本发明属于分析测试技术领域，具体涉及一种用于γ-谷氨酰转肽酶检测的maldi-tof质谱探针及其使用方法。
背景技术：
γ-谷氨酰转肽酶(ggt)对于维持体内谷胱甘肽和半胱氨酸的代谢具有重要作用，作为一个带有朝向细胞外表面活性位点的胞外酶，ggt能够特异性催化细胞外谷胱甘肽中γ-谷酰基的断裂产生半胱氨酸-甘氨酸，然后通过二肽酶进一步水解为半光氨酸和甘氨酸。由于恶性细胞对半胱氨酸的强依赖性，这种ggt触发的过程潜在地为肿瘤细胞的存活和繁殖提供了有利条件。所以，临床以ggt酶为肝胆疾病诊断的重要指标，广泛应用与肝病及其他脏器疾病的诊断和预后检测，此外，ggt酶是一种重要的癌症标志物，其在肝癌、子宫癌和宫颈癌等癌症中均出现高表达。
目前大部分的ggt检测基于比色法和荧光法，光谱法伴随着一定的限制，如需要荧光或者发色基团标签、合成困难较大、对激发条件要求较高、生物样品自发荧光干扰以及分子探针的光致漂白和猝灭现象。
另一个供选择的方法是质谱法，与光谱法相比质谱具有三大分析优势：一、质谱不需要发光标签或者对标签没有较高的要求，通过荷质比的准确测定来完成定性定量分析。这样就避免了复杂的高成本的探针合成过程；二、质谱能够同时检测多个化合物，包括底物，产物和内标，这样使得质谱扫描具有高度的灵活性，这种独一无二的性质使得质谱可以同时表征多个酶的活性和同时扫描针对不同酶的抑制剂；第三、质谱分析没有了来自光谱分析中自发荧光、光散射等因素的限制，这些优势可以降低假阳性分析结果。由于基质辅助激光解析离子化(maldi)质谱高灵敏度、高耐污染物能力以及高通量(几百个靶点同时分析以及软件自动化)的分析特点，maldi质谱已经成为用于蛋白酶的活性分析和抑制剂药物的筛选的重要工具。因此亟需一种低成本、高灵敏、大通量的maldi相配套的质谱探针用于ggt定量分析和药物筛选。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种用于γ-谷氨酰转肽酶(ggt)检测的maldi-tof质谱探针，用于ggt酶的定量分析以及相关抑制剂药物的筛选，相对比现有技术降低了分子探针合成成本和劳力，规避了光谱中基底光信号、光散射和光致漂白等现象干扰，实现了细胞溶菌体和人血清中ggt酶的快速和准确分析，可在同一靶板上实现对几百个样品的同时分析，大大提升了分析速度和效率。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种用于γ-谷氨酰转肽酶检测的maldi-tof质谱探针，结构式如下所示：
式i和ii。
本发明提供一种用于γ-谷氨酰转肽酶检测的maldi-tof质谱探针的使用方法，步骤如下：
a、配置不同浓度的ggt酶标准品的pbs溶液中，每种浓度的pbs溶液中均加入式ⅰ的分子探针的储备液，发生不同程度的酶切反应；之后加入式ii的内标溶液，混匀后取1μl样品与1μl基质在靶板上混合，干燥后进样分析；
b、制作标准曲线：以步骤a中ggt酶的不同活性值为横坐标，以步骤a中所述式ii的maldi信号强度占所述式i和式ii信号总强度的比值物(iii/ii+iii)为纵坐标，绘制标准曲线；
c、检测待测样品中的ggt酶的含量：将步骤a中的ggt酶标准品替换为待测样品，取样进行maldi质谱分析，将测定的iii/ii+iii带入步骤所述b中所得曲线，即可得到待测样品中的ggt酶的含量。
作为本发明的更优的技术方案：步骤c所述的待测样品溶液为pbs缓冲溶液，按所述步骤a的所述方法处理，用于抑制剂药物的大通量筛选。
作为本发明的更优的技术方案：步骤c所述的待测样品为复杂的实际生物样品，即含有大量的盐、蛋白、核酸、表面活性剂等容易干扰质谱信号的样品，如细胞溶菌产物和人血清，在步骤a所述的加入式ii的分子探针内标溶液后，再加入磁性纳米材料对式i的分子探针和式ii的内标分子进行装载，一步磁性分离和洗脱，将得到的样品与基质混匀干燥后进行maldi分析，随后将测定的iii/ii+iii值带入步骤所述b中所得曲线，即可得到待测样品中的ggt酶的含量。
