本发明具体涉及一种人参土壤短芽胞杆菌菌株及其应用。
背景技术：
香蕉炭疽病是香蕉采后贮运的主要病害之一，由芭蕉炭疽菌(colletotrichummusae)引起，严重影响香蕉果实的外观和品质，缩短了采后贮运时间，给香蕉的采后贮藏、运输和销售造成巨大的经济损失。目前香蕉炭疽病的防治仍以化学杀菌剂为主，但长期使用化学杀菌剂不仅使香蕉炭疽病产生抗药性，而且农药残留导致环境污染及威胁人类健康等，因而，研究和寻找有效安全的香蕉采后炭疽病生物防治技术和方法，是解决香蕉采后贮运的重要方向之一。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题之一，在于提供一种人参土壤短芽胞杆菌菌株。
本发明是这样实现的：一种人参土壤短芽胞杆菌菌株，所述菌株为人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657(brevibacilluspanacihumi)，于2016年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为cgmccno.11998。
本发明要解决的技术问题之二，在于提供一种所述的人参土壤短芽胞杆菌菌株的应用。
本发明是这样实现的：一种所述的人参土壤短芽胞杆菌菌株的应用，所述人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657用于抑制香蕉炭疽病菌、龙眼焦腐病菌、枇杷炭疽病菌和莲雾黑腐病菌的生长。
本发明要解决的技术问题之三，在于提供一种所述的人参土壤短芽胞杆菌菌株的应用。
本发明是这样实现的：一种所述的人参土壤短芽胞杆菌菌株的应用，所述人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657用于香蕉炭疽病的防治。
本发明具有如下优点：人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657发酵上清液对香蕉炭疽病菌、龙眼焦腐病菌、枇杷炭疽病菌和莲雾黑腐病菌具有抑制作用，并且对香蕉炭疽病具有良好的防治效果，拓宽了香蕉炭疽病生物防治菌株筛选来源。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1为本发明人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657的菌落形态图。
图2为本发明人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657的菌体形态图。
图3为本发明人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657的特异性检测pcr产物电泳图。
图4为本发明人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657的16srdna序列pcr产物电泳图。
具体实施方式
本发明的人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657(brevibacilluspanacihumi)，是从福建省宁德市九都镇水质示范点采集的出水口水样中分离并筛选得到具有拮抗作用的菌株，该人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657发酵上清液对香蕉炭疽病菌、龙眼焦腐病菌、枇杷炭疽病菌和莲雾黑腐病菌具有较好的抑制作用，并且对香蕉炭疽病具有较好地防治效果。
1.人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657的分离与筛选
(1)取出水口水样10ml于90ml无菌水中，充分振荡后吸取1ml进行梯度稀释，选用稀释度为10-4，10-5或10-6的水样稀释液；
(2)将水样稀释液涂布于na培养基平板上，将na培养基平板置于30℃下培养2d；
(3)将步骤(2)培养获得的各菌株接种于营养琼脂培养基中，并在温度30℃、转速180r·min-1条件下培养48h，收集培养液；
(4)通过供试病原菌-香蕉炭疽病病原菌且采用管碟法对收集到的培养液中的菌株进行拮抗筛选，具体为：取所述培养液150μl于牛津杯中，在30℃下培养48h后观察，并采用无菌水作阴性对照，农用硫酸链霉素作阳性对照ck，通过观察抑菌圈大小筛选得到拮抗菌株。
其中na培养基的组分：蛋白胨10.0g、牛肉浸膏3.0g、nacl5.0g、水1000ml，ph7.2-7.4。
2.人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657的鉴定
(1)形态学鉴定
对人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657进行主要形态观察，得到该菌株的主要形态如下：菌落不透明，乳白色，扁平，表面干燥有皱褶，边缘规则(见图1)，革兰氏染色呈阳性，营养体细胞短杆状，大小约0.7×2.7μm，具有鞭毛(见图2)。
(2)特异性鉴定
参照上海捷瑞生物工程有限公司试剂盒中的说明书进行操作提取人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657的基因组dna。委托上海博尚生物有限公司合成特异性引物：
brev-f：5′agaccgggataacatagggaaacttat3′(seqidno.1)；
brev-r：5′ggcatgctgatccgcgattactagc3′(seqidno.2)。
以人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657的基因组dna为模板，且以上述引物为引物对pcr扩增其特异性序列：
pcr反应体系(25μl)：18.7μl无菌去离子水，2.5μl10×pcrbuffer，0.5μldntp(10μmol/μl)，1.0μlbrev-f上游引物(10μmol/μl)，1.0μlbrev-r下游引物(10μmol/μl)，0.3μltaq酶，1.0μl模板dna。
pcr反应程序：预变性94℃5min；变性94℃1min；退火55℃1.5min；延伸72℃1.5min，25个循环；最后延伸72℃5min。
pcr产物检测：取2μlpcr产物，点样于1.0％的琼脂糖凝胶中，以100bpmarker作为标准分子量，100v电压，电泳40min，eb染色，即进行凝胶电泳分离检验，电泳分离检验结果如图3所示，目的片段大小为1200bp左右，根据pcr反应结果电泳图中条带的有无，确定该菌株是否为短芽胞杆菌属菌株。
(3)人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657的16srdna序列测定与分析
