基于rapA1A2-like双组分调节系统提高土霉素产量的方法与流程

文档序号：15205719发布日期：2018-08-21 08:32阅读：330来源：国知局

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及基于rapa1a2-like双组分调节系统提高土霉素产量的方法及重组生产菌。

背景技术：

龟裂链霉菌(streptomycesrimosus)是一种革兰氏阳性、耗氧丝状放线菌，作为土霉素(oxytetracycline，otc)的生产菌株，由finlay等人于1950年首次报道。如今，streptomycesrimosus已经成为工业上otc生产的主要菌株之一。otc是一种广谱抗生素，通过抑制菌体蛋白的合成来发挥作用，在临床以及渔业上广泛应用，具有很大的市场需求。

土霉素作为龟裂链霉菌合成的一种次级代谢产物，其合成调控涉及到途径特异性调控因子和全局调节因子之间复杂的相互作用，进而加强或者抑制抗生素生物合成基因的表达。途径特异性调控因子中最为典型的就是链霉菌抗生素蛋白(streptomycesantibioticregulatoryproteins，sarp)家族。这个家族有较为典型的特征，其分子量大约为25kda，包括两个典型的结构域，n端包含一个ompr型的dna结合域，c端是一个转录激活域(bacterialtranscriptionalactivationdomain，btad)。在龟裂链霉菌中也已经发现了一个途径特异性调控因子，它也是属于sarp家族，位于otc基因簇，紧挨着转运蛋白基因otrb，被命名为otcr。它能够直接与基因簇上的oxy基因的启动子直接结合，从而调控otc的合成。

而双组份调节系统(two-componentregulatorysystem，tcs)是链霉菌的全局调控系统，参与到细胞内渗透压调节、新陈代谢、细胞生长及菌体形态分化等种种生理代谢过程中。典型的原核型双组份系统，主要由两部分组成：组氨酸激酶(histidinekinase，hk)，又名感应蛋白和应答调节蛋白(responseregulator，rr)。当环境中的特定类型的信号分子结合到hk蛋白的信号感应域上，由atp作为磷酸供体，结合atp酶域，使得hk蛋白的信号传递域上的保守组氨酸残基实现自我磷酸化，将磷酸基团转移到rr蛋白的信号接受域上的天冬氨酸残基，而天冬氨酸的磷酸化导致rr效应结构的构象改变，从而实现信号的传递。

作为链霉菌模式菌的天蓝色链霉菌(s.coelicolor)，其全基因组序列的生物信息学分析发现了84个假定的hk基因和80个假定的rr基因，其中包含67个典型的双组份系统。在天蓝色链霉菌菌，存在有一对双组份系统rapa1a2，已经被报道能对天蓝色链霉菌次级代谢产物中的放线紫红素(act)和一种的非典型的聚酮物有正向调控作用，它的作用方式暂时还未被阐明。

迄今为止，只有少数双组份系统已被确定在抗生素生产调控中起作用，且大部分tcs的作用机理是未知的。在龟裂链霉菌中，类似研究至今尚处于空白状态。并且，鉴于链霉菌的次级代谢调控网络十分复杂，定位到对于土霉素产量确实有调控作用的基因仍然是极为困难的。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于rapa1a2-like双组分调节系统提高土霉素产量的方法及重组生产菌。

在本发明的第一方面，提供一种提高土霉素产量的方法，所述方法包括：下调土霉素生产菌中rapa1a2-like双组分调节系统的活性，并且以甘氨酸或天冬氨酸为唯一氮源培养该土霉素生产菌，从而提高土霉素产量。

在一个优选例中，所述的下调土霉素生产菌中rapa1a2-like双组分调节系统的活性包括：(a)在土霉素生产菌中敲除或沉默rapa1a2-like双组分调节系统的基因；(b)将下调rapa1a2-like双组分调节系统的下调剂转入土霉素生产菌中；或(c)调节土霉素生产菌中rapa1a2-like双组分调节系统的上游信号通路或上游基因，以下调土霉素生产菌中rapa1a2-like双组分调节系统。

