本发明涉及园林
技术领域：
，特别地涉及一种获得抗萎蔫绣球花的方法。
背景技术：
：绣球hydrangeamacrophylla亦叫八仙花，属虎耳草科落叶灌木。原产我国中部和南部，现南北都有栽培，喜半阴、温暖、湿润的环境，要求富含腐殖质，湿润、排水良好的酸性土壤，ph4.0～4.5。其花色与土壤的酸碱度有密切联系。落叶灌木、丛生，高1～4m，伞房花序，顶生呈球形，初开时白色，后转蓝色，将谢时粉红色，花期5～7月，花期长，花大饱满，现广泛栽培，市场需求量很大，仅依靠扦插远远不能满足市场的需求，同时由于栽培管理措施不当，性状易发生退化。绣球鲜切花美观、寓意美好，但及难养护，尤其是在北方干燥环境下，绣球鲜切花几乎在离体次日即会发生不同程度且不可逆的萎蔫，为解决此问题，本发明提供一种获得抗萎蔫绣球花的方法。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供一种获得抗萎蔫绣球花的方法。本发明是以如下技术方案实现的：本发明提供一种获得抗萎蔫绣球花的方法，所述方法包括向绣球植株中引入xre纤维素过表达基因，使绣球植株表达xre纤维素过表达蛋白。进一步地，所述方法包括：步骤一、构建含有xre纤维素过表达蛋白的重组克隆载体将合成的xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列连入克隆载体pgem-t上，操作步骤按promega公司产品pgem-t载体说明书进行，得到重组克隆载体xre01-t，然后将重组克隆载体xre01-t用热激方法转化大肠杆菌t1感受态细胞，其热激条件为：50μl大肠杆菌t1感受态细胞、10μl质粒dna，42℃水浴30秒；37℃振荡培养1小时，在表面涂有iptg和x-gal的氨苄青霉素的lb平板上生长过夜；挑取白色菌落，在lb液体培养基中于温度37℃条件下培养过夜，碱法提取其质粒，将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液iii，立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度为70％的乙醇洗涤后晾干；加入30μl含rnase的te溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化rna；于温度-20℃保存备用；提取的质粒经kpni和bgli酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体xre01-t中插入的所述xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列为序列表中seqidno:2所示的核苷酸序列，即xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列正确插入，步骤二、构建含有xre纤维素过表达基因的重组表达载体用限制性内切酶ncoi和swai分别酶切重组克隆载体xre01-t和表达载体pcambia2301，将切下的xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列片段插到表达载体pcambia2301的ncoi和swai位点之间，构建成重组表达载体pcamxre01，其结构包括kan：卡那霉素基因；rb：右边界；prubi：玉米泛素基因启动子；xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列；tnos：胭脂碱合成酶基因的终止子；pmi：磷酸甘露糖异构酶基因；lb：左边界；将重组表达载体pcamxre01用热激方法转化大肠杆菌t1感受态细胞，碱法提取其质粒，将提取的质粒用限制性内切酶ncoi和swai酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体pcamxre01在ncoi和swai位点间的核苷酸序列为序列表中seqidno:2所示核苷酸序列，即xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列；步骤三、获得转基因绣球植株从绣球植株上剪取约2.0-3.0cm长的嫩茎，去掉叶子，先用自来水冲洗，再用毛刷擦上去污粉反复擦洗，然后用纯净水冲洗，在无菌条件下，依次用75％酒精浸泡10-20s，0.1％的升汞溶液浸泡6-8min，无菌水冲洗5-6次，最后将处理好的嫩茎切成约0.5-1.0长的带芽茎段，按照常规采用的农杆菌侵染法，与所述的重组表达载体转化的农杆菌共培养，接种在预启动培养基上，预启动培养基采用ms培养基，ms培养基加入6-ba3mg/l，naa0.1mg/l，外植体接种2周后，腋芽膨大萌动长出叶片，将上述获得的无菌芽转接到分化培养基上进行增值培养以扩大繁殖系数，继代过程中，绣球无菌苗的茎段易形成酚类物质，造成转接时污染率增加，可加入抗坏血酸进行处理，分化增殖到3-4cm高时，进行生根培养，以1/2ms作为基本培养基添加蔗糖35g/l，琼脂5.0g/l，iba1mg/l，最终获得转基因绣球植株。进一步地，所述分化培养基配比优选地为ms+3mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+0.4mg/lga。本发明的有益效果：本发明提供了一种获得抗萎蔫绣球花的方法，通过基因工程改造植物，所述植物具有基本上集中在植物的木质部组织导管的木质素沉积或木聚糖沉积，以获得增加的次生细胞壁沉积或增加的蜡/角质积累。本发明的经工程改造的植物可用于生物能生产，通过提高源自所述植物的生物质的密度和纤维素含量达到抗倒伏、抗萎蔫的目的。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。实施例1：获得纤维素过表达蛋白的核苷酸序列xre纤维素过表达蛋白的氨基酸序列(754个氨基酸)，如序列表中seqidno:1所示；编码相应于所述xre纤维素过表达蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列(2262个核苷酸)，如序列表中seqidno:2所示。所述xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列(如序列表中seqidno:2所示)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。