂，使用电动匀浆器匀浆30s，补加500μltrizol试剂，轻摇离心管，使脑组织充分溶解到trizol试剂中，室温静置5min；2)在离心管中加入200μl的氯仿，剧烈震荡15s后，室温静置5min，4℃、12000rpm条件下离心15min，取最上层的上清液于新离心管中；3)向离心管中加500μl的异丙醇，摇匀，室温静置10min，4℃、12000rpm条件下离心10min，除去上清液，在沉淀中加入1ml的75％的乙醇，用枪头吹吸沉淀；4)在4℃、7500rpm条件下离心5min，用枪头吸除液体部分，保留沉淀；室温静置约20min待rna呈半干的透明状态，用depc水溶解后备用。提取的总rna经测定其吸光度r值介于1.9-2.0之间，则说明总rna为有效；取3μl的rna液将其点样到1％的琼脂糖凝胶上，在200v、150ma的电泳仪下跑胶15-16min，取出胶在uvp紫外凝胶成像仪中分析rna条带情况，能够看到一条清晰的28s、18s且比例为1.9-2.1:1；则说明提取出的rna效果很好可以满足进一步操作的需求。(2)cdna第一链的合成：使用takara公司生产的m-mlv(rnaseh-)反转录试剂盒，利用曼氏无针乌贼脑组织提取的总rna进行cdna第一条链合成，具体操作步骤如下：1)在0.2ml离心管中加入5.0μl总rna、1.0μloligodt；2)混匀反应体系，离心，将离心管置于pcr仪内，70℃孵育10min后立刻冰上静置2min；3)在上述离心管中在加入以下反应体系：5×m-mlvbuffer2.0μl、dntpmixture(10mm)0.5μl、rnaseinhibitor(40u/μl)0.25μl、m-mlvrtase(200u/μl)0.25μl、depc处理水1.0μl；4)混匀反应体系，离心，将离心管置于pcr仪内，42℃孵育1小时，70℃孵育15min后，迅速冰上静置15min，将合成的cdna置于-20℃冰箱保存备用。(3)获取核心序列：1)pcr扩增：如表2所示，简并引物为gnrh-f和gnrh-r，以曼氏无针乌贼脑组织cdna作为模板进行gnrh基因核心片段的pcr扩增。pcr扩增反应体系如下：加样完成之后，pcr扩增程序如下：95℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃30s，35个循环；72℃12min。2)纯化、连接：用1％琼脂糖电泳检测pcr产物，找到符合预期大小的条带，用凝胶回收试剂盒进行割胶回收纯化，具体操作步骤如下：①跑胶，利用凝胶成像系统观察目的条带，找到条带后用干净的刀片将其切下，放入rnaasefree的1.5ml离心管中，称其重量，按每克胶加1mlsolutionⅰ的计算量，向装有胶块的离心管中加入solutionⅰ，56℃水浴10min，每2-3min震荡一次帮助加速溶解；②将含有琼脂糖胶的solutionⅰ混合液转移至离心柱中，10000rpm离心2min，若混合液过多，可分多次进行；收集的溶液，并将其移入吸附柱ac中，相同离心率条件下，离心1min，弃废液，后将离心柱放回收集管中；向吸附柱中加入700μl漂洗液，10000rpm离心1min，弃废液，将离心柱放回到收集管中；为尽可能地去除漂洗液，再次加入500μl漂洗液至吸附柱中，相同离心率条件下，离心1min，倒废液，将离心柱放回管中，离心1min；③换一个干净的收集管，在吸附膜的中间部位加30μldepc处理水，12000rpm条件下离心2繁殖，收集溶液；取4μl回收的dna检测，5μl用于连接，其余于-20℃保存。3)克隆：①pcr产物与pucm-t载体16℃连接过夜，之后与dh5α感受态混匀，冰上静置30min，42℃处理90s，迅速冰浴静置5min；加入1mllb液体培养基，将含有菌液的离心管置于恒温摇床中，37℃200rpm摇床1h；②将离心管从恒温摇床中取出，并置于离心机中，室温4000rpm离心5min，除去1ml上清液，枪头吹吸重悬菌体；③涂板，培养箱中37℃培养16h；④蓝白斑筛选，重新接种菌落，载体引物m13-f/m13-r进行克隆的阳性检测。筛选克隆的pcr体系如下：菌液送至上海生工测序。由于核心片段长度仅100bp左右，不适合进行切胶纯化，因此将pcr产物直接与pucm-t载体进行连接，并转化入dh5α感受态细菌中，培养、筛选后进行测序。