本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种异鳞蛇鲭的荧光pcr检测方法及其引物和探针。
背景技术：
鳕鱼被称为“餐桌上的营养师”，可见它的营养价值之高。但市面上鳕鱼的名目繁多，真鳕、银鳕、黑鳕、狭鳕、青鳕、水鳕，龙鳕、圆鳕、扁鳕等等，这些鳕鱼名只能算是一种商品名，生物学分类中只有鳕形目，鳕科，鳕属的鱼类才是真正的鳕鱼，而鳕属只包括大西洋鳕鱼(gadusmorhua)，格陵兰鳕鱼(gadusogac)和太平洋鳕鱼(gadusmacrocephalus)这3种，但格陵兰鳕鱼产量较低市场上少见。
异鳞蛇鲭，俗称“油鱼”或“龙鳕鱼”或“水鳕鱼”，属于辐鳍鱼纲(actinopterygii)鲈形目(perciformes)异鳞蛇鲭属(lepidocybium)，由于价格低廉且一旦去头、去脏、去骨、去皮切块或切片之后其肉质外观酷似鳕鱼而常被假冒成鳕鱼进行销售。但异鳞蛇鲭由于鱼体内含有一种名叫蛇鲭毒素的天然蜡酯，蜡酯在人体内难以消化，食用后容易导致胃痉挛，油脂囤积在直肠，导致排油性腹泻，严重时导致死亡。动物物种成分检测是打击异鳞蛇鲭假冒鳕鱼的有效手段，但目前并没有一种针对异鳞蛇鲭成分的高效准确的检测方法。
形态学方法是传统的动物物种种属鉴定方法，但市售的鳕鱼往往都以肉段肉块的形式出现，因此往往不能满足对鱼肉制品售假现象的监管与控制的需求。种属鉴定的免疫学方法大都直接鉴定样本中的蛋白成分，其基本原理是抗体抗原反应，但免疫学方法存在对样本材料要求高，检测准确率低等缺陷，如动物食品若经过加热、腌制等处理，其蛋白结构一旦遭到破坏，免疫学方法便不再适用。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：提供一种异鳞蛇鲭的荧光pcr检测方法及其引物和探针，可有效地以实时pcr方法对异鳞蛇鲭进行物种成分检测，结果精确，灵敏度高。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种异鳞蛇鲭的引物和探针，其中，所述引物和探针由下表中的序列组成：
其中，lf-f表示上游引物；lf-r表示下游引物；lf-p表示探针。
为解决上述问题，本发明还提供一种异鳞蛇鲭的荧光pcr检测方法，其中，至少包括如下步骤：
s1：设计异鳞蛇鲭的引物和探针，所述引物和探针由下表中的序列组成：
其中，lf-f表示上游引物；lf-r表示下游引物；lf-p表示探针；
s2：提取异鳞蛇鲭样品中的dna；
s3：根据所述引物和探针及dna，进行实时荧光pcr扩增反应，获得检测结果；
s4：将检测结果与预设的ct值比较，判定样品特性。
其中，所述上游引物的浓度为10pmol/μl，下游引物的浓度为10pmol/μl，探针的浓度为10pmol/μl。
其中，步骤s2具体为：
s21：获取0.2g异鳞蛇鲭样品，并在液氮中研磨；
s22：使用dna抽提试剂盒进行dna抽提；
s23：将抽提后的dna溶解在100μl水中，获得dna液。
其中，步骤s3具体为：
s31：获取10μl的premixextaq，0.4μl的上游引物，0.4μl的下游引物，0.4μl的探针以及1μl的dna液，并加水补足至20μl；
s32：使用实时荧光pcr仪进行实时荧光pcr扩增反应，其中实时荧光pcr扩增反应的程序如下：
95℃预变性10sec；95℃变性5sec；60℃退火并延伸23sec，执行40个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号，以获得检测结果。
其中，在步骤s3后，还包括步骤s30：设置阳性对照、阴性对照及提取空白对照。
其中，在步骤s4之前，还包括步骤s40：获取真核生物的引物和探针，并作为内参照引物和探针；其中真核生物的引物和探针见下表：
*引用自gb/t25165-2010。该引物探针可作为内参照引物探针，检验所抽提dna的质量；其中18srrna-f表示上游引物，18srrna-r表示下游引物，18srrna-p表示探针。
其中，步骤s4具体为：