在另一优选例中，(a)中，通过基因敲除的方法，下调土霉素生产菌中rapa1a2-like双组分调节系统的活性；较佳地，敲除应答调节蛋白基因rapa1或感应蛋白基因rapa2。

在另一优选例中，(b)中，所述的下调剂是特异性干扰rapa1a2-like双组分调节系统中的基因的表达的干扰分子；较佳地，所述的干扰分子是以rapa1a2-like双组分调节系统中的基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsrna、反义核酸、小干扰rna、微小rna，或能表达或形成所述dsrna、反义核酸、小干扰rna、微小rna的构建物。

在另一优选例中，所述的土霉素生产菌是龟裂链霉菌。

在本发明的另一方面，提供分离的多肽，该多肽选自下组：(a)seqidno:1或2所示氨基酸序列的多肽；(b)将seqidno:1或2所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)的多肽相同功能的由(a)衍生的多肽；或(c)与(a)限定的蛋白序列有85％以上同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，其编码所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于作为调控土霉素生产菌的土霉菌产量的靶标。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的土霉素生产菌，该土霉素生产菌中rapa1a2-like双组分调节系统的基因被下调。

在一个优选例中，该土霉素生产菌中，应答调节蛋白基因rapa1或感应蛋白基因rapa2被敲除或沉默。

在本发明的另一方面，提供所述的遗传工程化的土霉素生产菌的用途，用于生产土霉素。

在本发明的另一方面，提供一种生产土霉素的试剂盒，其中包含：所述的遗传工程化的土霉素生产菌；或下调土霉素生产菌中rapa1a2-like双组分调节系统的下调剂(如用于敲除该调节系统的表达质粒，或rna干扰试剂)。

在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括用于培养该土霉素生产菌的培养基，该培养基以甘氨酸或天冬氨酸为唯一氮源。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、m4018(方形)和m4018δrap(圆形)在mm+gly和mm+asn培养条件下的生长曲线和土霉素合成。

a、mm+asn培养条件；

b、mm+gly培养条件。

图2、出发菌m4018以及其各个突变株在mm+50mmgly条件下的产土霉素水平。

图3、m4018(方形)和m4018δrap(圆形)在mm+asp培养条件下的生长曲线(a)和土霉素合成(b)。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，发现土霉素生产菌中rapa1a2-like双组分调节系统与该生产菌的土霉素产量密切相关，下调该调节系统，并且在培养时以甘氨酸或天冬氨酸为唯一氮源，可以极为显著地提高土霉素生产菌的土霉素产量。因此，rapa1a2-like双组分调节系统或调节该系统的物质和方法可应用于实现土霉素生产菌的改良，增强土霉素的产量。

本发明中，所述的rapa1a2-like双组分调节系统包括应答调节蛋白rapa1和感应蛋白基因rapa2。

如本发明所述，下调rapa1a2-like双组分调节系统即可以针对应答调节蛋白rapa1来实施调控，也可以针对感应蛋白基因rapa2来实施调控。

在本发明中，“rapa1多肽(蛋白)”指具有seqidno:1序列的多肽，还包括具有与rapa1多肽相同功能的、seqidno:1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(如1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。

在本发明中，“rapa2多肽(蛋白)”指具有seqidno:2序列的多肽，还包括具有与rapa2多肽相同功能的、seqidno:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(如1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。

任何与所述的rapa1多肽或rapa2多肽同源性高(比如与seqidno:1或2所示的序列的同源性为85％或更高；优选的，同源性为90％或更高；更优选的，同源性为95％或更高，如同源性98％或99％)的、且具rapa1多肽或rapa2多肽相同功能的蛋白也包括在本发明内。

尽管本发明的具体实施例中，列举了具体的应答调节蛋白rapa1和感应蛋白rapa2，但是应理解，由于土霉素生产菌存在一些不同的变种，它们之间序列高度保守，来自于这些土霉菌生产菌中的同源多肽也应被包含在本发明中，对这些同源多肽的如本发明类似或相同的调控方法也应被包含在本发明中。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如blast。