(4)获取3′端cdna序列：1)制备race模板cdna：利用目的基因已知序列设计用于gnrh基因3′端race扩增的特异性引物3′-gnrh-outter和3′-gnrh-inner(见表2)，以3′-gnrh-outter和clontech公司生产的smarttmracecdnaamplificationkit试剂盒中自带的3′raceouterprimer和3′-gnrh-inner为引物；以曼氏无针乌贼脑组织总rna为模板，获得扩增3′race片段所需的模板cdna，操作根据试剂盒提供说明书进行，反应体系如下：①0.2ml离心管中加入以下反应体系：脑组织总rna1μg3′raceadapter1μldepc处理水补至5μl混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，70℃孵育2min后，快速移至冰上静置2min；②向①步骤中的反应液中加入以下反应体系：混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，42℃孵育1.5h后，70℃孵育7min，加入100μl灭菌水稀释产物。将稀释后的模板cdna置于-20℃保存。2)pcr扩增获得扩增3′race片段所需的模板cdna后，利用巢式pcr来扩增3′race未知片段，进行两轮巢式pcr反应扩增出gnrh基因3′端race片段序列，反应体系如下：①0.2ml离心管中加入以下反应体系：混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，反应程序为：94℃2min；94℃5s，66℃10s，72℃3min，20个循环；72℃延伸5min；②将①中扩增产物用作此轮模板，0.2ml离心管中加入以下反应体系：混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，反应程序为：94℃2min；94℃5s，65℃12s，72℃3min，20个循环；72℃6min；电泳检测pcr产物；扩增产物经过琼脂凝胶电泳后在成像系统中的条带如图2，3′race产物为267bp条带；③将pcr产物进行切胶回收和克隆连接，并将阳性克隆送至上海生工测序。(5)获取5′端cdna序列：1)制备race模板cdna：利用目的基因已知序列设计用于gnrh基因5′端race扩增的特异性引物5′-gnrh-outter和5′-gnrh-inner(见表2)，以5′-gnrh-outter、5′-gnrh-inner和clontech公司生产的smarttmracecdnaamplificationkit试剂盒中自带的5′raceouterprimer、5′raceinnerprimer为引物；以曼氏无针乌贼脑组织总rna为模板，获得扩增5′race片段所需的模板cdna后，操作根据试剂盒提供说明书进行，反应体系如下：①0.2ml离心管中加入以下反应体系：脑组织总rna1μg5′raceadapter1μldepc处理水补至15.5μl混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，70℃孵育10min后，快速移至冰上静置2min。②向①步骤中的反应液中加入以下反应体系：混匀反应液，轻微离心，将离心管置于pcr内，42℃孵育1min；加入1μl的sperscripttmⅱrt，42℃孵育50min后，70℃孵育15min；加入1μl的rnasemix，37℃孵育30min；③纯化cdna：加入120μl的solutionⅰ至cdna中，将混合液移至离心柱中，在10000rpm离心率条件下，离心30s，将离心柱取中，吸出液体；加入350μl的solutionⅱ，12000rpm离心20s，除上清，重复2次；70％乙醇洗涤2次；12000rpm离心60s，除乙醇；更换离心管，向离心柱中加入50μl灭菌水，相同离心率条件下，离心60s，便可获得纯化产物；④加尾反应，反应体系如下：混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，94℃孵育3min后，迅速冰上静置1min；加入1μl的tdt；37℃孵育10min，65℃热激tdt10min；加入100μl灭菌水稀释产物。将稀释后的模板cdna置于-20℃保存。