合成的所述xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列(seqidno:2)的5’端还连接有ncoi酶切位点，所述xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列(seqidno:2)的3’端还连接有swai酶切位点。实施例2：重组表达载体的构建及重组表达载体转化农杆菌1、构建含有xre纤维素过表达蛋白的重组克隆载体将合成的xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列连入克隆载体pgem-t(promega，madison，usa，cat：a3600)上，操作步骤按promega公司产品pgem-t载体说明书进行，得到重组克隆载体xre01-t。然后将重组克隆载体xre01-t用热激方法转化大肠杆菌t1感受态细胞(transgen，beijing，china，cat：cd501)，其热激条件为：50μl大肠杆菌t1感受态细胞、10μl质粒dna，42℃水浴30秒；37℃振荡培养1小时(100rpm转速下摇床摇动)，在表面涂有iptg(异丙基硫代-β-d-半乳糖苷)和x-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷)的氨苄青霉素(100mg/l)的lb平板(胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l、琼脂15g/l，用naoh调ph至7.5)上生长过夜。挑取白色菌落，在lb液体培养基(胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl10g/l、氨苄青霉素100mg/l，用naoh调ph至7.5)中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒：将菌液在12000rpm转速下离心1min，去上清液，沉淀菌体用100μl冰预冷的溶液i(25mmtris-hcl、10mmedta(乙二胺四乙酸)、50mm葡萄糖，ph8.0)悬浮；加入150μl新配制的溶液ii(0.2mnaoh、1％sds(十二烷基硫酸钠))，将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液iii(4m醋酸钾、2m醋酸)，立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度(v/v)为70％的乙醇洗涤后晾干；加入30μl含rnase(20μg/ml)的te(10mmtris-hcl，1mmedta，ph8.0)溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化rna；于温度-20℃保存备用。提取的质粒经kpni和bgli酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体xre01-t中插入的所述xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列为序列表中(seqidno:2)所示的核苷酸序列，即xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列正确插入。2、构建含有xre纤维素过表达基因的重组表达载体用限制性内切酶ncoi和swai分别酶切重组克隆载体xre01-t和表达载体pcambia2301(cambia机构提供)，将切下的xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列片段插到表达载体pcambia2301的ncoi和swai位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体pcamxre01，其结构包括kan：卡那霉素基因；rb：右边界；prubi：玉米泛素(ubiquitin)基因启动子；xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列(seqidno:2)；tnos：胭脂碱合成酶基因的终止子；pmi：磷酸甘露糖异构酶基因；lb：左边界。将重组表达载体pcamxre01用热激方法转化大肠杆菌t1感受态细胞，碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶ncoi和swai酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体pcamxre01在ncoi和swai位点间的核苷酸序列为序列表中seqidno:2所示核苷酸序列，即xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列。实施例3：转基因绣球植株的获得从绣球植株上剪取约2.0-3.0cm长的嫩茎，去掉叶子，先用自来水冲洗，再用毛刷擦上去污粉反复擦洗，然后用纯净水冲洗。在无菌条件下，依次用75％酒精浸泡10-20s，0.1％的升汞溶液浸泡6-8min，无菌水冲洗5-6次，最后将处理好的嫩茎切成约0.5-1.0长的带芽茎段，按照常规采用的农杆菌侵染法，与实施例2中3所述的重组表达载体转化的农杆菌共培养，接种在预启动培养基上，预启动培养基采用ms培养基，ms培养基加入6-ba3mg/l，naa0.1mg/l。外植体接种2周后，腋芽膨大萌动长出叶片。将上述获得的无菌芽转接到分化培养基上进行增值培养以扩大繁殖系数，分化培养基最佳比例为ms+3mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+0.4mg/lga，继代过程中，绣球无菌苗的茎段易形成酚类物质，造成转接时污染率增加，可加入抗坏血酸进行处理。分化增殖到3-4cm高时，进行生根培养，以1/2ms作为基本培养基添加蔗糖35g/l，琼脂5.0g/l，iba1mg/l，最终获得转基因绣球植株。实施例4：转基因绣球植株抗萎蔫能力测试选取花序轴长度、粗度、花径大小一致的鲜切绣球。用刀片将花材末端斜切，切口保持一致，留下单花头。枝长统一为15cm。处理过程速度要快，但是要注意不要损伤花序。有任何损伤的花序要弃掉。