参照上海捷瑞生物工程有限公司试剂盒中的说明书进行操作提取该人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657的基因组dna。委托上海博尚生物有限公司合成
正向引物：5′-agagtttgatcactggctcag-3′(seqidno.3)；
反向引物：5′-acggctaccttgttacgactt-3′(seqidno.4)。
以提取所获得的人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657的基因组dna为模板，且以上述引物为引物对pcr扩增其16srrna基因全长序列：
pcr反应体系(25μl)：2.5μl10×buffer、0.5μl10mmdntp、1μl正向引物、1μl反向引物、0.3μl(5u/μl)的taq酶和1μldna模板；
pcr反应程序：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。
pcr产物检测与测序分析：取2μlpcr产物，点样于1.5％的琼脂糖凝胶中，以100bpmarker作为标准分子量，100v电压，电泳40min，eb染色，即进行凝胶电泳分离检验，电泳分离检验结果如图4所示，并将pcr产物委托上海博尚生物技术有限公司进行测序，得到的序列如seqidno.5所示。在韩国细菌序列比对网站eztaxon-e.ezbiocloud.net上对菌株fjat-10657的16srrna序列进行比对分析后，确认该菌株fjat-10657在分类学上属于人参土壤短芽胞杆菌(brevibacilluspanacihumi)。
依据上述16srdna序列测定与分析并结合形态、生理生化特征最终确定菌株fjat-10657属于人参土壤短芽胞杆菌(brevibacilluspanacihumi)的一株菌株。
3.测定人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657的发酵上清液对香蕉炭疽病菌、龙眼焦腐病菌、枇杷炭疽病菌和莲雾黑腐病菌的抑制作用
(1)菌株的活化：用接种环将人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657划线于lb培养基上，并于恒温培养箱中培养24h，并且培养温度为30℃；
(2)制备种子液：将步骤(1)所获得的人参土壤短芽胞杆菌fjat-10657的单菌落接种于100ml的lb培养基中(该lb液体培养基的组分：1％胰蛋白胨，0.5％氯化钠，5％酵母提取物，水1000ml，ph7.2)，并将其置于恒温振荡摇床中培养24h，温度30℃，转速170rpm/min；
(3)制备液体发酵液：按10％移种量将步骤(2)所获得的种子液转入已灭菌的lb培养基中培养，温度30℃，转速170rpm/min，并在培养过程中每隔一段时间取适量的发酵液检测其ph值及孢子数量，当其孢子数达到2×108/ml时，10000r/min离心10min，获得人参土壤短芽胞杆菌fjat-10657发酵上清液；
(4)香蕉炭疽病菌、龙眼焦腐病菌、枇杷炭疽病菌和莲雾黑腐病菌分别接入pda培养基上培养7d，加入5ml无菌水，轻轻刮取，收集上清液即为病原菌的孢子液，采用无菌水调整孢子浓度至1×106个/ml。将不同病原菌孢子液与pda培养基混合后(该pda培养基组分：马铃薯葡萄糖琼脂培养基46g、水1000ml，ph7.2)，制备成含有病原的平板，采用6mm打孔器进行打孔，在孔中加入50μl发酵上清液，以无菌水为对照，30℃培养48h后。该人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657发酵上清液对香蕉炭疽病菌、龙眼焦腐病菌、枇杷炭疽病菌和莲雾黑腐病菌抑菌圈直径分别为15.35mm、25.41mm、16.43mm、15.21mm。
4.测定人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657发酵上清液对香蕉炭疽病的防治效果
取外观整齐无病虫害的天宝香蕉，洗净晾干，75％酒精进行表面消毒。在果实中部针刺长3mm×宽3mm×深3mm伤口3个，每组处理10个香蕉，接入10μl1×106个/ml炭疽病孢子悬浮液，28℃培养24h。将香蕉浸泡在稀释10倍的人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657发酵上清液中2min后，晾干，置于28℃培养4d后，统计直径大于3mm的病斑数量，计算发病率。以无菌水处理为对照组。人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657发酵上清液对香蕉炭疽病防治效果为54.55％。
本发明提供了一种新的人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657，该人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657发酵上清液对香蕉炭疽病菌、龙眼焦腐病菌、枇杷炭疽病菌和莲雾黑腐病菌具有抑制作用，并且对香蕉炭疽病具有良好的防治效果，拓宽了香蕉炭疽病生物防治菌株筛选来源。
序列表
<110>福建省农业科学院农业生物资源研究所
<120>人参土壤短芽胞杆菌菌株及其应用
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>27
<212>dna
<213>(人工序列)
<400>1
agaccgggataacatagggaaacttat27
<210>2
<211>25
<212>dna
<213>(人工序列)
<400>2
ggcatgctgatccgcgattactagc25
<210>3
<211>21
<212>dna
<213>(人工序列)
<400>3
agagtttgatcactggctcag21
<210>4
<211>21
<212>dna
<213>(人工序列)
<400>4
acggctaccttgttacgactt21
<210>5
<211>1406
<212>dna
<213>（人参土壤短芽胞杆菌菌株fjat-10657的16srdna序列brevibacilluspanacihumi）
<400>5
tgcagtcgagcgagggtcttcggaccctagcggcggacgggtgagtaacacgtaggcaac60
ctgcccataagactgggataacatagggaaacttatgctaataccggatagagtcttctc120
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