2)pcr扩增：获得扩增5′race片段所需的模板cdna后，利用巢式pcr来扩增5′race未知片段，进行两轮巢式pcr反应扩增出gnrh基因5′端race片段序列，反应体系如下：①0.2ml离心管中加入以下反应体系：混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，反应程序为：94℃2min；94℃30s，62℃35s，72℃45s，32个循环；72℃8min；②将①中扩增产物用作此轮模板，0.2ml离心管中加入以下反应体系：混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸8min；电泳检测pcr产物；扩增产物经过琼脂凝胶电泳后在成像系统中的条带如图3，5′race产物为289bp条带。③将pcr产物进行切胶回收和克隆连接，并将阳性克隆送至上海生工测序。(6)序列信息分析：使用lasergene软件对gnrh的3′端、5′端和核心片段序列进行拼接，获得曼氏无针乌贼gnrh基因的cdna全长序列。predictprotein、scratchproteinpredictor等在线工具可用来对gnrh基因进行开放阅读框(orf)预测，以及推测该orf所编码的氨基酸序列；应用在线分析站点signalpv3.0对氨基酸序列进行信号肽预测；应用ncbi对氨基酸序列进行blast(blastxandblastn)分析，应用clustalw2对gnrh及其同源基因的氨基酸序列进行比对分析；gnrh前体蛋白相对分子质量同等电点的估算使用的是expasy-protparam在线分析软件，使用megav5.0软件进行基于nj法的进化树构建，重复1000次循环。经分析，曼氏无针乌贼gnrh基因cdna序列全长432bp，开放阅读框273bp，编码90个氨基酸，5′非编码区86bp，3′非编码区73bp。前体蛋白预测相对分子质量为10.1kda，等电点pi为7.73。根据其他3种已知的头足类gnrh序列推测，曼氏无针乌贼成熟肽产物同其他2种已知的头足类一样为十二肽：pqnyhfsngwhpg(如图4所示)。通过对前体蛋白氨基酸序列进行信号肽预测分析发现，gnrh前体蛋白的n端含有一段长31个氨基酸的信号肽，gnrh成熟肽序列c端含有一个剪切位点以及一段长44个氨基酸的辅助序列，能结合到成熟肽上，起到稳定作用。从ncbi数据库中获取其他物种的gnrh基因序列，通过clustalw2在线分析工具对曼氏无针乌贼gnrh氨基酸序列同其他物种的同源序列进行比对。对选取的同源序列通过mega5.0软件进行进化树的构建。同源比对结果显示，曼氏无针乌贼gnrh与曼氏无针乌贼相似度为90％，与剑尖枪乌贼和真蛸gnrh相似度分别为86％和71％，和太平洋牡蛎、虾夷扇贝、海蜗牛相似度分别为47％、41％、31％，序列中成熟肽部分非常保守。神经肽组织特异性表达分析：按照卵子发生和卵巢发育阶段划分，取处于ⅲ期、ⅳ期、ⅴ期3个不同发育阶段、体重健康、活力强的曼氏无针乌贼，体重为700-1000g，快速杀死乌贼，立即取出各种组织放入rna保存液中，-80℃保存备用；组织包括，雄性乌贼：脑、视叶、肝、肌肉、精巢、心、鳃；雌性乌贼：脑、视叶、肝、肌肉、卵巢、心、鳃、缠卵腺、副缠卵腺。以曼氏无针乌贼gnrh基因cdna序列全长为基础，使用primer5.0软件及primer3.0在线引物搜索工具，设计gnrh基因荧光定量pcr操作所需引物为rt-gnrh-f：acttcctttacactcgtccct；rt-gnrh-r：agggtgccatccattgctaa；rt-actin-f：tgagagggagattgtgcgtg；rt-actin-r：gaacatagattctggagcacgg。神经肽组织特异性表达分析具体步骤包括：(1)荧光定量pcr：使用相对定量方法分别检测三个不同发育阶段雌、雄性别曼氏无针乌贼gnrh基因不同组织的表达特异性，将曼氏无针乌贼β-actin基因(jn564496.1)作为内参基因，心脏的基因表达量作为参照标准，荧光定量pcr操作按照sybrpremixextaqtmⅱkit(tlirnasehplus)试剂盒说明书进行。将八连管置于冰上，并加入以下反应体系：混匀反应体系，轻微离心，将八连管置于pcr仪内，设定的程序为：94℃30s；94℃5s，60℃30s，40个循环；55-95℃逐渐升温2min，进行3次重复；(2)数据处理：标准曲线，ct值等由abi7500realtimepcr仪自带的abi7500realtimepcrsystemdetection软件自动完成，使用2-△△ct方法测定不同组织lfrfamide基因的表达量水平，使用spss18.0统计软件的单因素方差分析(onewayanova)功能进行方差分析，duncan法多重比较检验组间差异的显著性，p＜0.05检查差异显著，数据统计并分析后，使用sigmaplot12.5软件来制作相关柱形图。