作为本发明的优选方式，所述的土霉素生产菌包括龟裂链霉菌。

本发明还涉及编码本发明应答调节蛋白rapa1和感应蛋白rapa2或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与seqidno:1或2所示多肽对应的天然核酸序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有seqidno:1或2的蛋白质，但与其天然的编码区序列有差别的核酸序列。

本发明首次确定土霉素生产菌中存在rapa1a2-like双组分调节系统，并发现其与该生产菌的土霉素产量密切相关。基于该新发现，本发明提供了一种提高土霉素产量的方法，所述方法包括：下调土霉素生产菌中rapa1a2-like双组分调节系统的活性，并且以甘氨酸和/或天冬氨酸为唯一氮源培养该土霉素生产菌，从而提高土霉素产量。

在得知了所述的rapa1a2-like双组分调节系统的调控作用后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节(下调)rapa1a2-like双组分调节系统。包括但不限于：(a)在土霉素生产菌中敲除或沉默rapa1a2-like双组分调节系统的基因；(b)将下调rapa1a2-like双组分调节系统的下调剂转入土霉素生产菌中；或(c)调节土霉素生产菌中rapa1a2-like双组分调节系统的上游信号通路或上游基因，以下调土霉素生产菌中rapa1a2-like双组分调节系统。

rapa1a2-like双组分调节系统包含应答调节蛋白基因rapa1或感应蛋白rapa2。因此，对于该两个基因进行下调是一种下调rapa1a2-like双组分调节系统的优选的方法。

在土霉素生产菌株中下调rapa1或rapa2可以采用多种本领域已知的方法，包括基因沉默、基因阻断、基因敲除、基因抑制等。这些方法均被包含在本发明中。

例如，可以通过基于同源重组的基因插入阻断技术来改造基因组中的rapa1或rapa2基因，从而使得rapa1或rapa2基因被阻断；也可以针对rapa1或rapa2基因设计干扰性rna或反义核苷酸来使rapa1或rapa2基因表达抑制或沉默。

一种下调rapa1或rapa2基因的方法是基因阻断技术，在本发明的优选实施方式中，体外构建rapa1或rapa2基因阻断质粒，通过同源重组的方法，在土霉素生产菌株染色体rapa1或rapa2基因中插入其他无关元件，从而使得染色体上的rapa1或rapa2基因不再能够编码活性的蛋白质。当进行基因阻断时，无关元件的选择是本领域技术人员易于选择到的，例如应用一些抗性基因。一种基因阻断(敲除)的方法例如可参见geneticmanipulationofstreptomyces:alaboratorymanual中所记载的。较佳地，本发明实施例中，所述的无关元件包括pkc1139质粒中的部分元件，例如orit、oripsg5、apr。此外，将rapa1或rapa2基因进行缺失敲除，使之缺少发挥功能的关键区域也是一种可行的下调基因的策略。

所述的双组份系统由两部分组成，作为本发明的优选方式，仅下调rapa1，这种情况下，无需再对rapa2进行任何基因操作即可实现对于rapa1a2-like双组分调节系统的下调。由于rapa1和rapa2是共表达的，转录时是由rapa1到rapa2，所以rapa1的阻断，使得rapa2也无法正确转录表达。

在设计用于进行基因阻断或敲除的构建物时，同时包含抗性筛选基因是优选的，从而有利于后续筛选出发生基因被阻断或敲除的菌株。

在本发明的具体实施例中，本发明人构建了阻断质粒pkc1139-rap和回补质粒pib-ka-rap，通过接合转移筛选获得阻断、回补和过表达菌株。将获得的菌株培养在以甘氨酸为唯一氮源的mm培养基中，发现阻断菌株的土霉素产量相较于出发菌显著提升60％以上，而过表达菌株中的土霉素产量同时显著下降，充分证明了龟裂链霉菌中rapa1a2-like双组分调节系统对土霉素合成的发挥负调控作用。