s41：若检测结果显示空白对照、阴性对照无fam荧光信号，阳性对照ct值小于等于30，则判定实时荧光pcr扩增反应有效，否则反应无效；
s42：在实时荧光pcr扩增反应有效的前提下，用内参照引物探针筛选出ct值≤30的样品；
s43：在ct值≤30的样品中的特异性曲线出现扩增曲线时，则表示dna抽提有效，否则应重新提取dna，直至ct值≤30；
s44：在实时荧光pcr扩增反应有效，且抽提的dna有效的情况下，异鳞蛇鲭的特异性引物探针检测得到的ct值≤35时，则判断样品为阳性，若ct值＞35，则判断样品为阴性。
区别于现有技术，本发明通过设计适用于异鳞蛇鲭的引物和探针，并用于实时pcr检测，可有效地以实时pcr方法对异鳞蛇鲭进行物种成分检测，结果精确，灵敏度高。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。
首先应当说明的是，本发明涉及异鳞蛇鲭(lepidocybiumflavobrunneum)的实时荧光pcr(real-timepcr)检测方法。基于具有高度物种特异性的异鳞蛇鲭线粒体12s核糖体rna(12sribosomalrna)序列(genbank:ap012519.1)设计了具有物种特异性的引物和探针，实现以real-timepcr的方法对异鳞蛇鲭进行物种成分检测。本方法由于其引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，可协助有关部门有效打击鱼类，特别是鳕鱼及其制品贩假的恶劣行径。
本发明属于分子生物学方法，基于核酸等遗传物质的高稳定性和多样性等特点，可广泛应用于物种种属鉴定，特别是以pcr技术为基础的核酸检测方法被应用到物种鉴别已有20年的历史。实时荧光pcr是在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过扩增曲线对结果进行分析。
利用实时荧光pcr技术本发明中的引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，可有效的用于鱼肉的真伪鉴别。
具体对：为了实现上述目的，本发明提供一种异鳞蛇鲭的荧光pcr检测方法，其中，至少包括如下步骤：
s1：设计异鳞蛇鲭的引物和探针，所述引物和探针由表1中的序列组成：
表1
其中，lf-f表示上游引物；lf-r表示下游引物；lf-p表示探针；
s2：提取异鳞蛇鲭样品中的dna；
s3：根据所述引物和探针及dna，进行实时荧光pcr扩增反应，获得检测结果；
s4：将检测结果与预设的ct值比较，判定样品特性。
具体地，步骤s2中样本dna提取。取0.2g异鳞蛇鲭肌肉组织，在液氮中充分研磨后，使用dna抽提试剂盒(promegaff3750)进行dna抽提，抽提后的dna溶解在100μl水中；
步骤s3中实时荧光pcr扩增检测。引物探针序列如表1所示。实时荧光pcr反应体系如下：10μl的premixextaq(takara)，上游引物(10pmol/μl浓度)0.4μl，下游引物(10pmol/μl)0.4μl，探针(10pmol/μl)0.4μl，取上述提取的dna液1μl，用水补足体积至20μl。应用荧光定量pcr仪lightcycle480(roche)进行反应，反应程序为：
95℃预变性10sec；95℃变性5sec；60℃退火并延伸23sec，执行40个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号，以获得检测结果。
步骤s4中结果判定。ct(cyclethreshold，循环阈值；即每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数)值小于等于35时，结果为阳性，ct值大于35时为阴性。
实际操作时，如步骤s1的引物和探针的设计可采用下述方式获得：
基于具有高度物种特异性的异鳞蛇鲭12s核糖体rna(12sribosomalrna)序列(genbank：ap012519.1)，用生物信息学方法根据引物设计原则，并利用primerexpress设计软件，设计出扩增上述基因片段的特异性引物和荧光探针若干组。将设计得到的引物和探针一一进行blast验证，以保证引物的高特异性。经过上述验证，最后选择了如表1所示的引物和探针，并在探针上标记了荧光信号，以实现实时荧光检测。
