本发明属于生态安全
技术领域：
，涉及一种废旧胶粒填充基质对机场土壤中真菌多样性的调控方法。
背景技术：
：土壤真菌作为土壤微生物区系重要组成成分，与其他微生物共同推动着土壤生态系统的能量的流动与物质的循环，维持生态系统正常运转。首先，土壤真菌分解有机物为有效的营养形式供植物体吸收利用，利于植物生长，同时真菌死亡，降解和被动物取食后释放大量的营养元素。其次，土壤真菌参与土壤腐殖质化和矿质化，对形成腐殖质和土壤团粒结构起重要作用，从而达到改善土壤结构，稳定地表的作用。再次，近年来，大量研究表明许多土壤真菌可用于植物病、虫害的生物防治，例如，张海军等人采用绿色木霉gy20与棉花枯萎病菌f12进行平皿对峙培养时发现对峙培养中木霉菌株gy20对棉花枯萎病的抑制作用显著。某些真菌还能降解苯、乙苯(btex)、甲苯等化合物，对btex造成的污染进行生物修复。此外，有些土壤真菌以病原菌的形式出现，入侵植物，对植物的根、茎、叶造成危害，引起农作物减产或者品质下降。例如，部分感病品种因感染镰刀菌属真菌造成的枯萎病严重影响黄瓜产量，在土传病原菌常年滋生的环境下病害尤为严重。土壤生物分为土壤微生物和土壤动物两大类，微生物中有细菌、真菌和放线菌，土壤动物按体型大小可分为原生生物（如鞭毛虫和纤毛虫等）、湿生小型土壤动物（如线虫）、小型节肢动物（如蜱螨）和大型土壤动物（如蚯蚓）。土壤生物在土壤形成、维持生态系统循环、废物的分解等方面扮演着重要角色，特别在养分循环和凋谢物分解中不可替代，提供气候调节、碳封存、驱动物质循环等生态系统服务，甚至一种土壤生物就可以在整个土壤生态系统中起决定性作用。土壤生物对环境的变化反应敏感，环境因子轻微波动都会引起土壤生物群落的响应变化，进而对土壤生态系统产生影响。因此，土壤生物可作为评价土壤健康状况的指标，常用指示生物包括土壤微生物、土壤线虫及原生动物等。外源物质对土壤的刺激，改变了土壤环境，土壤动物对环境变化反应敏感，产生它们群落结构变化。另外，土壤动物与地上生态系统中的植物密切联系，植物为土壤动物提供食物和生活环境，而土壤动物也对植物的生长产生直接或间接的影响。土壤真菌是以土壤为活动场所完成其全部或部分生活史的真菌类群的总称，是一类具真核，能产生孢子、无叶绿素的真核生物。据统计，全世界已描述的可培养的土壤真菌约3150种，按hawksworth的观点，真菌中仅有0.7%可培养，这样估算土壤中存在的真菌种类最少有7000种或更多。土壤真菌作为土壤微生物区系的重要成员，参与生态系统物质循环和能量流动，分解有机物，为作物提供有效养分，在维持土壤生态系统健康方面具有重要意义，同时也在维持土壤养分平衡方面发挥重要作用。近几年来，学者通过土壤中真菌群落结构的变化能够全面准确地判断土壤健康状况，为土壤生态系统可持续发展提供理论和实践指导。车建美等采用plfas法分析菌渣施用对黑麦草（loliumperenne）根际土壤微生物群落的影响时发现，菌渣处理黑麦草后有利于根际土壤真菌生长，增加了黑麦草根际土壤微生物群落多样性，推测其可以改善土壤质量。有人在探究施肥对茶叶产量、土壤理化性质及土壤细菌、真菌群落的影响时发现，与施加化学肥料相比，施加有机肥后土壤真菌多样性指数最高，提高土壤中营养物质含量，对农业生态系统可持续发展提供科学依据。废橡胶是指失去使用价值或者使用价值降低的热固性高分子材料，包括废轮胎、废胶鞋、废胶管及橡胶制品生产过程中产生的边角料和废品等，其中以废旧轮胎的数量最多。废橡胶在自然条件下不易降解，成为了在各国迅速蔓延的“黑色污染”。目前，废旧橡胶资源化利用的途径主要有轮胎翻新、制造再生胶、废橡胶热解以及制成橡胶颗粒，废胶粒的生产可用于建筑材料、铺设道路等。近几年来，学者将废旧橡胶颗粒应用于运动场草坪建植体系中，为废胶粒的应用途径拓宽了道路。王礼莉等人将不同大小粒径橡胶颗粒作为运动场草坪根带弹性填充介质进行基质组配，对构建的建植体系中的草坪植物生态响应的探讨，研究表明沙土填充2～4mm与1～2mm粒径的胶粒介质作为运动场草坪基质具有可行性，胶粒的加入可以提高基质的通透性，改善草坪植物根系生长环境，有利于草坪植物的根系生长，有助于提高草坪植物的抗性和耐践踏性。