本发明还提供了下调rapa1a2-like双组分调节系统的土霉素生产菌，更特别的是采用基因插入阻断方法阻断rapa1或rapa2基因后获得的土霉素生产菌，该菌株不表达rapa1或rapa2基因或表达量显著性降低。本发明还涉及所述菌株的用途，用于高产土霉素。在本发明的具体实施例中，通过构建龟裂链霉菌应答调节蛋白基因rapa1的阻断菌株，考察其在特定培养条件下的otc合成水平，发现阻断菌在添加甘氨酸或天冬氨酸为唯一氮源条件下，其产素水平要高出出发菌60％以上。

基于本发明人的工作，本发明还提供了生产土霉素的试剂盒，其中包含：本发明所述的遗传工程化的土霉素生产菌。

本发明还提供了生产土霉素的试剂盒，其中包含：下调土霉素生产菌中rapa1a2-like双组分调节系统的下调剂；所述的下调剂例如为用于敲除该调节系统的表达质粒，或rna干扰试剂。

所述的生产土霉素的试剂盒中，还可以包括其它应用于土霉素生产过程的试剂，例如土霉素生产菌的基础培养基(如mm培养基)，甘氨酸和/或天冬氨酸。

所述的生产土霉素的试剂盒中，还可以包括使用说明书，说明培养所述土霉素生产菌的方法，或说明利用所述下调剂下调土霉素生产菌中rapa1a2-like双组分调节系统的方法。

本发明第一次在链霉素生产菌中找到的一个与土霉素合成调控相关的双组份系统，且其特别之处在于，虽然经序列比对本发明的rapa1a2-like双组分调节系统与天蓝色链霉菌中的rapa1a2-like双组分调节系统存在一定的同源性(约75％)，但不同的是，相对于rapa1a2对天蓝色链霉菌产放线紫红素(act)的正调控作用，土霉素生产菌中rapa1a2-like双组分调节系统对土霉素的合成是负调控。

本发明揭示了新的龟裂链霉菌中土霉素合成调控方式，填补了双组份系统在龟裂链霉菌中研究的空白。利用龟裂链霉菌中双组份系统rapa1a2-like，构建其应答调节蛋白基因rapa1的阻断菌，在以甘氨酸或天冬氨酸为唯一氮源的mm培养基条件下，发现阻断菌的土霉素产素水平相对于出发菌大大提高，证明了双组份系统rapa1a2-like对于土霉素的合成有负调控作用，由此在龟裂链霉菌中发现了一种新的土霉素合成调控机制。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

菌种、质粒和引物

本发明中使用的菌体和质粒如表1所示。

表1

本发明中使用的引物的序列如表2。

表2

培养基

麸皮培养基(7.5％麸皮，2.5％琼脂)，主要用于龟裂链霉菌的孢子培养。

mm培养基(参考链霉菌操作手册)，初始mm培养基中的唯一氮源是天冬酰胺(asparagine，asn)，在本发明将它替换成50mm的甘氨酸(glycine，gly)或天冬氨酸(asp)，主要用于龟裂链霉菌生长以及土霉素含量的测定。

tsb(oxoid，usa)培养基：主要用于制备菌丝体，用于基因组提取等。

lb培养基：主要用于培养大肠杆菌，ms用于大肠杆菌和链霉菌的接合转移操作。

基本分子操作

质粒提取，酶切验证，连接等基本分子操作参考分子操作手册，链霉菌接合转移操作参考链霉菌操作手册。

将s.rimosus在tsb中培养24-36h后获得的菌丝体可用于提取基因组，具体操作参考试剂供应商提供的操作说明书。

干重与土霉素含量测定

取发酵液1ml，添加适量的9m盐酸进行酸化，调节ph至1.5～1.7，振荡混匀，放置5min后，12000rpm离心5min，将上清液用0.22μm水相滤膜过滤，完成样品制备。采用岛津lc-20a高压液相系统和kromasilc18柱(4.6×200nm)进行分析。流动相为超纯水60％，甲醇10％，乙腈20％，0.2m磷酸10％的混合溶液，流速0.8ml/min，进液量10μl，检测波长350nm，柱温35℃，在此条件下在3-4min左右会出现一个显著的土霉素特征峰。取土霉素粉末标品，配制10000u标品溶液，用0.01m盐酸稀释至浓度分别为0u、20u、40u、60u、80u、100u，用于绘制标准曲线。

