本发明属于生物材料领域，尤其涉及一种用于富集纯化c-kit+心脏干细胞的复合涂层及其制备方法。
背景技术：
缺血性心肌病造成的心肌受损是目前心脏疾病中死亡率最高的疾病之一，而细胞再生疗法被认为是最有潜力的治疗方法之一。诱导心肌干细胞的增殖分化，或者刺激其分泌生长因子被认为具有保护和修复受损心肌组织。研究表明，心脏中c-kit+干细胞具有保护和修复受损心肌的潜能。目前，c-kit+心脏干细胞的分离和纯化方法主要是免疫磁珠筛选法，这种方法是利用细胞表面抗原c-kit与对应的筛选磁珠相结合而对细胞进行筛选。由于筛选出来的细胞为分散状态且携带有分选的磁珠，其在心肌受损治疗中存在缺陷：用量大、黏附能力弱、活性低，大幅度降低了干细胞再生疗法的治疗效果。
因此，有必要简化c-kit+心脏干细胞的分离方法，且使富集纯化的c-kit+心脏干细胞能良好地治疗心肌受损。
技术实现要素：
本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种用于富集纯化c-kit+心脏干细胞的复合涂层及其制备方法，该复合涂层制备方法简单，复合涂层能简化c-kit+心脏干细胞的分离方法，且富集纯化的c-kit+心脏干细胞能良好地治疗受损心肌。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于富集纯化c-kit+心脏干细胞的复合涂层，其包含有亲水聚合物a、亲水聚合物b和水，所述亲水聚合物a为藻酸盐或聚氧丙烯和聚氧乙烯构成的聚醚，所述亲水聚合物b为明胶、纤连蛋白或多聚赖氨酸。
本发明所述新型涂层复合物，通过改变复合涂层中所用到的组成物(含高亲水基团的亲水聚合物a和含中等亲水基团的亲水聚合物b)的比例，在不需要借助任何抗体情况下，能简单高效地将c-kit+心脏干细胞聚分离出来，且为c-kit+心脏干细胞集体，是目前的分离纯化方法所不具备的：现有的方法仅仅是分离出单个分散的c-kit+心脏干细胞，这些c-kit+心脏干细胞的黏附能力弱、活性低。
作为上述技术方案的改进，所述聚醚至少为泊洛沙姆f68和泊洛沙姆f127中的一种。
作为上述技术方案的进一步改进，所述亲水聚合物a为泊洛沙姆f68，所述亲水聚合物b为明胶。
另外，本发明还提供所述的复合涂层的制备方法，其包括以下步骤：
s1)溶解：将亲水聚合物a溶解于水中，搅拌均匀后获得亲水聚合物a溶解液；将亲水聚合物b溶解于水中，搅拌均匀后获得亲水聚合物b溶解液；
s2)混合：将亲水聚合物a溶解液与亲水聚合物b溶解液混合、搅拌，即得复合涂层溶解液；
s3)灭菌和孵育：对所述复合涂层溶解液进行过滤，过滤后的复合涂层溶解液加入到细胞培养容器的表面，并置于培养箱中进行孵育；
s4)干燥：将孵育后的复合涂层溶解液置于无菌环境中，吸弃培养容器中剩余的水溶液，并进行干燥，即可用于富集纯化c-kit+心脏干细胞。
作为上述技术方案的改进，在所述亲水聚合物a溶解于水过程中，亲水聚合物a与水的质量比为0.1％～10％。
作为上述技术方案的改进，在所述亲水聚合物b溶解于水过程中，亲水聚合物b与水的质量比为0.1％～10％。
作为上述技术方案的改进，在步骤s2)混合中，所述亲水聚合物a溶解液和所述亲水聚合物b溶解液的质量比为0.1％～99.9％。
作为上述技术方案的改进，所述步骤s1)溶解的温度为60℃；所述步骤s3)孵育的温度为37℃，时间为18h；所述步骤s4)干燥的时间至少为2h。