取雌、雄性曼氏无针乌贼各组织检测gnrh基因表达如图5所示，荧光定量pcr检测曼氏无针乌贼gnrh基因的mrna表达水平结果显示，gnrh基因在三个阶段的乌贼脑组织中均有显著表达。不同是的，ⅲ期时，gnrh在视叶中微量表达；ⅴ期时，gnrh在雌性乌贼卵巢、缠卵腺和副缠卵腺中微量表达。然而在成体剑尖枪乌贼中，半定量pcr被用来检测不同组织的gnrh表达水平，但结果显示仅在脑组织中扩增出pcr产物，雌性乌贼的卵巢与其他组织一样，均没有gnrh的表达。成体曼氏无针乌贼和真蛸也仅在雌性乌贼的脑和卵巢中有表达。神经肽脑组织表达定位分析：以曼氏无针乌贼gnrh基因cdna序列全长为基础，使用primer5.0软件及primer3.0在线引物搜索工具设计gnrh原位杂交所需引物，最终确定能特异扩增曼氏无针乌贼gnrh基因的引物ish-gnrh-f：ccgtcacgtccatcatcaggtaaacatc和ish-gnrh-r：ccggaagggagtgatttcctcgtctaag。具体包括以下步骤：(1)制备石蜡切片：1)固定：将乌贼脑组织浸泡在4％多聚甲醛中，4℃固定16小时；pbs中漂洗5min；2)脱水：将脑组织分别在盛有50％、60％、70％、80％、90％、100％梯度乙醇溶液的染色缸中脱水各1小时；3)透明：将脑组织转移至二甲苯、乙醇等比例混合液中浸泡处理30min，然后转移至二甲苯中浸泡处理30min，使组织透明；4)浸蜡：先将脑组织转移至石蜡、二甲苯等比例混合液中浸泡处理1小时，后转移至石蜡中浸泡处理1小时；5)包埋：事先预热金属盒，将已充分浸蜡的脑组织放入金属盒进行石蜡包埋；6)修块：将包埋好的蜡块进行修块；7)切片：将修好的蜡块置于石蜡切片机上切片，纵切，切片厚度为7μm；8)展片和烘片：42℃展片机上展片5min；50℃烘片机上烘片30min；将烘干的石蜡切片置于-20℃冰箱保存备用；9)脱蜡：将切好的脑组织切片置于二甲苯中浸泡脱蜡30min，期间更换一次试剂；10)复水：将脑组织分别在盛有100％、90％、80％、70％、60％、50％梯度乙醇溶液的染色缸中复水各10min；pbs中漂洗10min，期间更换一次试剂。(2)制备杂交探针模板：根据gnrh的cdna序列设计引物ish-gnrh-f、ish-gnrh-r，以乌贼脑组织cdna为模板进行pcr扩增，pcr产物用作原位杂交探针模板的制备，在探针的制备过程中使用的酶是限制性内切酶accⅰ和hindⅲ。探针模板的pcr扩增，反应体系如下：混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，反应程序为：94℃2min；94℃20s，64℃40s，10个循环；94℃20s，62℃退火40s，15个循环；94℃20s，60℃30s，72℃30s，10个循环；72℃8min，电泳检测产物；(3)目的片段和载体的酶切、连接、转化和筛选：1)对扩增得到的pcr产物进行切胶纯化，纯化后使用限制性内切酶accⅰ和hindⅲ在0.2ml离心管中进行双酶切，酶切体系如下：混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，37℃孵育8小时；pspt18亦采用ecorⅰ和hindⅲ进行双酶切，酶切体系同上；2)pcr产物和pspt18酶切产物使用e.z.n.a.tmgelextractionkit(50)试剂盒再次进行切胶纯化后，使用takara公司生产的solutionⅰ进行连接，连接体系如下：gnrh序列片段2.0μlpspt183.0μl灭菌水5.0μl3)转化至dh5α感受态后，涂板，单个挑取合适的菌落，菌体扩大培养；使用d6942-01型plasmidminikiti(100)质粒提取试剂盒抽提质粒；提取的质粒保存于-20℃冰箱，并送至上海生工进行测序，检测插入序列的正确性；将正确的重组质粒进行ecorⅰ单酶切，单酶切反应体系如下：4)混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，37℃孵育5小时后，用酚/氯仿重新抽提产物，并用乙醇沉淀，将沉淀重溶于15μldepc处理水中，取2μl电泳检测。