发酵过程中，通过测定菌体干重来了解菌体的生长情况，发酵过程取样后，常温下，12000rpm，离心10min，弃上清，将剩余湿菌体置于105℃烘箱中烘干至恒重，称重并测绘其生长曲线。

实施例1、rapa1a2-like的获得

本发明人对龟裂链霉菌s.rimosusm4018进行全基因组测序，从中分析功能基因。经过深入研究，获得龟裂链霉菌m4018中的双组份系统rapa1a2-like的全部基因序列。完整rapa1a2-like基因序列长度为2059bp，hk部分基因(rapa2)长度为1404bp，氨基酸大小为467aa，rr部分基因(rapa1)长度为663bp，氨基酸大小为220aa，两者基因序列有8bp的重叠。

完整rapa1a2基因的序列如下(5’-3’)(seqidno:5)：

atgcgcctgttgatcgtggaggacgagaagcgactggccttgtccctggccggaggactgcgggccgagggatacgcggtcgatgtggtgcacgacggcctggagggcctgcaccgggcgggcgagggcacgtacgacctggtgatcctggacatcatgctgccgggcatgaacggctaccgcgtgtgcggcgccctgcgtgccgcgggcaacgaggtgccggtgctgatgctgacggccaaggacggcgagtacgacgaggccgaggggctggacaccggcgcggacgactatctgacgaagccgttctcgtacgtggtgctggtggcccgcgtgaaggcgctgctgcgccgccgcggacggacggcgctgcccgtgctgcgcgtgggagagctgagcatcgaccagggggcgcaccgcgtggagcgcgccggcgtggaggtgacgctgaccgccaaggagttcgccgtgctggagcaactggcgctgcgcgcgggcgaggtggtgtccaaggccgagatcctggagcacgtgtgggacttcgcgtacgagggcgacaacaacatcgtcgaggtgtacgtgagcgcgctgcgccgcaagctgggcgccgcggcgatccagacggtgcgcggcgccgggtaccggctggtgccgggtgcgtagggtcatcggaaaggtacgggtccgggcggcgctgggcgcctccctcgtagtggcggtcgccctggtcgccgcgggcactgccctcctcctggtcctcaagaacaatctcgtggaccaggccgacctccaggcggagaacaccgcccgcgaggtcgccacgcagatcgcgaccggcaagccgtacgagaagctggacctccccgacggcgacgaccgcccggtggtggtgctgtccgaggacggccgggtgctggcggcgggcgacgacgtacgggcggtggacggcaaggccgtcaccgcgcggcagacgccgcccgccgggcagccgcacgactccgacgacgatgacgacgaccacgagatcaagccgggcgaggtcgagggcaaggcgcggcacaccggcggtacggcgacggtcggccaccgtacggcggactaccggttcgccaccgtcgaggccaaggacacccagggcggcaaggccgtcgtacgggccggggcaccgctggcggccgagcgggaggcggtgggctcggtgcgcaccgcgatgctgatcgggctgccctgcctgctgctggtcgtggccggggtgacctggctggtcacgcggcgggcgctgcgcccggtggagggcatccgccgggagatggcggcgatcacggccagtacggatctgtcgcggcgggtgccggagccgggctcgcgggacgagatcgaccggctggcccgtacgaccaacgagacgctgggcgcgctccaggagtcggtggagcggcagcggcggttcgtcgcggacgcctcgcacgagctgcgtagcccgatcgcgagcctgcggacgcagctggaggtgggcatcgcgcatccggagctgctggacgcgccgggcgccgtggaggacgccgtacggctgcagaacctggcggcggacctgttgctgctggcgcggctggacgcgggggagcggccggcggacgcgcggatcgacctggcggcactggtgcgcgaggaggtctcgcagcgggtgggcgaccggatcgccgtgcaggtgggcgagctggcgggcgtggaggtcgccgggtcgcggagccagctcgggcgggtgctggggaatctgctggacaatgcgcagcggcacgcgcgggagtccgtacgggcgagtgtggcgcgcgagggggagtgggccgtgctgcgggtcgaggacgacgggcccggggtgccgccggaggaacgggagcggatcttcgagcggttcgtccggctcgacgacgcccgcagccgtgacgacggcggggccggactgggcctcgccatcgcccgcgacgtggccgggcggcacgggggcacactggccgtccgcacgggctcggtcttcgaactacgcctgccggtggcgtag