本发明的有益效果在于：本发明提供一种用于富集纯化c-kit+心脏干细胞的复合涂层及其制备方法，本发明所述新型涂层复合物，通过改变复合涂层中所用到的组成物(含高亲水基团的亲水聚合物a和含中等亲水基团的亲水聚合物b)的比例，在不需要借助任何抗体情况下，能简单高效地将c-kit+心脏干细胞分离出来，富集纯化的c-kit+心脏干细胞聚集体能良好地治疗受损心肌；另外，本发明复合涂层制作过程简单，所需时间短，造价便宜，易于控制和实施，且产品收率高。
附图说明
图1a显示心脏细胞悬浮液在刚加入包被有复合涂层的培养板表面时细胞状态；图1b显示心脏细胞在包被有复合涂层的培养板表面上培养24h后细胞状态；
图2a显示利用复合涂层培养分离后形成的细胞聚集体(agg)中c-kit的表达情况；图2b显示利用复合涂层培养分离后形成的分散黏附在复合涂层表面的细胞(att)中c-kit的表达情况；图2c统计所有细胞聚集体和所有单个分散细胞中表达c-kit的干细胞比率；
图3是显示免疫荧光染色对分离形成的细胞聚集体和单个分散细胞群中的细胞进行染色；其中，从上到下，依次为明视野图，标记c-kit的图，标记tni(肌细胞的标记蛋白)的图，标记c-kit和tni融合的图；另外，右侧图中白色圆圈标出的是细胞聚集体而不是单个分散细胞；
图4a显示传代一次培养(p1)的心脏细胞在复合涂层上的状态；图4b显示传代二次培养(p2)的心脏细胞在复合涂层上的状态；图4c显示传代五次培养(p5)的心脏细胞在复合涂层上的状态；图4d显示心脏细胞传代一次、二次和五次培养后，经复合涂层富集纯化所得细胞聚集体中c-kit+心脏干细胞的比率(％)；
图5显示心脏细胞缺血处理后，在不同处理下的细胞ldh蛋白释出量；其中，空白对照组(con)：心脏细胞在无任何处理的对照培养120h；阴性对照组(is)：心脏细胞在缺血损伤后无任何后处理培养120h；试验组(agg)：心脏细胞在缺血损伤后立刻加入富集纯化的c-kit+心脏干细胞聚集体，共同培养120h；注：图中星号表示与空白对照组存在显著性差异：p＜0.05；
图6显示心脏细胞在缺血损伤后，加入的c-kit+心脏干细胞聚集体与心脏细胞的状态；
图7显示心脏细胞缺血处理后，在不同处理下的细胞ldh蛋白释出量；其中，空白对照组(con)：心脏细胞在无任何处理的对照培养120h；阴性对照组1(is)：心脏细胞在缺血损伤后无任何后处理培养120h；阴性对照组2(non-treat)：心脏细胞在缺血损伤后加入无任何细胞因子的培养液培养120h；试验组(aggcm)：心脏细胞在缺血损伤后立刻加入c-kit+心脏干细胞聚集体分泌的合成培养液，共同培养120h；注：图中星号表示与空白对照组存在显著性差异：p＜0.05。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例提供一种用于富集纯化c-kit+心脏干细胞的复合涂层的制备方法，其包括以下步骤：
s1)溶解：将泊洛沙姆f68溶解于水中，搅拌均匀后获得亲水聚合物a溶解液；将明胶溶解于水中，搅拌均匀后获得亲水聚合物b溶解液；溶解时的温度为60℃；泊洛沙姆f68溶解于水过程中，泊洛沙姆f68与水的质量比为0.1％；明胶溶解于水过程中，明胶与水的质量比为6％；
s2)混合：将亲水聚合物a溶解液与亲水聚合物b溶解液混合、搅拌，即得复合涂层溶解液；所述亲水聚合物a溶解液和所述亲水聚合物b溶解液的质量比为0.1％；
s3)灭菌和孵育：采用孔径为7μm过滤器对复合涂层溶解液进行过滤，过滤后的复合涂层溶解液加入到细胞培养容器的表面，并置于培养箱中进行孵育；孵育时的温度为37℃，时间为18h；
s4)干燥：将孵育后的复合涂层溶解液连同细胞培养容器置于超净工作台中，吸弃细胞培养容器中剩余的水溶液，并进行干燥，即可用于富集纯化c-kit+心脏干细胞；干燥时的时间至少为2h。