另外，废橡胶中含有较多的重金属，以zn含量居多，草坪基质中合理适量填充废胶粒成为重要研究问题。有效的鸟击防控一直以来是机场面临的难题。机场是一个特殊生态系统，它是半自然状态的、人为可控制的及比较稳定，其本身的异质性、植物与动物的多样性都对机场区域的鸟类多样性和活动模式产生重要影响，从而在一定程度上决定着机场内飞机起降安全。机场发生鸟击在于机场环境对鸟类吸引，而机场的生态环境对鸟群吸引体现在其食物链关系中。机场内鸟类、植物、昆虫及土壤生物都是其生态环境食物链结构中组成部分，减少或切断食物链的链接关系，减少机场环境对鸟类吸引，减少鸟类数量，减少鸟类对飞行安全的威胁。因此，对机场内各生物多样性的调查研究有助于提高对机场生态系统及鸟类活动状况的认识。20世纪70年代以来，国内外学者开始重视采用生态学方法研究鸟击问题，通过对不同生境、不同季节鸟类多样性的比较研究，可以帮助了解机场及机场周围对鸟撞造成威胁的鸟类来自哪种生境，从而更好地规划和预防鸟撞工作。李敏等人调查了乌海民航机场及周围生境的鸟类，分析鸟类多样性指数，共记录隶属于16目37科的鸟类107种，根据调查资料和吸引鸟类分布的主要环境因子分析，提出乌海机场鸟撞防范对策。机场植被在机场吸引鸟类的因素中处于主要位置。近些年来，国内外学者对机场内植物多样性的调查研究很多，从植物方面控制鸟类食物源头和改变鸟类栖息环境、繁殖环境，减少机场活动鸟类的种类和数量，达到降低机场鸟击的发生。降低机场种植物多样性有助于减少植被对鸟类的吸引，以植物为食的鸟类因觅食困难而离去，也将导致以植物为食的昆虫及其他无脊椎动物单一化，从而以昆虫等无脊椎动物为食的鸟类因缺乏植物而离开机场。有研究指出，机场地形的合理规划以及机场植被的恰当管理可以减少鸟击危害。自20世纪末以来，国内外的专家和学者们开始广泛研究机场草坪中昆虫多样性，以此控制和减少机场生境中鸟类觅食的频度。李士权等人对滨海滨海机场中3个样地的地被昆虫进行了连续两年的调查，确定了机场内昆虫的发生规律和季节变化规律，进而从生态学角度提出了防治策略，为机场鸟类的防控提供依据。研究机场草地土壤动物群落的组成与动态特征，了解土壤动物与机场鸟类活动状况的相互关系，探索控制土壤动物的方法，对减少机场鸟类及防治“鸟撞”有重要意义。有人对princegeorgeairport的土壤动物调查后得到允许草生长到15厘米可以减少乌鸦的吸引力，并可能减少鸟飞机碰撞。关于机场内鸟类多样性、植物多样性及昆虫多样性的调查研究很多，但是关于作为食物链中的组成成分的土壤微生物及线虫多样性的研究还少有涉及与调查分析。在自然界中，任何生物群落都不是孤立生存的，它们总是通过物质和能量的交换与其生存的环境不可分割地相互联系，相互作用而形成一个统一的整体，即生态系统。植物所固定的能量通过一系列的取食和被取食的关系在生态系统中传递，同时，与周围环境间还进行着物质循环。机场这个特殊生态系统的功能也是通过食物链完成的，机场的生态环境对鸟群的吸引也主要体现在食物链的关系上。植物多样性及所固定的能量可以直接决定植食性鸟类数量，也可间接的通过昆虫数量及多样性决定非植食性鸟类数量，即植物开花招引大量昆虫，植物成熟结实会为昆虫及鸟类提供食物来源，可见机场内降低植物群落及多样性的控制可能会减少鸟类在机场觅食的频率以达到生态治鸟的目的。在以往的研究中，机场中植物多样性、昆虫多样性及鸟类多样性之间通过食物链的作用相互影响。改变机场生态环境，改变机场内吸引鸟群栖息取食的食物链，即运用生态学的知识寻找降低鸟击事件发生率的治理措施是鸟击防控的一种有效途径。近年来，国内外关于机场地上部分的生态关系的研究很多，例如生境与鸟类的关系、植被与鸟类的关系及昆虫与鸟类的关系等。但是对占据食物网重要位置，并且是联系地上部分与地下部分的关键枢纽的土壤生物在整个机场生态环境中的作用还鲜有报道。土壤生物在分解残体、改变土壤理化性质及物质循环和能量流动等方面具有重要作用。