一种食源性大豆生物活性肽Lunasin的无柱式、低成本制备方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体是一种食源性大豆生物活性肽lunasin的无柱式、低成本制备方法。

背景技术：

lunasin(露那辛)是来源于大豆的含有43个氨基酸的生物活性肽，最早由日本新泻大学医学部小组成员于1987年在从大豆种子中分离鉴定而来。近年来研究表明该活性肽具有抑制细胞增殖的作用。lunasin含有一个细胞粘附序列arg-gly-asp(rgd)，此序列可与细胞外基质相连，导致lunasin内化进入细胞核，lunasin的c末端含有8个天门冬氨酸残基,可以结合到去乙酰化的染色质区(如,着丝粒),导致着丝粒复合体不能正确形成，而使微管不能捕捉到着丝粒,从而导致有丝分裂中止，抑制了细胞有丝分裂的发生。另外，最新的研究表明，lunasin还具有通过抑制nf-кb信号通路而抑制炎症的发生。因此，作为食源性的大豆生物活性肽lunasin，不仅可为机体提供生长发育所需的蛋白质营养，而且由于其潜在的抑制细胞增殖、抗癌、抗炎等生物学活性，将来可在功能食品、保健品、生物医药等领域具有很好的开发前景。

然而目前lunasin的获取通常利用层析等分离手段从大豆中获得，这种方法操作繁琐，步骤复杂，重复性差，成本昂贵，不利于工业化生产。另外一种方法为化学合成，化学合成手段虽然增加了产物的纯度，但成本昂贵，仅适合于实验室基础的研究。除此之外，采用基因工程手段制备lunasin的方法，虽然可以在大肠杆菌获得大量的重组lunasin蛋白，但在纯化阶段都要利用亲和层析的方法，并且所获的重组蛋白，往往带有纯化标签，为非天然n端的蛋白，这往往对其生物学活性以及免疫反应造成影响。探索一种简易快捷且成本较低的方法获取天然n端lunasin对于其开发利用具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是建立了一整套lunasin原核重组表达与纯化的体系，采用无柱纯化系统，提供一种食源性大豆生物活性肽lunasin的无柱式、低成本制备方法。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种食源性大豆生物活性肽lunasin的无柱式、低成本制备方法：首先采用overlappingextensionpcr方法获取lunasin基因片段，以及在此基础上获取npuc-lunasin融合片段，实现融合片段在表达载体pet26的融合表达；融合表达类弹性蛋白elp标签和dnae断裂内含肽的n端；最后利用断裂内含肽的反式剪接和elp的可逆循环相变，实现简单、快速、无柱式、低成本分离纯化天然n端的重组lunasin多肽。

上述制备方法具体步骤如下：

1.lunasin基因的获得

上下游引物如下：

上游引物：

5-tctaaatggcagcaccagcaggactcttgccgtaaacagctgcagggtgttaacctgaccccgtgcgaaaaacacatc-3

下游引物：

5-ttactagtcatcgtcatcgtcatcgtcatcgtcaccacgaccctggattttttccatgatgtgtttttcgcacggggtc-3

(1)根据pdb上发表的lunasin氨基酸序列，用optimizer和genedesigner对lunasin编码基因进行密码子优化并合成基因，并送交上海生工公司进行合成。对上下游引物进行overlappingextensionpcr，获得lunasin。获得pcr产物经过2％脂糖凝胶电泳鉴定后再由凝胶回收试剂盒回收lunasin。

(2)lunasin基因t载体构建

将lunasin基因连接至pmd19-tsimplevector，之后转化至dh5感受态菌，涂布与含有抗性的lb平板，获得的菌落进行pcr鉴定，并挑选阳性克隆扩大培养后送至上海生物工程有限公司测序。测序结果与genbank提供的lunasin序列比对，鉴定序列正确后将重组质粒命名为pmd19-t-lunasin。