取试剂瓶5个，编号为1-5，向1-3号瓶中加入实施例3中获得的转基因绣球，4-5号瓶中加入非转基因绣球，25℃恒温、湿度稳定的环境下，每天定时定点观察绣球的花序轴挺拔度，花瓣枯萎度并记录整理，记录5日。2.萎蔫程度的评定从切花插入保鲜液开始，每隔24h观察1次花瓣枯萎度，花序轴挺拔度。初始分为abcde等。切花评分参考标准如下：a分：花瓣色纯正，没有色变，很鲜艳，膨胀度很好，花序轴笔直；b分：有稍微色变，但鲜艳，花瓣色轻微黯淡，但还纯正，花序轴有微微弯曲；c分：花瓣有轻微色变且花色较黯淡，花瓣膨胀度较差，花序轴略弯曲，曲度小于90度；d分：花瓣色变较明显，花瓣色黯淡或膨胀度较差，花序轴已经弯曲较为严重，曲度大于90度；e分：花瓣色变明显，花瓣有坏死斑块或斑点，花瓣已经明显失水，花序轴对花几乎无支撑力。观察时，每个试剂瓶中的每支绣球花都评分，具体评分结果见表1。表1转基因绣球植株抗萎蔫能力测试编号第一日第二日第三日第四日第五日1aabdd2aabce3aabde4adeee5adeee由上表结果可见，转基因绣球抗萎蔫能力相较于普通绣球花显著提高。以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。序列表<110>范瑶飞<120>一种获得抗萎蔫绣球花的方法<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>755<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<223>xre纤维素过表达蛋白的氨基酸序列<400>1leuthrasnilegluargserglyalacyslysasptrpleugluphe151015ilehisalailealaleuleuvalglulysproasncysileleuarg202530aspleuglnalaargglyproalaargtyrserserleuserproasp354045leucysargglyileleuphealagluserleuvalleuvalargser505560alaalaileleuleuprotrpcysglngluargglyleualaalaphe65707580argglytrppheleualaalaasnpheglnasnproproglyargarg859095serglyleuleuargglypheasnmetglnvalleuthrglyserasn100105110leuphemethisaspgluleuhistyrtrpserlysasnaspleuile115120125alapheleugluilecyslysprogluvalleuleuglythrleuval130135140tyrproprogluilephevalglyalasertyrserleuasnprotrp145150155160cystyrgluphegluvalargasnasnlysleuphetyrtyrproasp165170175glyvalargsergluglytyrgluglnproleugluglyglypheleu180185190leuglnthrserlysileargleualaaspglyvalvaltyrcysval195200205aspleuilecysserlyspheserhishismetvalserilethrarg210215220glygluleuvalvalprothrtyrargserpheglyprophegluala225230235240ilelysseraspglyleulysaspileserargleuproalaileser245250255lysthrglyglnalailecystyrglyglnileleuthrthrserser260265270lysargthrcysglylysvaltyrglyglyileglnserglyhislys275280285hisglylyshisthrgluhisalaglnargargthrcysalaleuleu290295300arglyspheargglngluthralacysservalglylysasnlysgly305310315320tyrgluaspglyleuproargleuhisargleulysthrleuvalarg325330335glycysgluilegluargasnseralailegluglnilepheglnile340345350leuproargglyasnglypheleuglyarglyshisargthrlysleu355360365gluargmettrpcysalaserargvaltyralaileargargaspile370375380asnthrargalavalarghisvalglyargargpheglnglnglyser385390395400phethralaglnvalglutrptrpphetrpmetargtyrsercysthr405410415argargglyserleuiletrpsercyssertyrtyrleuleuarghis420425430valtyrsercystrpalaileproalalysalailemetileglnarg435440445lysileglyglnserleuaspargserasnargileleuseralacys450455460leulysglyglyleuileglythrthrtyrargalathrasppheasn465470475480leuargserleulysaspvalcysargvalproleuhisleuthrile485490495asnprophevalasnsercystrpargglymetglnserthrarggly500505510glnilemetglnlystrpargleuserprohisleumetargargarg515520525leuphelysleuileserglyvalseralaasnalahisservallys530535540valglnalaargphelyslysalaalatrpleuvalthrtyrglnarg545550555560alaprometserlysaspglyserproleuleuilemetlysargleu565570575metargvallysileasnthrsertrpleuserargtyralasercys580585590glythrleualacysargthrthrleulysilethrprothrserarg595600605proiletrpaspprosertrpglyileserargsercysalapheleu610615620alalysargalahispheserserthrargtrpproilecyscysser625630635640hisphetyrasnmetileserargglumetsergluphealasergln645650655alametilecysvalglnthrlysasncysthrasnarglysasnthr660665670lysglyphetrpglyserasnlysproargcysvalthrleuglnval675680685glnproseralaglyglythrvalglnthrgluserserargasnhis690695700sersercysleuservalcysalaserprolyslysproilethrtrp705710715720prothralathrilemetglnleulyspheprometleuiletrpval725730735arggluprolysasnvalvalargarglysleuthrleuserthrile740745750alacysglu755<210>2<211>2262<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>unsure<223>xre纤维素过表达蛋白的核苷酸序列<400>2atccttacctgggtcgtaagtagacagtcgctcacgacaccagcgagtgatctgtaccgt60catcactaagaaccggctctaagcctagcatctcaaattttaccgcaaccggcctgcacc120atatgaaactcaggcttcgggagatgggggtcgtatcgtctaacacgcagcgtgaaatca180tctttcgacagtcggctccacgtacgaggatccctgctttcgtttttaccatccagcgtc240ttaattctaacactcgcgtgtaaaggaaatcgggtcctcgtcgctcactcgctgtcagat300cgcacgttaaattgattcttgatcctcgttcggttatttagaaaatctagtttcagcctg360cccaggtgctcttgtttagaacgtactcagaatcaaatacgccgtatccctgtcttagga420gtttgtcagagcctatgcgcgcgaagccctagccgggtatgcttttaaaacttcaacttg480ttcgtcggagacggcaaaggatatgttctagcgggttgatggagaactaggtcagtgcgt540ccgccgcgtgctcgtgggcggcgtgcgtcccacttgatgcctataggagctgaatgcggt600ctgtgagcaataccataccgctgtatatggtagccttggacgttcgtacatactgaatta660gagtcccgaattccgacgccccaaacacattagagatataatactggagctccattcacc720gtccctttcgaataagtcgccgaggtacactctctcgttatgcggttctggtctgatatt780atttgggggctccttcctcgtcatcctttggccgtctaagcccaaacgatgtgttggatt840gccctagacagctatggcattcgcaggtataacgttgtatcccgatgcaggggggacgac900aaaaccattgggttcttgatatgcgccctttacatctagtcgaaaggaacgtggtcttgg960aaatacctaaatcaaactaggcgcatggcgtcagccgctctatatgagcacagtcgcgta1020taggggttcgagagggatttacgtgaattgaaggatgtagcccgtatttggtctgtgatg1080gcaccgacagcattatggtcgcgaggctacttggcagagctggaacgatcggccagagca1140tcattaaagtccctttgttgacccctcacggcattacctacgcgaacatcgttgcgactt1200gctacgcttgcacgcatttatatggcgggaatattgcactagttatagcctcctcaacaa1260gtacattctataaatacttttgagagtcatggagtggtggtccggttttagaaatccggg1320ttcagatgtcgttaagcgctcggcttatgggtcgtgttcaaaaacaggccgctctctccc1380actggagatttgacacggtattgccatgaacggagttgtagatagcgtgtaagttgggga1440accgtacagactttccgacataaagcggaagaggcaacgagacatttacagtgattccgt1500acggtagggcgccgcgcttagtcggagcctccggtacctggctgggtggaagagcgcaat1560tcggtggcaagttggtcgaaacgttagcccataacccacttgagcagtccactagacaca1620tctgtaagggataaaattcgcgtgaccgacactaattttgagagcgccataggactctac1680gccagcaagcgttatcgtaatccaattaaatagttaggtccagaacgtagatgcagatta1740gatgctattaaagaggctgctcgtaactgagtgacccgatcaatatggattagtaatggt1800atgctatcggtgcttcaatcggtaaaagggggtcacagctactcactagttcattacgat1860gagtcacgagcgacgaatggtccacacggataaatgccccgattttaaccactgctaggc1920atcttctac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