机场通过改变草地环境控制鸟类的措施有改草、割草及土壤改性，其中土壤改性可以改变土壤环境进而改变其中生物群落，减少草的种类和数量进而减少地面昆虫种类数量，进而减少鸟类活动。通过基质填充改变土壤环境进而影响土壤中线虫、细菌及真菌等土壤生物多样性，间接影响地上植被及昆虫数量特征从而减少鸟类食物来源或者切断鸟类食物链来达到机场生态治鸟的目的研究鲜有报道。另外，废弃物的大量堆积严重影响了城市的环境美观度，而关于废弃物的合理利用，国内外的研究热点主要在于利用废弃物填充到土壤中调控土壤环境，使土壤理、化、生性质等得到全面优化。适量的废弃物填充土壤能达到改良土壤的作用，但过量废弃物可能会对土壤环境起到负向影响。这些对环境敏感的土壤生物能够起到有效的指示作用，从而可能影响地上植被状况。土壤中线虫、细菌及真菌对环境的变化响应均敏感度极高，能够对土壤的环境健康状态起指示作用。土壤环境的变化可能会对地上植被产生一系列的影响变化。近几年来，滨海机场一直致力于治鸟防鸟，为机场的飞行安全找到更好的保障措施。因此，本实验在滨海机场基质调控区中进行，通过填充废弃物研究了基质填充到滨海机场基质调控区的土壤后，对土壤理化性质产生的改变，以及对土壤中包括真菌群落结构及多样性的影响，旨在对有效调控地上植被群落结构及昆虫数量特征从而减少鸟类食物来源或者切断鸟类食物链来达到机场生态治鸟的目的提出理论依据，为滨海机场应用生态学方法进行鸟击防控积累了基础生态学资料。土壤真菌作为土壤微生物区系的重要成分，参与生态系统中物质循环及能量流动，土壤真菌通过分解有机物为有效的营养形式供植物体吸收，促进植物生长，同时真菌组织死亡,降解和被动物取食后能释放大量的养分，在维持土壤生态系统健康方面具有重要意义，同时也在维持土壤养分平衡方面发挥重要作用。另外，学者研究表明许多土壤真菌可用于植物病、虫害的生物防治。由此可见，土壤中真菌的群落结构能间接的影响地上植物的生长状况。近几年来，学者通过土壤中真菌群落结构的变化能够全面准确地判断土壤健康状况，为土壤生态系统可持续发展提供理论和实践指导。机场环境中，植物、昆虫及鸟类之间存在食物链的关系。近年来，国内外关于调控机场地上部分的生态关系的研究很多，例如生境与鸟类的关系、植被与鸟类的关系及昆虫与鸟类的关系等。但是对占据食物网重要位置，并且是联系地上部分与地下部分的土壤真菌在整个机场生态环境中的作用还鲜有报道。寻找一种外源物质改变土壤中真菌群落结构的变化，从而影响植物生长，而达到调控机场环境的目的。技术实现要素：因此，本发明选用了废胶粒填充到滨海机场基质调控区的土壤后，研究了其对土壤真菌群落结构及多样性的影响，旨在对有效调控地上植被群落结构及昆虫数量特征从而减少鸟类食物来源或者切断鸟类食物链来达到机场生态治鸟的目的提出理论依据，为滨海机场应用生态学方法进行鸟击防控积累了基础生态学资料。本发明公开了废胶粒填充基质对机场土壤中真菌多样性的调控方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）首先对调控区中的植被进行刈割，然后对该区域进行翻土，深度为20厘米，耕翻一次；（2）在调控区的实验区按每6.7m×5m样地，土壤基质填充废胶粒，施加量为100t/ha，撒在调控区中与翻过的土混合均匀，填充后调控区的植被处于自然生长的状态；（3）完成调控基质的填充后，分别于同年秋季和次年春季以及次年夏季，在基质调控区采集土壤样品进行测定。其中所述的采集土壤样品进行测定指的是：采集前，去除土壤表层杂草，采用s型取样法，在每个试验小区随机选取20个取样点，用土钻钻取0~20cm深度的表层土，挑捡出土壤中大的根系，然后掰碎大的土块后，将土样均匀混合后置于冰盒放入密封袋，记上标签，带回实验室做后期处理。本发明进一步公开了废胶粒填充基质对机场土壤中真菌多样性的调控方法在降低土壤真菌的多样性方面的应用。同时该方法也公开了在降低土壤中真菌均匀度指数和丰富度指数方面的应用。本发明主要考察了机场土壤的生物多样性特征，重点是解决机场鸟击问题，本发明的难点在于：目前尚无通过食物链调节机场鸟击的技术，本发明的创新点在于：通过调整机场土壤的理化性质，达到改变机场生物多样性特征的目的。