另外，本实施例还提供一种采用所述制备方法制备的复合涂层。
实施例2
本实施例提供一种用于富集纯化c-kit+心脏干细胞的复合涂层的制备方法，与实施例1类似，区别在于：
s1)溶解：亲水聚合物a为洛沙姆f127，泊洛沙姆f127溶解于水过程中，泊洛沙姆f127与水的质量比为5％；亲水聚合物b为纤连蛋白，纤连蛋白溶解于水过程中，纤连蛋白与水的质量比为0.1％；
s2)混合：所述亲水聚合物a溶解液和所述亲水聚合物b溶解液的质量比为20％；
另外，本实施例还提供一种采用所述制备方法制备的复合涂层。
实施例3
本实施例提供一种用于富集纯化c-kit+心脏干细胞的复合涂层的制备方法，与实施例1类似，区别在于：
s1)溶解：亲水聚合物a为藻酸盐，藻酸盐溶解于水过程中，藻酸盐与水的质量比为7％；亲水聚合物b为多聚赖氨酸，多聚赖氨酸溶解于水过程中，多聚赖氨酸与水的质量比为10％；
s2)混合：所述亲水聚合物a溶解液和所述亲水聚合物b溶解液的质量比为60％；
另外，本实施例还提供一种采用所述制备方法制备的复合涂层。
实施例4
本实施例提供一种用于富集纯化c-kit+心脏干细胞的复合涂层的制备方法，与实施例1类似，区别在于：
s1)溶解：亲水聚合物a为泊洛沙姆f68和泊洛沙姆f127的混合物，泊洛沙姆f68和泊洛沙姆f127溶解于水过程中，泊洛沙姆f68、泊洛沙姆f127的混合物与水的质量比为10％；亲水聚合物b为多聚赖氨酸和明胶的混合物，多聚赖氨酸和明胶溶解于水过程中，多聚赖氨酸、明胶的混合物与水的质量比为5％；
s2)混合：所述亲水聚合物a溶解液和所述亲水聚合物b溶解液的质量比为99.9％；
另外，本实施例还提供一种采用所述制备方法制备的复合涂层。
实施例5
本实施例采用实施例1～4所述的复合涂层对心脏细胞进行分离，富集纯化c-kit+心脏干细胞，其包括以下步骤：
1)利用酶解消化法将心脏细胞从1天龄的小鼠心脏中分离出，利用离心机以1200rpm的转速分离细胞，并用心脏细胞培养液(imdm，20％胎牛血清，1％青霉素-链霉素，1％l-谷氨酸)重悬；
2)将混合的心脏细胞以5000个/孔的密度植于复合涂层包被的96孔板中，在5％co2、37℃培养箱中培养24h，利用光学显微镜观察细胞的状态(如图1所示)；
3)利用0.1mm的针头在显微镜下将c-kit+心脏干细胞聚集体从复合涂层表面分离，并利用酶解法分散为单个细胞；其他单个分散在复合涂层表面的单个分散细胞利用酶解法从涂层表面分离下来；两组细胞分别利用流式细胞仪，以c-kit为识别抗原对细胞计数，统计两组细胞中c-kit+心脏干细胞的数量(如图2所示)；
4)利用免疫荧光标记法，以c-kit和troponini(肌肉细胞表面抗原，tni)为识别标记，鉴别细胞聚集体和单个分散细胞(如图3所示)；
5)将心脏细胞从1天龄的小鼠心脏中分离出，传代培养5次；分别将不同传代数的心脏细胞植于包被有复合涂层的96孔板上，重复步骤2)～4)，之后统计c-kit+心脏干细胞的含量(如图4所示)。
如图1所示，心脏细胞经复合涂层孵育后，聚集成c-kit+心脏干细胞集体，c-kit+心脏干细胞集体周围还存在一些分散的黏附细胞。如图2所示，经复合涂层分离形成的c-kit+心脏干细胞聚集体中，约有87.01％细胞表达c-kit；经复合涂层分离形成的单个分散细胞中，约有25.04％细胞表达c-kit；可见c-kit+心脏干细胞聚集体中大部分细胞表达c-kit。如图3所示，细胞聚集体大量阳性表达c-kit，而单个分散细胞少有表达c-kit。如图4所示，随着心脏细胞传代培养次数的增加，经复合涂层富集纯化所得细胞聚集体中的c-kit+心脏干细胞比率逐渐减少，且表现型发生变化。
