本发明属于药物检测
技术领域：
，具体涉及一种硝呋太尔制霉素阴道软胶囊的微生物限度检查方法。
背景技术：
：细菌性阴道炎病症为白带增多，有腥臭味，性交后加重，可伴有外阴瘙痒或烧灼感。但10％～40％的患者并无任何症状，只是在体检中才被发现。念珠菌性阴道炎病症为外阴瘙痒，外阴及阴道灼痛，白带增多呈豆腐渣样，有时伴有尿频、尿痛，性交痛，妇科检查时可见小阴唇内侧及阴道粘膜上附着白色膜状物，擦除后露出红肿粘膜面，急性期可见受损的糜烂面。硝呋太尔制霉素阴道软胶囊，适应症为细菌性阴道病、滴虫性阴道炎、念珠菌性外阴阴道炎、阴道混合感染。硝呋太尔为硝基呋喃类衍生物，具有广谱抗微生物作用，对滴虫、细菌、白色念珠菌等均具有活性。关于硝呋太尔制霉素阴道软胶囊的微生物限度检查方法至今尚未有报道。技术实现要素：本发明的目的是提供一种硝呋太尔制霉素阴道软胶囊的微生物限度检查方法，解决硝呋太尔制霉素阴道软胶囊微生物检验中的假阴性现象，患者用药安全性高。本发明所述的硝呋太尔制霉素阴道软胶囊的微生物限度检查方法，步骤如下：(1)菌液制备分别制备金黄色葡萄球菌菌悬液、铜绿假单胞菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液；(2)供试液制备称取硝呋太尔制霉素阴道软胶囊供试品10g，用无菌剪刀剪碎置于无菌均质袋中，加80ml的43℃无菌十四烷酸异丙酯，用均质器拍打1min，倒入无菌三角瓶中，胶囊壳留在无菌均质袋中加入50ml的43℃ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液用手把胶囊壳揉碎，再倒入三角瓶中震摇后，加入43℃ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液350ml震摇静置5分钟，用无菌注射器吸取上层十四烷酸异丙酯和供试品混合的溶液弃去，再用无菌注射器加无菌溶出仪针取水层240-260ml移入无菌三角瓶中，作为1：40的供试液；(3)需氧菌、霉菌和酵母菌总数的测定需氧菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉，霉菌为黑曲霉，酵母菌为白色念珠菌。①试验组：取1:40供试液1ml，置43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，经薄膜过滤法处理，在最后一次过滤时分别加入金黄色葡萄球菌菌悬液、铜绿假单胞菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液，取下滤膜贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上置30-35℃培养箱中培养3天；另外再将分别加入白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液的滤膜贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基上置20-25℃培养箱中培养5天；②菌液组：取ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，按试验组操作加入菌液，测定所加的菌液的菌数；③供试品组：取制备好的供试液，以ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液，其他同试验组操作；胰酪大豆胨琼脂培养基上置30-35℃培养箱中培养5天；沙氏葡萄糖琼脂培养基上置20-25℃培养箱中培养7天；④培养后进行需氧菌、霉菌和酵母菌总数的测定，试验组菌落数减去供试品组菌落数的值与菌液组菌落数的比值在0.5～2范围内即为合格；(4)控制菌的检查①金黄色葡萄球菌的检查供试品组：取1：40供试液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入100mltsb培养基，混匀，30～35℃培养18～24小时，得到培养物；取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定供试品未检出金黄色葡萄球菌；阳性对照组：取1：40供试液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤加入100mltsb培养基，加入金黄色葡萄球菌混匀，30～35℃培养18～24小时，得到培养物；取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定阳性对照组未检出金黄色葡萄球菌；阴性对照组：取ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入100mltsb培养基，混匀，30～35℃培养18～24小时，得到培养物；取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定阴性对照组未检出金黄色葡萄球菌；②铜绿假单胞菌的检查供试品组：取1：40供试液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入100mltsb培养基，混匀，30～35℃培养18～24小时，得到培养物；取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定供试品未检出铜绿假单胞菌；阳性对照组：取1：40供试液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入100mltsb培养基中，加入铜绿假单胞菌混匀，30～35℃培养18～24小时，得到培养物；取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定阳性对照组未检出铜绿假单胞菌；阴性对照组：取ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入100mltsb培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时，得到培养物；取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定阴性对照组未检出铜绿假单胞菌；③白色念珠菌的检查供试品组：取供试液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入500ml沙氏葡萄糖液体培养基中，混匀，30～35℃培养3～5天，得到培养物；取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养24～48小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定供试品未检出白色念珠菌；阳性对照组：取供试液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入500ml沙氏葡萄糖液体培养基中，加入白色念珠菌混匀，30～35℃培养3～5天，得到培养物；取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养24～48小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定阳性对照组未检出白色念珠菌；阴性对照组：取ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入500ml沙氏葡萄糖液体培养基中，混匀，30～35℃培养3～5天，得到培养物；取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养24～48小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定阴性对照组未检出白色念珠菌。步骤(1)中金黄色葡萄球菌菌悬液的制备方法是取经30～35℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。步骤(1)中铜绿假单胞菌菌悬液的制备方法是取经30～35℃培养18～24小时的铜绿假单胞菌新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。步骤(1)中枯草芽孢杆菌菌悬液的制备方法是取经30～35℃培养18～24小时的枯草芽孢杆菌新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。步骤(1)中白色念珠菌菌悬液的制备方法是取经20～25℃培养2～3天的白色念珠菌新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。