本发明更加详细的研究方法与结论如下：1材料与方法1.1基质调控区概况试验样地设在滨海机场中的基质调控区中，地理位置为39.12°n,117.33°e，海拔高度为3m。基质调控区中为自然环境下生长的植物，植物群落中的植物种类，盖度都较高，其中包括碱茅，苣荬菜，白草，狗尾草，泥胡菜，朝天委陵菜，蛇床，马齿苋，田旋花等30余种植物，分属于禾本科、苋科、菊科、蔷薇科等16科。基质调控区为沙壤土，其理化性质为：ph7.95，含水量11.7%，容重1.46g·cm－3，有机质28.7g/kg，全氮2.37g/kg，速效磷21.43mg/kg。滨海机场基质调控区位于天津市东丽区，属于暖温带半湿润大陆性季风气候，年均气温11.8℃，年均降水量598mm，无霜期188d。在季节分布上，春季干旱少雨，平均气温在－5～－3℃，平均降水量为34mm；夏季炎热多雨，平均气温在26～27℃，6、7、8三个月降水量占全年的75%左右，平均降水量为288mm；秋季冷暖适中，平均气温在9～16℃，平均降水量为214mm；冬季寒冷，平均气温在－8～1℃，平均降水量为16mm。1.2实验材料实验中选用的三种废弃物分别为：粉煤灰、废胶粒和污泥堆肥。粉煤灰由天津太行矿业提供，该厂的粉煤灰是燃煤发电厂中煤燃烧后排出来的烟气中产生的细灰。粉煤灰中含有大量碱性氧化物，如sio2，feo，mgo,cao,al2o3等，其理化性质如表1所示。表1粉煤灰的理化性质废胶粒由河北沧州腾达胶粒厂提供，型号为1-2mm和2-4mm混合胶粒粉。费胶粒主要是由各种废旧橡胶加工生产而来，如旧车胎、橡胶鞋底、电缆皮、边脚料等。污泥堆肥由张贵庄污水处理厂提供，污泥堆肥是污水处理过程中得到的固体有机物质，其中大部分污水来源于居民生活废水和小企业排放的污水，污水经过处理可以作为肥料，污泥堆肥的理化性质如表2所示。表2污泥堆肥的理化性质1.3实验设计实验于2015年5月29日在滨海机场中的基质调控区中进行。首先对调控区中的植被进行刈割，然后对该区域进行翻土，深度为20厘米，耕翻一次；机场基质调控区的总面积约为15m×20m，将其平均划定四块等大区域，每块区域平分成三份，规格约为6.7m×5m，试验设置4个处理，每个处理3次重复，处理分别为：①对照组，不填充任何调控基质，基质调控区的植被为自然生长状态；②土壤基质填充粉煤灰，填充量为250t/ha，基质调控区的植被为自然生长状态；③土壤基质填充污泥堆肥，施加量为250t/ha，基质调控区的植被为自然生长状态；④土壤基质填充废胶粒，施加量为100t/ha，基质调控区的植被为自然生长状态。1.4土壤样品采集实验于2015年5月29日在滨海机场中的基质调控区中进行，然后分别于2015年10月30日（秋季）、2016年4月30日（春季）和2016年7月30日（夏季）采集3次土壤样品。采集前，去除土壤表层杂草，采用s型取样法，在每个试验小区随机选取20个取样点，用土钻钻取0~20cm深度的表层土，挑捡出土壤中大的根系，然后掰碎大的土块后，将土样均匀混合后置于冰盒放入密封袋，记上标签，带回实验室。1.5实验方法1.5.1真菌培养基的配制方法配制孟加拉红培养基分离真菌，配方如表3所示。将配制好的培养基放入灭菌锅（日本tomydigitalbiology公司，sx-700）中121℃灭菌20min，然后将灭菌好的培养基放入超净工作台中，晾至50-60℃时，加入3ml1%链霉素，然后将其倒入直径为9cm的培养皿（灭菌）中，每个培养皿中约倒入50ml，晾至凝固后，备用。表3孟加拉红培养基配方成分用量kh2po41gmgso4·7h2o0.5g蛋白胨5g葡萄糖10g琼脂15~20g水1000mlph自然1%孟加拉红溶液3.3ml1.5.2土壤中真菌数量的测定采用稀释涂布平板法[165]分离培养出土壤中的真菌，然后对其菌落进行计数。具体步骤为：称土样0.5g，装入50ml无菌水的锥形瓶中，封口膜封好后置于摇床中，振荡20min，使土样和水充分混匀，静置30s，即制成10－2倍的土壤稀释液。