因此，本发明复合层可以有效地分离c-kit+心脏干细胞聚集体和单个分散细胞，c-kit+心脏干细胞聚集体中含有c-kit+心脏干细胞；通过调整复合涂层中组分的比例和心脏细胞传代培养的次数，可以选择细胞聚集体中c-kit+心脏干细胞的比率和表现型。
实施例6
本实施例提供一种c-kit+心脏干细胞聚集体的合成培养液的制备方法，所述c-kit+心脏干细胞聚集体来自于实施例5中c-kit+心脏干细胞聚集体，合成培养液的制备方法包括以下步骤：
1)将已分离的c-kit+心脏干细胞聚集体置于无任何处理的培养板中，加入无血清的心脏细胞培养液(imdm，1％青霉素-链霉素)，24h后收集培养液；
2)利用孔径为7μm的过滤器充分过滤培养液后，即制备出合成培养液，并置于-80℃保存备用。
实施例7
c-kit+心脏干细胞聚集体保护和修复缺血损伤的心脏细胞
1)原代培养1～2日龄sd乳鼠，在无菌条件下取出心脏用pbs清洗、剪碎，之后移入含有0.1％胰酶、0.1％胶原蛋白酶、0.1％中性蛋白酶(dispase)的混合酶液中消化40min；
2)用孔径为40μm的过滤器去除未消化的组织，1300rpm离心3min，移除上清液，用心脏细胞培养液(imdm，20％胎牛血清，1％青霉素-链霉素，1％l-谷氨酸)重悬，以5000细胞/孔的密度移入96孔板中培养24h；
3)移除细胞培养液后加入pbs冲洗2次，缺血液处理25min，之后加入上述方法制备的c-kit+细胞聚集体，以20颗/孔的密度移植，并加入心脏细胞培养液；
4)自加入后每24h移出100μl培养液与ldh检测试剂混合，在480nm测定吸收值；
5)此次试验，设立试验组(agg)、空白对照组(con)和阴性对照组(is)。
如图5所示，随着治疗时间的延长，试验组中加入的c-kit+心脏干细胞聚集体可以减少ldh蛋白(乳酸脱氢酶)的释放量，保护和修复损伤的心脏细胞；当治疗时间为96h时，试验组与空白对照组的差异不显著。
实施例8
对实施例7的试验组中c-kit+心脏干细胞聚集体和心脏细胞进行观察，结果如图6所示，c-kit+心脏干细胞聚集体逐渐融合于受损的心脏细胞上。
综合实施例7和实施例8，可见本发明富集纯化的c-kit+心脏干细胞聚集体能保护和修复缺血损伤的心脏细胞。
实施例9
c-kit+心脏干细胞聚集体分泌的合成培养液保护和修复缺血损伤的心脏细胞
1)原代培养1～2日龄sd乳鼠，在无菌条件下取出心脏用pbs清洗，剪碎，移入含有0.1％胰酶、0.1％胶原蛋白酶、0.1％中性蛋白酶(dispase)的混合酶液中消化40min；
2)用孔径为40μm的过滤器去除未消化的组织，1300rpm离心3min，移除上清液，用心脏细胞培养液(imdm，20％胎牛血清，1％青霉素-链霉素，1％l-谷氨酸)重悬，以5000细胞/孔的密度移入96孔板中培养24h；
3)移除培养液后加入pbs冲洗2次，缺血液处理25min后，加入上述方法制备的合成培养液，以100μl/孔的密度移植，加入心脏细胞培养液；
4)自加入后每24h移出100μl培养液与ldh检测试剂混合，在480nm的吸收光下获取吸收值；
5)此次试验，设立试验组(aggcm)、空白对照组(con)、阴性对照组1(is)和阴性对照组2(non-treat)。
如图7所示，随着治疗时间的延长，试验组中加入的c-kit+心脏干细胞聚集体分泌的合成培养液可以减少ldh蛋白(乳酸脱氢酶)的释放量，保护和修复心脏细胞缺血后的损伤；当治疗时间为96h时，试验组与空白对照组的差异不显著。
最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。