步骤(1)中黑曲霉孢子悬液的制备方法是取经20～25℃培养5～7天的黑曲霉的新鲜培养物，加3～5ml含0.05％聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数为50～100cfu的孢子悬液。本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：本发明样品处理能够更好的消除硝呋太尔，减少抑菌性，操作过程简单，污染的几率小，防止样品在检验过程中假阴性的出现，患者用药安全性高。具体实施方式以下结合实施例对本发明做进一步描述。实施例1(1)菌液制备①金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌取经30～35℃培养18～24小时的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。②白色念珠菌取经20～25℃培养2～3天的白色念珠菌新鲜培养物，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。③黑曲霉取经20～25℃培养5～7天的黑曲霉的新鲜培养物，加3～5ml含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数为50～100cfu的孢子悬液。(2)供试液制备称取硝呋太尔制霉素阴道软胶囊供试品10g，用无菌剪刀剪碎置于无菌均质袋中，加80ml的43℃无菌十四烷酸异丙酯，用均质器拍打1min，倒入无菌三角瓶中，胶囊壳留在无菌均质袋中加入50ml的43℃ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液用手把胶囊壳揉碎，再倒入三角瓶中震摇后，加入43℃ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液350ml震摇静置5分钟，用无菌注射器吸取上层十四烷酸异丙酯和供试品混合的溶液弃去，再用无菌注射器加无菌溶出仪针取水层240-260ml移入无菌三角瓶中，作为1：40的供试液；(3)需氧菌、霉菌和酵母菌总数的测定①试验组：取1:40供试液1ml，置43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，经薄膜过滤法处理，在最后一次过滤时分别加入金黄色葡萄球菌菌悬液、铜绿假单胞菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液，取下滤膜贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上置30-35℃培养箱中培养3天，计数结果见表1；另外再将分别加入白色念珠菌菌悬液和黑曲霉孢子悬液的滤膜贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基上置20-25℃培养箱中培养5天，计数结果见表5；②菌液组：取ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，按试验组操作加入菌液，测定所加的菌液的菌数；胰酪大豆琼脂培养基上的菌数见表3，沙氏葡萄糖琼脂培养基上的菌数见表6。③供试品组：取制备好的供试液，以ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液，其他同试验组操作；胰酪大豆胨琼脂培养基上置30-35℃培养箱中培养5天，计数结果见表2；沙氏葡萄糖琼脂培养基上置20-25℃培养箱中培养7天，计数结果见表2；④培养后进行需氧菌、霉菌和酵母菌总数的测定，试验组菌落数减去供试品组菌落数的值与菌液组菌落数的比值在0.5～2范围内即为合格；测定结果见表4、表7。需氧菌、霉菌和酵母菌的比值均在0.5～2范围内，检测供试品合格。表1需氧菌试验组结果(单位：cfu)表2供试品组结果(单位：cfu)需氧菌(1:40)霉菌和酵母菌(1:40)00表3需氧菌菌液组结果(单位：cfu)表4需氧菌比值表5霉菌和酵母菌试验组结果(单位：cfu)白色念珠菌黑曲霉7151表6霉菌和酵母菌菌液组结果(单位：cfu)白色念珠菌黑曲霉7049表7霉菌和酵母菌比值白色念珠菌黑曲霉1.011.04(4)控制菌的检查①金黄色葡萄球菌的检查供试品组：取1：40供试液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入100mltsb培养基，混匀，30～35℃培养18～24小时，得到培养物；取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定供试品未检出金黄色葡萄球菌；阳性对照组：取1：40供试液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤加入100mltsb培养基，加入金黄色葡萄球菌混匀，30～35℃培养18～24小时，得到培养物；取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定阳性对照组未检出金黄色葡萄球菌；阴性对照组：取ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入100mltsb培养基，混匀，30～35℃培养18～24小时，得到培养物；取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定阴性对照组未检出金黄色葡萄球菌；金黄色葡萄球菌检查结果见表8。②铜绿假单胞菌的检查供试品组：取1：40供试液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入100mltsb培养基，混匀，30～35℃培养18～24小时，得到培养物；取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定供试品未检出铜绿假单胞菌；阳性对照组：取1：40供试液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入100mltsb培养基中，加入铜绿假单胞菌混匀，30～35℃培养18～24小时，得到培养物；取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定阳性对照组未检出铜绿假单胞菌；阴性对照组：取ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入100mltsb培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时，得到培养物；取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定阴性对照组未检出铜绿假单胞菌；铜绿假单胞菌检查结果见表9。③白色念珠菌的检查供试品组：取供试液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入500ml沙氏葡萄糖液体培养基中，混匀，30～35℃培养3～5天，得到培养物；取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养24～48小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定供试品未检出白色念珠菌；阳性对照组：取供试液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入500ml沙氏葡萄糖液体培养基中，加入白色念珠菌混匀，30～35℃培养3～5天，得到培养物；取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养24～48小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定阳性对照组未检出白色念珠菌；阴性对照组：取ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的ph7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500ml中，用薄膜过滤器全部过滤，加入500ml沙氏葡萄糖液体培养基中，混匀，30～35℃培养3～5天，得到培养物；取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养24～48小时；若平板上没有菌落或鉴定结果为阴性，判定阴性对照组未检出白色念珠菌。白色念珠菌检查结果见表10。表8金黄色葡萄球菌检查结果供试品组阳性对照组阴性对照组-+-表9铜绿假单胞菌检查结果供试品组阳性对照组阴性对照组-+-表10白色念珠菌检查结果供试品组阳性对照组阴性对照组-+-当前第1页12