然后吸取1ml土壤悬液加入装有9ml无菌水的试管中，充分混匀并振荡20min，即制成10-3倍的土壤稀释液，以此类推制成10-4、10-5、10-6几种不同稀释度的土壤悬液。取0.2ml土壤悬液均匀涂布到灭菌凝固好的孟加拉红培养基上，将接种后的平板置于28℃的培养箱（上海博讯，光照培养箱spx-250b-g）中，避光培养1-2天，期间连续观察真菌的生长情况，为方便微生物计数及形态特征的观察，最好选取菌落数在30-50之间的平板进行计数。通过预实验发现：胶粒、粉煤灰及污泥堆肥填充土壤后细菌培养的最适浓度为10-2，且最适培养时间为2天。菌数计算公式：1g干土中的菌落数（cfu·g-1）=m×鲜土重/干土重，其中：m=a×u/v，a为培养皿中平均菌落数，u为稀释倍数，v为每个培养皿中加土壤悬液的体积（本实验为0.2ml）。1.5.3土壤中真菌的纯化将培养好的真菌平板按照不同的菌落形态特征进行归类和编号，然后用已灭菌的接种环挑取不同种的真菌菌落，分别接种到新的孟加拉红培养基上，画出z线，已达到将不同种的真菌菌落纯化的目的，做好标签在28℃的培养箱中倒置培养1-2d，培养好后将纯化好的细菌平板保存在4℃的冰箱中备用，一次纯化不理想可重复纯化过程。1.5.4分子生物学的鉴定真菌18srdna由保守区和可变区组成，保守区为所有真菌共有，可变区在不同真菌间存在差异，具有真菌属或种特异性，因此，18srdna序列分析技术是真菌鉴定与分类的常用方法。真菌分子生物学鉴定的步骤：（1）提取纯培养真菌的基因组dna：用ezup柱式土壤基因组dna抽提试剂盒（生工生物工程股份有限公司）提取纯培养得到的真菌的基因组dna，按照试剂盒上的标准抽提步骤进行。（2）真菌18srdna的pcr扩增：以真菌通用引物its1（5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′）和its4（5′-tcctccgcttattgatatgc-3′）扩增细菌18srdna，扩增片段约600bp左右。pcr扩增体系为50ul，其中引物1(its1)2μl、引物2(its4)2μl、10xbuffer(mg2+)5μl、dntp1μl、taq酶1μl、dna模板10μl和ddh2o29μl。pcr扩增在pcr仪（abiveriti96，美国）中进行，其反应条件与步骤为94℃预变性2min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环，72℃延伸7min。（3）琼脂糖凝胶电泳：用移液枪吸取7ul扩增产物与2ul6×glyceroldnaloadingbuffer混合均匀，然后再吸取7ul混合液进行点样，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，然后将琼脂糖凝胶侵入eb水溶液中染色15min，以约600bp的dnamarker作为18srdna基因的标准，于紫外凝胶成像系统中观察，取得明亮目标条带后将所得pcr产物交由北京华大基因公司纯化与测序。（4）真菌18srdna序列分析：华大基因公司测序后的结果经过ncbiblast（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）比对分析，获得与之同源性相对较高的16srdna序列，采用bioeditv7.0.1与dnaman7.0软件进行多序列同源性比对分析，将序列相似性在97%及以上的18srran序列确定为同一操作分类单位，即通过比对将实验所培养得到的微生物种类鉴定到种水平。1.6数据统计与处理采用shannon-wiener多样性指数（h′）、优势度指数（λ）、均匀度指数（j）和丰富度指数（sr）来分析评价土壤真菌群落的多样性，具体计算公式如下：（1）shannon-wiener多样性指数(diversity)：h′=-σpi（lnpi）；（2）均匀度指数(evenness)：j=h′/lns；（3）丰富度指数(richness)：sr=(s-1)/lnn；式中，pi为第i个物种的个体数占真菌群落中总个体数量的比例；s为真菌群落中的物种数；n为真菌群落中总个体数。