2.npuc-lunasin融合基因克隆载体构建与鉴定

(1)lunasin基因扩增

引物设计：

上游引物1：tagcttctaattctaaatggcagcaccagcag

下游引物1：ccgctcgagttactagtcatcgtcatcgtcatcg

以含有lunasin片段的t载体pmd19-t-lunasin为模板，使用上游引物1和下游引物1对lunsian基因进行pcr扩增。

(2)npuc基因扩增

引物设计：

上游引物2：ttagaaggcatatgatcaaaatagccacacgtaaatatttagg

下游引物2：gctggtgctgccatttagaattagaagctatgaagccatttttg

以pet-npuc-gfp质粒为模板，使用上游引物2和下游引物2对npuc基因进行rcr扩增。

(3)npuc-lunasin融合基因扩增

分别以npuc、lunasin模板，使用上游引物上游引物2、下游引物1进行overlap并以此结果为模板进行pcr扩增，pcr产物经过2％琼脂糖凝胶电泳鉴定后再由凝胶回收试剂盒回收得到npuc-lunasin基因。

(4)融合基npuc-lunasin片段的ta克隆

将npuc-lunasin基因连接至pmd19-tsimplevector，之后转化至dh5感受态菌，涂布与含有抗性的lb平板，获得的菌落进行pcr鉴定，并挑选阳性克隆扩大培养后送至上海生物工程有限公司测序。测序结果用sequence软件分析并与已知序列进行比对分析，鉴定序列正确后将重组质粒命名为pmd19-t-npuc-lunasin。

3.融合基因npuc-lunasin表达载体构建与鉴定

将含有pmd19-t-npuc-lunasin及pet26-b(+)质粒的大肠杆菌分别扩大培养并进行质粒提取，之后用ndei和xhoi进行双酶切。切胶回收酶切产物npuc-lunasin片段和pet26-b(+)目的片段，连接过夜。将连接产物转化转化大肠杆菌dh5感受态细胞，涂布到抗性lb固体培养基。培养16h后挑选阳性菌落进行扩大培养，并进行质粒提取及ndei、xhoi双酶切鉴定，将构建成功的重组表达质粒命名为pet26-npuc-lunasin。

4.lunasin在大肠杆菌中的诱导表达及纯化

(1)pet26-npuc-lunasin多肽的诱导表达

将筛选得到的阳性菌株提取pet-26-npuc-lunasin质粒，取1μl质粒转化氯化钙制备的表达菌株bl21(de3)感受态细胞。涂布到lb平板上，37℃倒置培养。将阳性菌株接种到lb培养基中，37℃培养，iptg诱导表达6h。6000rpm离心菌液，弃上清。每克湿菌加入10ml20mmtris-hcl7.4buffer(含pmsf)，超声破碎。破碎后的菌体进行sds-page鉴定。

(2)elp介导的lunasin的分离纯化

1)elp-n诱导表达和纯化

利用含有pet-elp-n的菌株接种到lb培养基中37℃培养，iptg诱导表达6h。6000rpm离心菌液，弃上清。每克湿菌加入10ml20mmtris-hcl7.4buffer(含pmsf)，超声破碎。将重组菌裂解物离心上清与等体积0.8mol/l(nh4)2s04混合，在30℃下孵育10min，14000g离心5min，收集离心沉淀即为初步纯化的elp-n融合蛋白。

2)lunasin纯化

将预纯化elp-n与npuc-lunasin超声上清混合，室温孵育10min，将上清混合液与等体积0.8mol/l(nh4)2s04混合，在确定30℃下孵育10min.14000g离心5min，收集离心沉淀在优化后的切割液(50mmdtt)中，室温孵育3h后，加入等体积0.8mol/l(nh4)2s04孵育10min，14000g离心5min，对上清、沉淀取样后进行ticine/sds-page分析。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：构建断裂内含肽和类弹性蛋白(elastin-likepetide,elp)介导的npuc-lunasin重组蛋白表达与纯化系统，首先合成lunasin基因，其次，将pcr扩增的npuc(c-terminalfragmentofnostocpunctiforme,npuc)序列、lunasin序列通过overlappingextensionpcr方法获取融合基因npuc-lunasin，然后插入原核表达载体pet-26b，获得融合表达载体pet-npuc-lunasin。分别将pet-elp-n和pet-npuc-lunasin转化大肠杆菌，对其重组蛋白表达、混合、逆向相变循环沉淀及npu自体裂解条件进行优化，最终获取无标签lunasin(nativerecombinationlunasin)。以elp标签介导的纯化方法不仅成本较为低廉，且操作相对简单，经济节约，并且纯化的重组多肽不带有任何标签蛋白，避免了临床应用中机体对目的蛋白产生的免疫现象。该生物活性肽npuc-lunasinn表达纯化体系的建立，为lunasin今后规模化低成本生产该生物活性肽提供实验基础。