作为本发明的更优的技术方案：所述磁性纳米材料为磁性氧化石墨烯、碳纳米管、量子点中的一种；进一步优选为磁性氧化石墨烯；磁性氧化石墨烯终浓度优选为0.1～2.5mg/ml，进一步优选为0.5mg/ml。
作为本发明的更优的技术方案：步骤a所述的pbs溶液ph值优选为5～9，进一步优选为7.4；溶液体积优选为50～5000μl，进一步优选为180μl；
作为本发明的更优的技术方案：所述步骤a中分子探针储备液和内标溶液的溶剂优选为水、甲醇和二甲基亚砜中至少一种，进一步优选为水。
作为本发明的更优的技术方案：步骤a中所述的ggt酶的浓度为0～100u/l，进一步优选为0～50u/l。
作为本发明的更优的技术方案：所述的步骤a中酶切反应温度优选为4～40℃，最优选为37℃。
作为本发明的更优的技术方案：步骤a所述的酶切时间优选为0.5～3h，最优选为1.5h。
作为本发明的更优的技术方案：步骤a所述式i的浓度优选为10～200μm，最优选为50μm；体积优选为10～200μl，最优选为20μl。
作为本发明的更优的技术方案：步骤a所述的式ii与式i的浓度比优选为0～1，最优选为0.4。
作为本发明的更优的技术方案：步骤a所述的基质优选为α-氰-4-羟基肉桂酸(chca)，2,5-二羟基苯甲酸(dhb)，三羟基苯乙酮，9-氨基吖啶，1,8-双二甲氨基萘中的一种，最优选为dhb基质。
本发明的用于γ-谷氨酰转肽酶检测的maldi-tof质谱探针的制备方法，其步骤如下：
(1)配置两份等量蒽醌50％乙腈/水溶液，分别加入等摩尔的谷胱甘肽(ecg)和谷胱丙肽(eca)，在常温条件下反应，得到式i和ii所示两种化合物；谷胱甘肽、谷胱丙肽和蒽醌的摩尔比是1:1；反应温度为20～40℃，反应时间为1～3h。
(2)减压蒸馏去除溶剂后使用硅胶柱进行纯化。
本发明具有以下优点：
1、本发明提供的质谱探针具备合成简单、质谱条件下稳定、小分子无干扰和强离子化的技术特点，灵敏度相对于谷胱甘肽的检测提升了四个数量级。
2、本发明将疏水性芳香环引入质谱分子探针，并通过磁性纳米材料一步的装载和释放，实现了对复杂样品中分子探针和内标的快速选择性分析。
3、本发明提供的质谱探针通过相似结构内标的设计，避免了同位素标签，实现了对ggt酶的准确定量测定。
4、本发明提供的质谱探针仅在ggt酶存在的条件下发生特异性断裂，其他常见的无机盐、氨基酸、糖、蛋白、水解酶等均不产生干扰。
5、本发明具备良好的灵敏度、重现性和选择性，适合用于抑制剂药物的快速筛选、细胞溶菌产物以及血清中ggt酶的定量分析。
6、本发明提供的质谱探针和方法与maldi质谱相配套使用，在靶板上可实现对几百个样品的同时分析，易于推广和应用。
附图说明
图1为本发明式i和式ii所示化合物的化学反应方程式与合成路线图；
图2为本发明谷胱甘肽(同为50μm)和分子探针(式i)的maldi谱图；
图3为maldi质谱对谷胱甘肽和其标签化分子探针的检测限评价；
图4为本发明分子探针的方法对不同浓度ggt的响应maldi谱图(左图从上到下ggt浓度依次为0，6.25，25.0和50.0u/l)和定量曲线；
图5为本发明探针和方法对不同无机盐、氨基酸、糖、蛋白、水解酶与ggt的响应评价；
图6为本发明探针和方法对抑制剂药物阿西维辛ic50的评价；