采用spss17.0软件进行数据处理，用one-wayanova单因素方差分析进行方差分析，并用tukey法进行差异显著性检验(p＜0.05)。采用microsoftexcel2003进行图表的制作。2研制结果与分析2.1废旧胶粒填充基质对滨海机场土壤中可培养真菌总数的影响不同季节胶粒、粉煤灰及污泥堆肥填充后土壤中可培养真菌菌落总数如图1所示。不同处理间真菌数量具有一定的季节变化规律。对照组、废胶粒和污泥堆肥处理中，均显著呈现出夏季（7月末）真菌数量最大，秋季次之，春季最少(p＜0.05)；而粉煤灰处理中夏季真菌数量仍最多，但春季真菌数量显著高于秋季(p＜0.05)。同一季节时，各填充处理对土壤中真菌数量有影响。秋季时（10月末），与对照组相比，土壤中填充粉煤灰和污泥堆肥后，真菌总数均有显著性的下降(p＜0.05)，分别下降了3.04倍和0.63倍。春季时（4月末），各处理中土壤真菌数量均有增加的趋势，但只有废胶粒处理有显著性的增加(p＜0.05)。夏季时（7月末），土壤真菌对粉煤灰响应敏感，真菌数量有显著性的降低，而其他两个处理有增加的趋势，但是差异并不显著（p＞0.05）。2.2胶粒填充基质对滨海机场土壤中可培养真菌多样性的影响将土壤中可培养真菌菌落的数量统计结果进行群落多样性的计算，结果如表4所示。胶粒、粉煤灰及污泥堆肥填充后，土壤中可培养真菌的多样性有所变化。不同处理中的真菌群落的多样性指数h′有明显的季节规律，均表现出：秋季土壤中真菌菌落的h′最大，春季次之，夏季最小，此结果与表4-2中细菌菌落的组成的结果一致。在同一采样时间里，各处理的h′有所差异。在秋季（10月末），胶粒、粉煤灰及污泥堆肥填充后，h′均有降低的趋势，其中粉煤灰和废胶粒处理的h′有显著性的降低(p＜0.05)。在春季（4月末），各处理的h′没有显著差异（p＞0.05）。在夏季（7月末），胶粒、粉煤灰及污泥堆肥填充后，h′均有降低的趋势，其中污泥堆肥和废胶粒处理的h′有显著性的降低(p＜0.05)。不同处理中的真菌群落的均匀度指数j有明显的季节规律，均表现出：秋季土壤中真菌菌落的j最大，春季次之，夏季最小。在同一采样时间里，各处理的j有所差异。在秋季（10月末），与对照相比，废胶粒处理后的j有显著性的降低(p＜0.05)。在春季（4月末），胶粒、粉煤灰及污泥堆肥填充土壤后j均有所降低，但差异不显著（p＞0.05）。在夏季（7月末），废胶粒和污泥堆肥处理后的j有显著性的降低（p＞0.05）。不同处理中的真菌群落的丰富度指数sr有明显的季节规律，对照组中，秋季的sr最高，而在镉填充处理后春季的sr最高。在同一采样时间中，各处理的sr有所差异。在秋季（10月末），各填充处理后的sr均有显著性的降低(p＜0.05)。在春季（4月末），各填充处理后的sr均有升高的趋势，但只有废胶粒处理有显著性的升高(p＜0.05)。在夏季（7月末），粉煤灰和废胶粒处理后的sr有显著性的降低(p＜0.05)。表5不同季节各废弃物填充处理可培养真菌菌落多样性指数2.3胶粒填充基质对滨海机场土壤中可培养真菌菌落组成的影响各季节不同处理下土壤中可培养真菌组成及所占比例见表6所示。经过18srdna测序发现，本实验分离出的27株不同形态的真菌分属于10个属。土壤中真菌菌落的组成在不同的季节中表现不同，秋季（10月末）真菌组成最丰富，而在春季（4月末）和夏季（7月末）土壤中真菌的某些偶见种会消失。在同一季节时，土壤中真菌菌落的组成对填充基质响应敏感。在秋季（10月末），各处理中可培养真菌的优势种有所变化。对照组中的优势属为青霉菌属，而在粉煤灰填充后的土壤中，曲霉菌属的数量大幅度增加，成为优势种，在废胶粒处理组中，淡紫紫孢霉菌属的数量大幅度增加，成为优势种。在污泥堆肥处理组中，优势种仍然为青霉菌属，但是裸节菌属在污泥堆肥的刺激下数量显著性增加(p＜0.05)。春季（4月末），对照组、废胶粒和污泥堆肥处理组中，青霉菌属在数量上最多，为优势属，而粉煤灰处理组中优势属为曲霉菌属，占41.15%。