附图说明

图1为lunasinpcr琼脂糖电泳；

泳道1：dl2000marker；泳道2、3、4、5：lunasin基因(175bp)pcr结果；

图2为pmd19-t-lunasin重组质粒t载体的pcr鉴定(2％agarose)；

泳道1：dl2000marker；泳道2、3、4、5、6：pmd19-t-lunasin重组质粒t载体的pcr结果；

图3a为lunasin、npuc基因扩增结果图，m：marker；泳道1：npuc；泳道2：lunasin；

b为重组npuc-lunasin融合基因pcr结果图，m：marker；泳道1、2、3、4：重组npuc-lunasin(263bp)融合基因pcr结果；

图4anpuc-lunasin基因t载体连接情况的pcr鉴定结果，m：marker；泳道1：npuc-lunasin(263bp)pcr产物结果；

b为npuc-lunasin基因与t载体连接情况的双酶切鉴定结果，m：marker；泳道1、2：双酶切结果；

图5a为菌落pcr结果，m：marker；泳道1：npuc-lunasin；

b为表达载体双酶切鉴定结果，m：marker；泳道1：npuc-lunasin重组表达载体酶切结果；

图6为重组蛋白elp-n表达及纯化结果图；

m：蛋白marker；泳道1-3：iptg诱导之前；泳道4-8：0.5mmiptg诱导6h诱导后；泳道9：0.5mmiptg诱导6h诱导后westen-blot分析结果；

图7为npuc-lunasin表达及纯化结果；

m：蛋白marker；泳道1-3：iptg诱导之前；泳道4-8：0.5mmiptg诱导6h后；

图8为lunasin纯化结果；

m：蛋白marker；泳道1：预纯化elp-n；泳道2：npuc-lunasin的可溶性裂解液；泳道3：样品来自泳道1和2；泳道4：elp复合物沉淀后的上清液；泳道5：elp-n和npuc-lunasin的混合物0h；泳道6：elp-n和npuc-lunasin的混合物在22℃条件下混合3h；泳道7：3小时后的elp沉淀；泳道8-9：3h后硫酸铵沉淀后含有lunasin的上清液。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明做进一步说明。

一种食源性大豆生物活性肽lunasin的无柱式、低成本制备方法，包括以下步骤：

1.一种食源性大豆生物活性肽lunasin基因获得

(1)pcr反应获得目的基因

根据pdb上发表的lunasin氨基酸序列，用optimizer和genedesigner对lunasin编码基因进行密码子优化并合成基因，并送交上海生工公司进行合成。使用对上下游引物对lunasin基因进行pcr扩增，pcr体系为50ul，反应条件为：94℃5min；(94℃30s；50℃30s；72℃1.5min)30cycles；72℃10min。pcr产物经过2％琼脂糖凝胶电泳鉴定后再由凝胶回收试剂盒回收得到lunasin基因。结果如图1所示，pcr扩增得到的lunasin基因经琼脂糖凝胶电泳分析，其条带大小为175bp与genebank所发布的大小一致。

(2)lunsian基因片段的ta克隆

将lunasin基因片段连接至pmd19-tsimplevector，连接体系为：pmd19-tsimplevector，1μl(50ng)；目的基因，2ul(30ng)；h2o，1ul；solution，5μl。之后转化至dh5感受态菌，涂布与含有抗性的lb平板，获得的菌落进行pcr鉴定，结果如图2所示。并挑选阳性克隆扩大培养后送至上海生物工程有限公司测序。测序结果与genbank提供的lunasin序列比对，鉴定序列正确后将重组质粒命名为pmd19-t-lunasin。

2.无柱式lunasin纯化

(1)npuc-lunasin融合基因克隆载体构建与鉴定

1)lunasin扩增

以含有lunasin的pmd19-t-lunasin为模板，使用上下游引物扩增lunasin。pcr体系为50ul，反应条件为：94℃5min；(94℃30s；50℃30s；72℃1.5min)30cycles；72℃10min。pcr产物经过2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图3a所示。

2)npuc扩增

以含有npuc的pet-npuc-gfp为模板，使用上下游引物扩增npuc。pcr体系为50ul，反应条件为：94℃5min；(94℃30s；50℃30s；72℃1.5min)30cycles；72℃10min。pcr产物经过2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图3b所示。