图7为本发明探针和方法对hela癌症细胞的maldi测定谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例所用的基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱仪的型号为autoflexspeedtof/tof(brukerdaltonics，germany)，激光为355nm波长的nd:yag激光器。质谱测试参数为加速电压：20.000kv；延迟引出电压：18.000kv；延迟引出时间：150ns；反射器电压：20.000kv；透镜电压：6.000kv；频率：500hz；激光器能量：0～100％；测试模式为反射正离子模式。
实施例1：本发明的分子探针和内标分子的制备。
在常温条件下，将4mmol谷胱甘肽(ecg)和4mmol三肽(eca)分别溶解在5ml50％乙腈/水(v/v)中，之后分别加入4mmol蒽醌，搅拌3h，减压蒸馏除去溶剂后用柱层析分离提纯得到棕黄色固体的最终产物，为式i和式ii，其结构确证结果如下：
式i：1hnmr(400mhz,298k,dmso-d6):δ:8.68(m,1h),8.29(m,1h),7.79(m,1h),7.02(s,1h),4.68(m,1h),3.80(d,2h,j＝6.0hz),3.36(d,2h,j＝6.0hz),3.15(m,1h),2.38(m,2h),1.97(t,2h).esi-ms:m/z516.443；
式ii：1hnmr(400mhz,298k,dmso-d6):δ:8.68(m,1h),8.29(m,1h),7.80(m,1h),7.02(s,1h),4.07(m,1h),4.24(m,2h),3.32(d,2h,j＝6.0hz),3.14(m,1h),2.36(m,2h),1.98(t,2h)，1.31(d,3h,j＝6.0hz).esi-ms:m/z530.467。
实施例2：对谷胱甘肽和式i的分子探针进行maldi质谱分析。
配置不同浓度谷胱甘肽和式i的分子探针的水溶液，取1μl样品溶液和等体积的chca基质(5mg/ml，溶解于50％乙腈/三氟乙酸水溶液(v/v))或dhb基质(20mg/ml，溶解于50％乙腈/三氟乙酸水溶液(v/v))在groundsteel靶板上直接混合，室温干燥后进行maldi质谱分析。
如图2所示为50μm谷胱甘肽和50μm分子探针的maldi测试对比谱图。此浓度下无法检测到谷胱甘肽的谱峰，传统基质存在大量的自身干扰峰，谱峰难识别，无法达到准确定性的目的。通过对标签化后的式i的分子探针分析，谱图避免了小分子基质干扰，可以检测到高峰度易识别的516的加氢峰，无碎裂谱峰。如图3所示为不同浓度谷胱甘肽和分子探针的maldi对比谱图，谷胱甘肽的可检测限为0.1mm,其谱图分辨率和检测限远无法满足酶底物测定要求。与之相比，分子探针的检测限相对谷胱甘肽提升了四个数量级，谱图易识别，满足定性和定量的前提要求。
实施例3：对不同浓度ggt酶的定量分析并绘制标准曲线。
配置500μmmaldi式i的分子探针和内标的水溶液作为储备液；
配置180μl浓度分别为0，3.125，6.25，12.5，25.0，35.0和50.0u/l的ggt酶标准pbs缓冲液(155.2mmnacl,2.97mm,na2hpo4,1.05mmkh2po4；ph＝7.4)，加入20μl分子探针的储备液，37℃水浴酶切反应1.5h。加入0.5μl甲酸溶液和8μl的内标溶液，混匀后取1μl样品溶液和1μldhb基质溶液在groundsteel靶板上直接混合，室温干燥后进行maldi质谱分析。以ggt酶的不同浓度值为横坐标，以内标(式ii)的maldi信号强度占内标(式i)和探针(式ii)信号总强度的比值物(iii/ii+iii)为纵坐标，绘制标准曲线。
从图4中可以看出，分子探针和内标分子具有清晰的质子化谱图，与ggt酶的浓度呈现良好的线性关系，表现出对ggt酶测定的良好准确度和重现性。
实施例4：评价本发明的分子探针对ggt的选择性。