此外，毛壳菌对填充基质响应敏感，与对照相比，毛壳菌属在粉煤灰和污泥堆肥中消失，废胶粒处理中的数量也有显著性的降低(p＜0.05)。在夏季（7月末），与对照组相比，废胶粒和污泥堆肥处理组中，青霉菌属所占的比例显著减少(p＜0.05)，不再是优势属，而是淡紫紫孢霉菌属的数量大幅度增加，成为优势属。粉煤灰处理组中，优势种为曲霉菌属。此外，枝孢霉菌属对填充基质响应敏感，加入胶粒、粉煤灰及污泥堆肥后，枝孢霉菌属在粉煤灰处理中消失，而在废胶粒和污泥堆肥处理中显著性的降低(p＜0.05)；裸节霉属在污泥堆肥处理中数量显著性的升高；腐殖霉属在废胶粒处理中显著性的降低(p＜0.05)。共分离得到27株真菌，经18srdna测序结果表明这27株真菌分属于青霉菌属（penicillium）、曲霉菌属（aspergillus）、枝孢霉属（cladosporium）、裸节菌属（talaromyces）、链格孢菌属（alternaria）、紫霉菌属（purpureocillium）、犁头霉属（absidia）、镰刀菌属（fusarium）、腐殖霉属（humicola）、毛壳菌属（chaetomium）。粉煤灰抑制了土壤中真菌数量的生长，填充初期下降可达3.04倍，但随着反应时间的延长，依然保持下降趋势，达0.44倍；废胶粒和污泥堆肥促进了土壤中真菌数量的生长，夏季时分别增长0.15倍和0.18倍。在土壤中真菌的减少，就会削弱土壤中有机物质转化成可供植物吸收的营养物质的能力，即粉粉煤灰的填充可能会不利于地上植物生长。粉煤灰、废胶粒及污泥堆肥的填充随着时间的延长均使土壤真菌的多样性有不程度的降低，并且影响优势种和群落结构组成。其中粉煤灰填充后，曲霉菌增加可能会对植物生长产生负向影响。表6不同处理下土壤中可培养真菌组成及相对丰度（%）2.4滨海机场土壤中可培养真菌的18srdna分析经过对胶粒、粉煤灰及污泥堆肥填充土壤后真菌的培养计数以及种类划分归类，挑选出了不同特征的真菌菌落。通过对不同真菌18srdna的扩增，得到了多条扩增片段，并且通过与dnamarker的位置比对，发现其条带符合真菌的特征。图2是对其进行18srdna扩增之后的电泳图。本实验共获得27条有效序列，将获得的18srdna的序列通过blast程序与genbank数据库中已知序列进行相似性对比，其类别信息、相似性百分比以及genbank登录号见表7。通过序列相似性分析发现菌株1-7为青霉菌属，菌株8-16为曲霉菌属，菌株17为枝孢霉属，菌株18和菌株19为毛壳菌属，菌株20和菌株21为链格孢菌属，菌株22为紫霉菌属，菌株23为犁头霉属，菌株24和菌株25为镰刀菌属，菌株26为腐殖霉属。菌株27为裸节菌属。表5-3中的27株菌株与模式菌株的相似度均达到96%以上，可信度比较高。表7不同处理土壤中可培养真菌的18srdna序列相似性分析numberclosestdatabasematch(ncbi)identity/%genebankaccessionno.1penicilliumsp.acr-d2499kf888644.12penicilliumcommuneisolatetbg3-2199jq082505.13penicilliumchrysogenumstrainss-1399jx139710.14penicilliumsp.bab-544499kt355727.15penicilliumsp.nics0199jx481980.16penicilliumdipodomyicolastrainqlf10399fj025172.17penicilliumsp.psf4499hq850367.18aspergillusustusisolateauts0299kx057376.19aspergillusaculeatusisolatea4s3_d399jx501412.110aspergillusalliaceusisolatenrrl120699ef661543.111aspergillussp.enrichmentcultureclonefzc398ku170490.112aspergillussp.o_3_besc_246e99kc007332.113aspergillustubingensisstrainscsgaf016399jn851045.114aspergillussp.enrichmentcultureclonefzc399ku170490.115penicilliumrubidurumisolatecy24999hq608058.116aspergillusustusisolateatt00199hq607794.117cladosporiumsp.x299kj958360.118chaetomiumsp.att21099hq607886.119chaetomiumbostrychodesisolatemj499km203571.120alternariaalternataisolatesdauforestry402-1100kj682317.121alternariaalternatastrainglyk4100kp979753.122purpureocilliumlilacinumstrainnpf-4100kp308838.123absidiarepensisolatea-32796jq683219.124fusariumsp.strainzbf-r199kx064979.125fusicollaacetilereaisolate248ws99kj207396.126humicolasp.knu0199kc797230.127talaromycescellulolyticusstrainnfml_ch49_258197km458826.13研制结论本研究中，不同填充处理及对照组中土壤真菌的总数具有明显的季节动态变化，即春季真菌数量较少，而夏、秋季真菌活动旺盛、数量较多。此结果与土壤中细菌的季节规律相同。废胶粒处理后土壤中真菌数量呈现增加的趋势，可能与土壤中的养分的增加的有关。胶粒填充到土壤后，随着作用时间的延长，土壤中真菌的多样性指数、均匀度指数和丰富度指数均呈现出下降的趋势，其中土壤真菌的多样性对废胶粒处理的响应最为敏感，呈现显著性的下降。附图说明图1不同季节各填充处理真菌菌落总数；注：ⅰ，对照；ⅱ，粉煤灰；ⅲ，废胶粒；ⅳ，污泥堆肥。柱形图上方不同小写（a，b，c）字母表示同一季节不同处理之间差异显著(p＜0.05)；柱形图上方大写字母（a、b、c）表示同一处理不同季节之间差异显著(p＜0.05)，下同；图2真菌18srdna的扩增结果。具体实施方式下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。实施例1一种废胶粒填充基质对机场土壤中真菌多样性的调控方法：（1）首先对调控区中的植被进行刈割，然后对该区域进行翻土，深度为20厘米，耕翻一次；（2）在调控区的实验区按每6.7m×5m样地，土壤基质填充废胶粒，施加量为100t/ha，撒在调控区中与翻过的土混合均匀，填充后调控区的植被处于自然生长的状态；（3）完成调控基质的填充后，分别于同年秋季和次年春季以及次年夏季，在基质调控区采集土壤样品进行测定。其中所述的采集土壤样品进行测定指的是：采集前，去除土壤表层杂草，采用s型取样法，在每个试验小区随机选取20个取样点，用土钻钻取0~20cm深度的表层土，挑捡出土壤中大的根系，然后掰碎大的土块后，将土样均匀混合后置于冰盒放入密封袋，记上标签，带回实验室做后期处理。在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。sequencelisting<110>天津师范大学<120>废旧胶粒填充基质对机场土壤中真菌多样性的调控方法<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1tccgtaggtgaacctgcgg19<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2tcctccgcttattgatatgc20当前第1页12