rapa1的基因(5’-3’)(seqidno:3，663bp)：

rapa1多肽序列(seqidno:1，220aa)：

mrllivedekrlalslagglraegyavdvvhdgleglhragegtydlvildimlpgmngyrvcgalraagnevpvlmltakdgeydeaegldtgaddyltkpfsyvvlvarvkallrrrgrtalpvlrvgelsidqgahrveragvevtltakefavleqlalragevvskaeilehvwdfayegdnnivevyvsalrrklgaaaiqtvrgagyrlvpga

编码rapa2的基因序列(5’-3’)(seqidno:4，1404bp)：

gtgcgtagggtcatcggaaaggtacgggtccgggcggcgctgggcgcctccctcgtagtggcggtcgccctggtcgccgcgggcactgccctcctcctggtcctcaagaacaatctcgtggaccaggccgacctccaggcggagaacaccgcccgcgaggtcgccacgcagatcgcgaccggcaagccgtacgagaagctggacctccccgacggcgacgaccgcccggtggtggtgctgtccgaggacggccgggtgctggcggcgggcgacgacgtacgggcggtggacggcaaggccgtcaccgcgcggcagacgccgcccgccgggcagccgcacgactccgacgacgatgacgacgaccacgagatcaagccgggcgaggtcgagggcaaggcgcggcacaccggcggtacggcgacggtcggccaccgtacggcggactaccggttcgccaccgtcgaggccaaggacacccagggcggcaaggccgtcgtacgggccggggcaccgctggcggccgagcgggaggcggtgggctcggtgcgcaccgcgatgctgatcgggctgccctgcctgctgctggtcgtggccggggtgacctggctggtcacgcggcgggcgctgcgcccggtggagggcatccgccgggagatggcggcgatcacggccagtacggatctgtcgcggcgggtgccggagccgggctcgcgggacgagatcgaccggctggcccgtacgaccaacgagacgctgggcgcgctccaggagtcggtggagcggcagcggcggttcgtcgcggacgcctcgcacgagctgcgtagcccgatcgcgagcctgcggacgcagctggaggtgggcatcgcgcatccggagctgctggacgcgccgggcgccgtggaggacgccgtacggctgcagaacctggcggcggacctgttgctgctggcgcggctggacgcgggggagcggccggcggacgcgcggatcgacctggcggcactggtgcgcgaggaggtctcgcagcgggtgggcgaccggatcgccgtgcaggtgggcgagctggcgggcgtggaggtcgccgggtcgcggagccagctcgggcgggtgctggggaatctgctggacaatgcgcagcggcacgcgcgggagtccgtacgggcgagtgtggcgcgcgagggggagtgggccgtgctgcgggtcgaggacgacgggcccggggtgccgccggaggaacgggagcggatcttcgagcggttcgtccggctcgacgacgcccgcagccgtgacgacggcggggccggactgggcctcgccatcgcccgcgacgtggccgggcggcacgggggcacactggccgtccgcacgggctcggtcttcgaactacgcctgccggtggcgtag