(4)制备探针：使用digrnalabelingkitsp6/t7试剂盒制备反义探针：1)0.2ml离心管中加入以下反应体系：混匀反应体系，少许离心，将离心管置于pcr仪内，37℃孵育2小时，加入2.0μledta终止反应；2)向离心管中加入75μl预冷无水乙醇，混匀反应液，-20℃静置3小时；在4℃、12000rpm/min条件下离心15min，除去上清液；3)加入100μl70％乙醇，枪头吹吸，在4℃、7500rpm/min条件下离心5min，除去上清，加入50μldepc处理水，取2μl用于电泳检测，余量保存至-20℃冰箱备用；4)正义探针制备体系如下：反义探针的制备步骤同正义探针。(5)原位杂交：1)前处理：将脑组织石蜡切片浸入4％多聚甲醛溶液中固定10min，以pbs漂洗10min，0.1mpbs/甘氨酸中5min，0.3％tritonx-100/pbs中15min，以pbs漂洗10min；2)通透处理：37℃温度下，将切片在蛋白酶k溶液中处理20min，0.1mpbs/甘氨酸冲洗1min，pbs漂洗10min，0.1m三乙醇胺(含0.25％醋酸铵)中10min，最后用盐溶液2×ssc漂洗10min；3)预杂交和杂交：45℃预杂交液中孵育1小时；46℃杂交液孵育6小时；4)后处理：杂交液孵育后，4×ssc漂洗1min，37℃，2×ssc漂洗30min，1×ssc漂洗30min；5)抗体杂交：以blocking缓冲液室温封闭1小时，ap标记抗dig抗体(1:500)37℃条件下孵育1小时，之后用pbs冲洗1防止；6)显色：加入显色底物nbt/bcip，暗处显色30min-24h，depc水冲洗3min，最后用甘油封片，两天后拍照，保存。通过原位杂交方法进行曼氏无针乌贼gnrh基因mrna在脑组织中的表达位点的细胞定位，结果如图6所示。在乌贼脑组织的多个区域均能观察到清晰的gnrh基因mrna阳性杂交信号，在食道上神经团，脑亚脚叶和亚垂直叶(图6b)处的阳性杂交信号最为强烈，整个亚垂直叶边缘的髓质区域也均能观察到明显的杂交信号；在亚垂直叶上方的垂直叶(图6b)也能观察到阳性信号，但信号较弱；在前基叶(图6c)和后基叶(图6d)同样能够观察到清晰的阳性信号，在下额叶(图6c)中也能观察到经反义探针杂交染色而成的杂交信号，但上额叶(图6c)则没有观察到。食道下神经团的各个功能小叶：巨细胞叶、外套内脏叶、前色素细胞、足叶和腕叶(图6e)中杂交信号着色很深、信号非常强烈。在视叶(图6f)髓质区中亦能观察到清晰的杂交阳性信号，而皮质区则没有观测到阳性信号。说明gnrh神经肽在曼氏无针乌贼生殖调控中发挥了重要的作用。实施例2：一种曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂，其制备方法包括：预处理、分离、复合，具体包括以下步骤：预处理：选取性成熟、活力较强的曼氏无针乌贼个体置于冰上，低温条件下取乌贼脑组织，并小心剥离神经组织周围的结蹄组织，将乌贼脑组织置于保存液中，并于-80℃超低温冷冻保存；将解冻后的乌贼脑组织放入离心管中，每50只乌贼脑组织加入20ml1.0‰三氟乙酸水溶液，高速匀浆5min，2℃温度下以15000r/min离心25min，取上清液，浓缩至1/2体积后以0.45μm针头过滤器过滤，滤液在保存；预处理阶段不仅可以较好的保存离体脑组织，较大程度地保留曼氏无针乌贼脑组织的活性，而且通过将脑组织匀浆入三氟乙酸水溶液并离心分离，可以去除多余的脂肪、灰分等杂质，获得脑组织粗提液；分离：将脑组织粗提液通过rp-hplc高效液相系统进行分级分离，采用二元流动相梯度洗脱系统进行洗脱分离，分离流动相a为1‰三氟乙酸水溶液，流动相b为1‰三氟乙酸乙腈水溶液，流速为1ml/min，进样量为150μl，检测波长为238nm和214nm处，柱温为25℃，所用流动相均经超声处理，收集每min分离组分，收集组分浓缩后于-40℃保存得神经肽gnrh；rp-hplc技术与其他液相方法不同，由于以组分之间极性差异为依据进行分离，因此可以进行分子量和结构十分接近组分的分离，而且分离过程中不受分子量大小限制，因此特别适用于低分子量多肽的分离纯化，同时不会影响多肽的结构与性质；复合：将神经肽gnrh与神经肽gnrh类似物在10-樟脑磺酸与金属镧存在的条件下发生反应，即得曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂；曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂被机体吸收后，通过受体机制对垂体促性腺细胞分泌卵泡刺激素、黄体生成素进行调控，在整个细胞信号传导过程中，它与g蛋白结合受体家族gp结合，导致一系列不同信号在细胞内传导，并最终引起细胞内gnrh受体合成、卵泡刺激素、黄体生成素合成和分泌、细胞生长、分化、增殖等生殖调控。