3)npuc-lunasin融合基因扩增

利用npuc的上游引物和lunasin下游引物，对npuc、lunasin进行overlap并以此结果为模板进行pcr扩增，pcr体系为50ul，反应条件为：94℃5min；(94℃30s；55℃30s；72℃1min)30cycles；72℃10min。pcr产物(npuc-lunasin)经过2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图4a所示。

4)融合基因npuc-lunasin的ta克隆

将npuc-lunasin基因连接到t1-simple，连接体系为2ul目的基因，1μlt1-simple，25℃反应5min。之后转化至dh5感受态菌，涂布与含有抗性的lb平板，获得的菌落进行pcr鉴定，结果如图4b所示。并挑选阳性克隆扩大培养后送至上海生物工程有限公司测序。序结果用sequence软件分析并与已知序列进行比对分析。鉴定序列正确后将重组质粒命名为pmd19-t-npuc-lunasin。

(2)融合基因npuc-lunasin表达载体构建与鉴定

将含有pmd19-t-npuc-lunasin及pet26-b(+)质粒的大肠杆菌dh5分别扩大培养并进行质粒提取，之后用采用ndei、xhoi进行双酶切。切胶回收酶切产物片段npuc-lunasin和pet26-b(+)目的片段，按照1:10的摩尔比16℃连接过夜。将连接产物转化dh5感受态细胞(100ul)，涂布到50g/ml浓度氨苄青霉素抗性lb固体培养基。培养16h后挑选阳性菌落进行扩大培养，并菌落pcr(如图5a所示)和ndei、xhoi双酶切鉴定(如图5b所示)，可见条带大小与重组蛋白基因大小一致，证明连接成功。将构建成功的重组表达质粒命名为pet26-npuc-lunasin。

(3)npuc-lunasin多肽表达

将含有pet26-npuc-lunasin质粒的阳性菌株接种到lb培养基中，37℃培养，0.5mmiptg诱导表达6h。6000rpm离心菌液，弃上清，菌体进行ticine/sds-page分析如图6所示。收集湿菌按照每克湿菌10ml20mmtris-hcl7.4buffer(含pmsf)，超声破碎，离心收集上清。

(4)pet26-npuc-lunasin多肽的纯化

1)elp-n的表达和纯化

利用含有pet-elp-n的菌株接种到lb培养基中37℃培养，0.5mmiptg诱导表达6h。6000rpm离心菌液，弃上清，菌体进行ticine/sds-page和western-blot分析如图7所示。收集到每克湿菌加入10ml20mmtris-hcl7.4buffer(含pmsf)，超声破碎，离心收集上清。将重组菌裂解物离心上清与等体积0.8mol/l(nh4)2s04混合，在30℃下孵育10min，14000g离心5min，收集离心沉淀即为初步纯化的elp-n融合蛋白。

2)elp介导npuc-lunasin的纯化

将预纯化elp-n与npuc-lunasin超声上清混合，室温孵育10min，将上清混合液与等体积0.8mol/l(nh4)2s04混合，30℃下孵育10min，14000g离心5min，收集离心沉淀。沉淀中加入50mmdtt切割液，室温孵育3h后，加入等体积0.8mol/l(nh4)2s04孵育10min，14000g离心5min，对上清、沉淀取样后进行ticine/sds-page分析如图8所示。

序列表

<110>大连大学

<120>一种食源性大豆生物活性肽lunasin的无柱式、低成本制备方法

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>75

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tctaaatggcagcaccagcaggactcttgccgtaaacagctgcagggtgttaacctgacc60

ccgtgcgaaaaacac75

<210>2

<211>79

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ttactagtcatcgtcatcgtcatcgtcatcgtcaccacgaccctggattttttccatgat60

gtgtttttcgcacggggtc79

<210>3

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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<210>4

<211>34

<212>dna

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<400>4

ccgctcgagttactagtcatcgtcatcgtcatcg34

<210>5

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<212>dna

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<400>5

ttagaaggcatatgatcaaaatagccacacgtaaatatttagg43

<210>6

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

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<210>7

<211>129

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

tctaaatggcagcaccagcaggactcttgccgtaaacagctgcagggtgttaacctgacc60

ccgtgcgaaaaacacatcatggaaaaaatccagggtcgtggtgacgatgacgatgacgat120

gacgatgac129