rapa2多肽序列(seqidno:2，467aa)：

vrrvigkvrvraalgaslvvavalvaagtalllvlknnlvdqadlqaentarevatqiatgkpyekldlpdgddrpvvvlsedgrvlaagddvravdgkavtarqtppagqphdsddddddheikpgevegkarhtggtatvghrtadyrfatveakdtqggkavvragaplaaereavgsvrtamliglpclllvvagvtwlvtrralrpvegirremaaitastdlsrrvpepgsrdeidrlarttnetlgalqesverqrrfvadashelrspiaslrtqlevgiahpelldapgavedavrlqnlaadllllarldagerpadaridlaalvreevsqrvgdriavqvgelagvevagsrsqlgrvlgnlldnaqrharesvrasvaregewavlrveddgpgvppeereriferfvrlddarsrddggaglglaiardvagrhggtlavrtgsvfelrlpva

实施例2、rapa1a2-like双组分调节系统被下调的菌株的建立

1、突变菌株构建

首先通过单交换的方式将s.rimosusm4018基因组上的双组份系统rapa1a2-like上的应答调节蛋白基因rapa1阻断。具体操作方式为通过引物drapf和drapr从s.rimosusm4018基因组上扩增rapa1基因的部分片段，将扩增片段连接到质粒pmd19-ts中，再利用hindiii和xbai将此片段酶切，最后将此片段连接到质粒pkc1139的hindiii和xbai位点，从而获得pkc1139-rap。通过结合转移的方法，将重组质粒pkc1139-rap从e.coliet12567中转移到s.rimosusm4018，因为温敏型质粒pkc1139在高于34℃条件下无法复制，所以将所有可能的接合子培养在37℃条件下，并同时利用阿普拉抗性筛选。然后，抽提筛选获得的接合子的基因，利用引物rap-single-p1/rap-single-p2，aprf/aprr进一步验证确定，最终获得rapa1基因阻断的突变株s.rimosusm4018δrap。

以质粒pet-28a为模板，扩增kan抗性片段，设计引物pkanttf，pkanttr，将kan基因编码区的上游100bp的启动子区域以及下游100bp左右的转录终止区域一起扩增下来，并引入nhei酶切位点，分别将pib139和回收的扩增片段用nhei单酶切，回收后将抗性片段和质粒连接，导入dh5α感受态后，挑选单菌落，提取质粒nhei单酶切验证，验证成功则说明质粒构建成功，将其命名为pib-ka。

因整合型质粒pib-ka可以表达卡那霉素和阿普拉霉素两种抗性，以此质粒为基础，构建回补质粒。利用引物rap-pibf和rap-pibr将完整的rapa1a2-like基因从m4018基因组上扩增下来，插入到质粒pib-ka上红霉素启动子的下游从而实现该基因的组成型表达，将其命名为pib-ka-rap。将构建成功的质粒pib-ka-rap以同样接合转移的方法导入s.rimosusm4018δrap中，通过挑选阿普拉和卡那霉素双抗性接合子来获得可能的回补菌株。因为回补菌株中含有一个完整的rapa1a2-like双组份系统，可以用引物rapl/rapr初步验证。

将验证成功的菌株命名为m4018δrap(pib-ka-rap)。以此方法类推，将质粒整合入s.rimosusm4018中，则构建的是过表达菌株m4018(pib-ka-rap)。

将空质粒pib139-ka分别导入到s.rimosusm4018和s.rimosusm4018δrap中，构建的为两者的空质粒对照菌株m4018(pib-ka)和m4018δrap(pib-ka)。

因为pib139质粒是以位点特异性整合方式插入链霉菌基因组中，在att位点发生特异性重组以上，设计引物attlf和attlr扩增验证attl片段(401bp)，引物attrf和attrr扩增验证attr片段(502bp)，以此来共同验证质粒pib-ka和pib-ka-rap是否整合入链霉菌基因组。