冷冻液为：二甲基亚砜2.0g/l、乙酰胺1.5g/l、1,2-丙二醇1.0g/l、聚乙二醇-8000.6g/l、色甘酸钠0.1g/l、还原性谷胱甘肽0.02g/l、磷酸盐缓冲液、卵磷脂3.5g/l、苯甲酸盐1g/l、硝酸钠10g/l、丙三醇5g/l、青霉素200iu/ml、链霉素150iu/ml，余量为双蒸水；以冷冻液保存曼氏无针乌贼脑组织，可实现高效的冷冻保存脑组织，有效防止乌贼脑组织液化、脑细胞自溶，其生物学特性能得以高效保存，冷冻保存的脑组织可直接用于组织分析，有助于神经肽的高效率、完整性提取。实施例3：一种曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂，其制备方法包括：预处理、分离、复合，具体包括以下步骤：预处理：选取性成熟、活力较强的曼氏无针乌贼个体置于冰上，低温条件下取乌贼脑组织，并小心剥离神经组织周围的结蹄组织，将乌贼脑组织置于保存液中，并于-100℃超低温冷冻保存；将解冻后的乌贼脑组织放入离心管中，每60只乌贼脑组织加入25ml1.0‰三氟乙酸水溶液，高速匀浆6min，4℃温度下以18000r/min离心30min，取上清液，浓缩至2/5体积后以0.45μm针头过滤器过滤，滤液在保存；预处理阶段不仅可以较好的保存离体脑组织，较大程度地保留曼氏无针乌贼脑组织的活性，而且通过将脑组织匀浆入三氟乙酸水溶液并离心分离，可以去除多余的脂肪、灰分等杂质，获得脑组织粗提液；分离：将脑组织粗提液通过rp-hplc高效液相系统进行分级分离，采用二元流动相梯度洗脱系统进行洗脱分离，分离流动相a为1‰三氟乙酸水溶液，流动相b为1‰三氟乙酸乙腈水溶液，流速为1ml/min，进样量为150μl，检测波长为238nm和214nm处，柱温为25℃，所用流动相均经超声处理，收集每min分离组分，收集组分浓缩后于-55℃保存得神经肽gnrh；rp-hplc技术与其他液相方法不同，由于以组分之间极性差异为依据进行分离，因此可以进行分子量和结构十分接近组分的分离，而且分离过程中不受分子量大小限制，因此特别适用于低分子量多肽的分离纯化，同时不会影响多肽的结构与性质；复合：将神经肽gnrh与神经肽gnrh类似物在10-樟脑磺酸与金属镧存在的条件下发生反应，即得曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂；曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂被机体吸收后，通过受体机制对垂体促性腺细胞分泌卵泡刺激素、黄体生成素进行调控，在整个细胞信号传导过程中，它与g蛋白结合受体家族gp结合，导致一系列不同信号在细胞内传导，并最终引起细胞内gnrh受体合成、卵泡刺激素、黄体生成素合成和分泌、细胞生长、分化、增殖等生殖调控。冷冻液为：二甲基亚砜2.05g/l、乙酰胺1.55g/l、1,2-丙二醇1.1g/l、peg-8000.7g/l、色甘酸钠0.12g/l、还原性谷胱甘肽0.05g/l、卵磷脂6.5g/l、苯甲酸盐10g/l、硝酸钠20g/l、丙三醇10g/l、青霉素220iu/ml、链霉素180iu/ml、75mg/l的赤藓糖、18mg/l的(s)-乳酸乙酯，以磷酸盐缓冲液调整ph为7.25，余量为双蒸水；以冷冻液保存曼氏无针乌贼脑组织，可实现高效的冷冻保存脑组织，有效防止乌贼脑组织液化、脑细胞自溶，其生物学特性能得以高效保存，冷冻保存的脑组织可直接用于组织分析，有助于神经肽的高效率、完整性提取；特定配比的赤藓糖与(s)-乳酸乙酯具有协同增益作用，该增益作用可以使(s)-乳酸乙酯与脑细胞细胞膜中的糖类发生交联缔结，而且(s)-乳酸乙酯的羟基能够替代蛋白质表面上水的羟基，使蛋白质表面形成一层“水层”，这样就可以保护(s)-乳酸乙酯与糖类的交联缔结位置不直接暴露在周围环境中，该交联缔结可改变细胞膜表面的微环境，可以降低水分子扩散至细胞外，从而防止脑组织失水，降低脑组织细胞皱缩；同时，赤藓糖可以在蛋白质之间产生位阻，能更好地抑制冰晶的形成，控制冷冻过程中脑组织ph值的变化，从而保证了脑组织的天然结构、功能的完整性与冷冻时脑组织的稳定性，延长脑组织活性，保持乌贼神经肽的生殖调控活性，生殖调控饲料添加剂能有效发挥促进细胞生长、分化、增殖等生殖调控作用；在保持乌贼神经肽的生殖调控活性的前提下，添加添加赤藓糖、(s)-乳酸乙酯的保存液相较于未添加赤藓糖、(s)-乳酸乙酯的保存液，其保存期限可以延长35％以上，仍然具有较高的生殖调控功能。将实施例2、实施例3中的曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂以2％的比例混合人工饲料投喂给真蛸亲体，同时以纯人工饲料投喂真蛸亲体作为对照组，统计亲体增重、产卵数与幼体孵出情况，结果如表4所示。表4实施例1-3与对照组的强化饲养统计数据项目对照实施例2实施例3雌蛸初始重量(g)886±84826±65795±50雌蛸最终重量(g)996±79946±102933±50雌蛸增重(％)12.414.517.4强化天数50±750±750±7族群数404040单体产卵数40±1540±1840±14总卵数106510581122受精卵个数7649561105卵湿重0.21±0.040.25±0.020.25±0.04幼体个数6529421056幼体湿重0.109±0.0030.124±0.0040.128±0.002幼体孵化10日后存活率(％)879397由表4可以看出，无论在雌蛸增重、单体产受精卵个数，还是在受精卵质量、幼体体重、幼体成活率等方面，本发明方法中的亲体营养强化饵料都强于对照组的普通人工饲料，特别地，实施例3中的受精卵质量、幼体体重、幼体成活率明显优于实施例2。本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>浙江海洋大学<120>一种曼氏无针乌贼神经肽生殖调控饲料添加剂<160>22<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>432<212>dna<213>曼氏无针乌贼(sepiellamaindroniderochebrune)<400>1acttcctttacactcgtccctcgcctaagacaaaagaacacttcaaatctccatcatcag60ctaaacatctaccagacagtgacatcatgtcaacctccacagcctcgtccagcctgagaa120gaatccaatttttcacctgtgctattcttcccctctctttctgcatgcatatccaggcac180agaattaccattttagcaatggatggcaccccggtggtaaacgaagtggacttccagaca240tgcagtgtcatttcagaccacaaacaaaagctacaatcgagaaactcttagacgaggaaa300tcacacgtataattactacatgtaccaatacagtcaatgacatcgcagacttgcagtaat360ttttcacaggtcaagcaaattcactggatatacaactaccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa420aaaaaaaaaaaa432<210>2<211>20<212>dna<213>人工合成(saccharum)<400>2cagacncaagcacaraayta20<210>3<211>19<212>dna<213>人工合成(saccharum)<400>3tytctatcaaagcytttgt19<210>4<211>20<212>dna<213>人工合成(saccharum)<400>4ttaccaccagggtgccatcc20<210>5<211>20<212>dna<213>人工合成(saccharum)<400>5ttgctaaaatggtaattctg20<210>6<211>28<212>dna<213>人工合成(saccharum)<400>6cacctgtgctattcttcccctctctttc28<210>7<211>25<212>dna<213>人工合成(saccharum)<400>7tgcatatccaggcacagaattacca25<210>8<211>18<212>dna<213>人工合成(saccharum)<400>8tgtaaaacgacggccagt18<210>9<211>18<212>dna<213>人工合成(saccharum)<400>9caggaaacagctatgacc18<210>10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