步骤s2的样本dna提取可采用下述方式获得：
取0.2g鱼肉，在液氮中充分研磨后，使用dna抽提试剂盒(promegaff3750)，按照说明书进行dna抽提，抽提后的dna溶解在100μl水中。提取过程设置以水替代样品的提取空白对照。
步骤s3的实时荧光pcr对样本的检测可采用下述方式获得：
实时荧光pcr扩增反应。引物探针序列如表1所示，实时荧光pcr反应体系如下：10μlpremixextaq(takara)，上游引物(10pmol/μl)0.4μl，下游引物(10pmol/μl)0.4μl，探针(10pmol/μl)0.4μl，取上述提取的dna液1μl，用水补足体积至20μl。应用实时荧光pcr仪lightcycle480(roche)进行反应，
其中检测过程除了样品外，设置阳性对照(阳性对照得到的dna浓度≥20ng/μl，以满足ct值≤30)、阴性对照、提取空白对照。分别用异鳞蛇鲭的检测引物探针和内参照引物和探针进行检测。
而内参照引物和探针是真核生物的引物和探针；其中真核生物的引物和探针由表2中的序列组成：
表2
其中，*引用自gb/t25165-2010。该引物探针可作为内参照引物探针，检验所抽提dna的质量；其中18srrna-f表示上游引物，18srrna-r表示下游引物，18srrna-p表示探针。
步骤s4中，检测结果若显示空白对照、阴性对照无fam荧光信号，阳性对照ct值小于等于30，可以判定荧光pcr反应有效，否则反应无效。在荧光pcr反应有效的前提下，用内参照引物探针进行检测的样品的ct值小于等于30(保证抽提得到的dna有一定的浓度和纯度)，并出现明显的扩增曲线时，表示dna抽提有效，否则应重新提取dna，直至ct值小于等于30。在荧光pcr反应有效，且抽提的dna也有效的情况下，异鳞蛇鲭的特异性引物探针检测得到的ct值小于等于35时，则判断样品阳性，若ct值大于35则判断样品阴性。
其中，为了验证检测结果的精确性，本发明还可进行实时荧光pcr特异性验证，具体如下：
分别对异鳞蛇鲭、太平洋鳕、大西洋鳕、裸盖鱼、小鳞犬牙南极鱼、黄线狭鳕等19种鱼类，包括真正生物学意义上的鳕鱼(太平洋鳕和大西洋鳕)和常被用于当做“鳕鱼”的鱼类(包括裸盖鱼、小鳞犬牙南极鱼、黄线狭鳕、细鳞壮鳕、亚洲箭齿鲽、马舌鲽、龙首长尾鳕等)和其他较常见鱼类，以及其他常见的家畜家禽5个物种，共22个物种(表3)进行引物探针的特异性验证，反应体系和反应程序如上述步骤中的s3和s4所述。如表3所示，用异鳞蛇鲭的特异性引物探针检测时，只有异鳞蛇鲭的样本得到阳性结果，其他物种均显示为阴性结果。而用真核生物通用引物探针检测时，除水样本外，其他都得到阳性结果(ct值≤30)。上述结果表明，所有物种抽提得到的dna品质良好，且荧光pcr反应有效，在此基础上可以判断本发明设计的异鳞蛇鲭的引物探针具有很好的物种特异性。
表3实时荧光pcr特异性验证结果
所有实验取重复3次的平均值；undet.表示ct值低于检测限.
与此同时，本发明还提供一种实时荧光pcr灵敏度验证方法，具体如下
对抽提到的异鳞蛇鲭的dna(浓度为87ng/μl)进行5倍梯度稀释，检测引物探针的灵敏度。反应体系和反应程序如上所述。结果显示(表4)，dna浓度在1ng/μl左右时(表4中样品4)，可得到标准扩增曲线和较强阳性的ct值，此时的检测结果比较可靠；当dna浓度再稀释5倍时(表4中样品5)，ct值大于35，易与假阳性的翘尾现象混淆，不易判断。因此，对检测样品的浓度要求大于或等于1ng/μl时，检测结果较为可靠。
表4实时荧光pcr对异鳞蛇鲭检测的灵敏度验证
其中，*用nanodrop1000(thermo)实际测得浓度/5倍梯度稀释推算得到的浓度；浓度数值保留一位小数；
—表示低于检测范围；
所有实验取重复3次的平均值。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。