分别配置含有不同添加物的pbs缓冲溶液(155.2mmnacl,2.97mm,na2hpo4,1.05mmkh2po4；ph＝7.4)，分别为150mmkcl，25mmfecl3，2.5mmcacl2，1mm谷胱甘肽，1mm谷氨酸(glu)，10um果糖(fructose)，10um牛血清白蛋白(bsa)，10um马肌红蛋白(myo)，10um转铁蛋白(tfr)，10000u/l胃蛋白酶(pepsin)，10000u/l胰蛋白酶(trypsin)和50u/lggt酶。分别20μl的分子探针的储备液加入180μl配置好的pbs缓冲溶液，37℃水浴酶切反应1.5h。加入0.5μl甲酸溶液和8μl的内标溶液后混匀，取1μl样品溶液和1μldhb基质溶液在groundsteel靶板上直接混合，室温干燥后进行maldi质谱分析，计算iii/ii+iii值。
如图5所示，对于不同的无机盐、氨基酸、糖、ggt酶与其他水解酶，分子探针只表现出对ggt酶的高选择性。
实施例5：使用本发明的分子探针测定ggt酶抑制剂药物阿西维辛ic50值。
配置不同浓度阿西维辛的pbs缓冲溶液(155.2mmnacl,2.97mm,na2hpo4,1.05mmkh2po4；ph＝7.4)，浓度分别为0.0001，0.001，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5和10mm。取20μl350u/lggt水溶液分别加入160μl配置好的pbs溶液，再加入20μl的分子探针的储备液混匀，37℃水浴孵育1.5h。随后加入0.5μl甲酸溶液和20μl的内标溶液并混匀。取1μl样品溶液和1μldhb基质溶液在groundsteel靶板上直接混合，室温干燥后进行maldi质谱分析。计算抑制效率1-iinhibitor/icontrol，iinhibitor和icontrol分别表示出现和不出现抑制剂时的iii/ii+iii值，测定抑制剂抑制曲线如图6所示。
实施例6：使用本发明的分子探针测定宫颈癌细胞中ggt酶含量。
hela细胞酶切后5000rpm离心5min，去上清液，使用pbs清洗两次后后将密度调整到6×106cell/ml,取2ml细胞悬浮液离心去上清液后加入2mlripa裂解液和8μl蛋白酶抑制剂，震荡均匀后在冰上冷却30min。最后将溶菌产物在13800rpm离心10min,悬浮液转移到新的移液管中备用。
取20μlhela细胞溶解产物，加入160μlpbs缓冲溶液和20μl分子探针储备液(终浓度为50μm)。37℃孵育1.5h后加入0.5μl甲酸终止反应。向反应液中加入8μl内标溶液和40μl3.0mg/ml磁性氧化石墨烯水溶液超声1h，一步分离后使用20μl50％乙腈/0.1％三氟乙酸水溶液洗脱，随后进行maldi质谱分析。
如图7所示为本发明maldi探针和方法用于hela细胞测定的maldi谱图，测定值为265.8u/l。
实施例7：使用本发明的质谱探针测定人血清中ggt酶的含量
取40μl血清样品与140μlpbs缓冲溶液混合，加入20μl的分子探针的储备液，37℃水浴酶切反应1.5h。加入0.5μl甲酸溶液和20μl的内标溶液。混匀后加入40μl磁性氧化石墨烯水溶液，超声1h，磁性分离并水洗一次，最后用20μl50％乙腈/0.1％三氟乙酸水溶液洗脱。
取1μl样品溶液和1μldhb基质溶液在groundsteel靶板上直接混合，室温干燥后进行maldi质谱分析。按照实施例3中的检测制作标准曲线，将测试的结果带入标准曲线计算出5倍稀释的血清中ggt的量，进而换算得到人原血清中ggt的量。同时，使用elisa试剂盒(酶联法)同时分析血清中ggt的量，结果如表1所示。
本发明的方法和传统的酶联法测定的结果十分接近，二者90％置信度区间内不存在显著性差异，再次确证本专利的maldi探针和方法可以准确的测定血清中ggt的含量。
表1.血清中ggt酶含量的测定