2、发酵方法

将以上所得的菌株分别在培养在固体麸皮培养基上，30℃，5～7d后收集培养基上的孢子。利用平板活菌计数法将收集到的各突变株产生的孢子计数，在接种时，就可以将接种量固定在1.0×10⁶个孢子/ml。所用的培养基为以50mm甘氨酸为唯一氮源的mm液体培养基，每个250ml摇瓶中分装50ml。统一接种后，将摇瓶放置在摇床上，30℃，220rpm培养5～7天，根据实验需求取样。每个条件设定三个摇瓶平行，每24h取样用于测定干重和土霉素含量。

实施例3、培养菌株及生产土霉素

1、出发菌和阻断菌在mm+gly培养条件下的干重和产素差异

为了探明rapa1基因的阻断是否对龟裂链霉菌的产素有所影响，将m4018和m4018δrap培养在液体mm+50mmgly培养基中发酵。第二天产生足够菌体以后开始取样，用于测定干重和土霉素含量，并计算单位干重的土霉素产量。另外，以50mm的天冬酰胺(asn)为mm培养基的唯一氮源条件作为对照，进行比对。

从图1a中可知，在asn为唯一氮源时，出发菌和阻断菌两者的干重基本没有差异，不过在gly条件下，阻断菌株的干重要略高于出发菌。同时可知，在50mmasn条件下，两者的单位干重产素基本也没有差异，这些结果表明：在asn为唯一氮源的mm培养基中，阻断菌株在生长和产土霉素方面与出发菌没有差异。不过在50mmgly条件下，阻断菌株m4018-δrap的产素水平在第二天时就开始高出出发菌，发酵到第5天(120h)时，m4018-δrap中的单位干重产素水平已经高出出发菌m4018至少60％以上，如图1b。

至此，可以得到一个初步的结论，rapa1基因阻断后的菌株只有在特定的氨基酸条件下才可以表现出土霉素产量的显著差异，且阻断菌株的产素水平要远高出出发菌，证明至少在以甘氨酸为唯一氮源的mm培养基条件下，双组份系统rapa1a2-like应该是负调控龟裂链霉菌中的土霉素合成。

2、各突变株在mm+gly培养条件下的干重和产素差异

在以上实验的基础上，将出发菌m4018，阻断菌m4018δrap，阻断菌对照m4018δrap(pib-ka)，回补菌m4018δrap(pib-ka-rap)，出发菌对照m4018(pib-ka)以及过表达m4018(pib-ka-rap)同时引入，同样的方法接种到含有50mm甘氨酸的液体mm培养基中，进一步确认这个双组份系统对土霉素合成的影响，同时引入各突变株的空质粒对照，用以排除可能出现的极化效应。

结果如图2，首先可以发现m4018和它的空质粒对照m4018(pib-ka)之间，m4018-δrap和它的空质粒对照m4018-δrap(pib-ka)之间的产素水平基本没有差异，也就说明了质粒的导入并不会引起菌体产素的差异，土霉素产素差异确实是由于双组份系统基因操作而引起的。同时，也再一次重复了上一次的实验结果，m4018-δrap和m4018-δrap(pib-ka)中的产素水平120h时还是要高出m401850％以上。另外，在过表达菌株m4018(pib-ka-rap)中发现，其产素水平相较于出发菌大幅度下降了45％(120h)。

通过这一系列菌株的产素结果，较为全面地印证了双组份系统rapa1a2-like的确是负调控土霉素的合成。通过下调该双组份系统rapa1a2-like，则能够显著提高土霉素产量。

3、出发菌和阻断菌在mm+asp培养条件下的干重和产素差异

本发明人利用天冬氨酸(asp，50mm)作为唯一氮源，其它条件与本实施例中“1”部分不变，测定出发菌和阻断菌在mm+asp培养条件下的干重和产素差异。

结果见图3。从图3a中可知，出发菌和阻断菌两者之间的干重差异不大，不过单位干重的土霉素产量有显著差异。从图3b可知，第5天时，m4018δrap的单位干重产素高出出发菌34％左右。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

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<120>基于rapa1a2-like双组分调节系统提高土霉素产量的方法

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