本发明涉及一种宫血干细胞快速扩增的方法，属于生物工程和生物医药领域。具体而言，本发明特别涉及宫血干细胞体外培养环境中的氧分压的变化，模拟体内正常生理状态下的低氧环境，使宫血干细胞在低氧及常氧环境下切换，快速适应营养环境，加速分裂，实现细胞大规模扩增的方法。
背景技术：
术语“干细胞”是一种在胚胎、胎儿和成人的组织中发现的未分化类型的体细胞的总称，其具有分化成多种特定细胞或细胞类型的潜能。干细胞具有如下的特点：能够保持未分化状态的同时通过多个细胞分裂周期的自我更新，且具有响应于特定刺激而分化成特定细胞类型的潜能，以及跨过谱系屏障并采取相对于其他组织独特的表达谱和细胞功能表型的可塑性。
胚胎干细胞是干细胞中的重要一种。诸多文献报道了利用胚胎干细胞进行细胞治疗。但是胚胎干细胞保持着肿瘤发生和免疫排斥反应的可能，且目前很难以克服该问题。
近年来，鉴于间充质干细胞(mscs)对不同器官的多种急慢性组织损伤拥有众多治疗潜能，在再生医学领域引起了巨大的关注。mscs具有向受损部位趋化的特性，并且具有多向分化能力、旁分泌功能以及免疫和炎症调节功能，免疫原性低，易于分离培养，易于导入并表达外源基因，且不涉及伦理道德问题，mscs如今已经广泛地应用于临床试验中。
另外，对于用作再生医学和/或细胞疗法中的细胞治疗剂的间充质干细胞，所需的间充质干细胞的最小数目为约1×109个细胞。在实践中，考虑到用于设置合适条件和测定标准的实验，最小数目还进一步增加。由多种来源供应这样数量的间充质干细胞需要至少十个体外传代。但是，在这种情况下，细胞变得衰老和变形，使得其不适合用作细胞治疗剂。因此，需要有效地大量产生间充质干细胞的培养方法。
宫血干细胞(menstrualblood-derivedstemcell，mensc)，是从含脱落的子宫内膜的经血中分离得到的一种能够多向分化，具有易于获取，增殖稳定等特点，且逐渐成为基于干细胞药物治疗的种子细胞；它的分化潜能与胚胎干细胞相近，又具备免疫原性低，异体移植无免疫排斥反应或反应较弱的特性，可用于治疗多种疾病，是一种可靠的干细胞药物的种子来源。随着国家干细胞药物研发趋势的明朗化，如何快速、稳定、大量地获得安全可靠的干细胞变得迫不及待。
201510657971.8公开了一种从经血中制备宫血干细胞的方法，利用独特构型的器具，收集女性经血，提取单个核细胞，从而制备宫血干细胞。
现有的宫血干细胞的方法通常是在常氧环境中完成的，细胞生长缓慢，往往不能在短时间内获得满足临床需要的细胞数量难以保证可用于大量生产的细胞的数目。有些扩增干细胞方法通过添加一些刺激因子，试图在短时间内获取足够的细胞用于临床研究，但这样增加了潜在的风险。同时，现有方法存在每次传代后具有增殖能力的宫血干细胞的数目降低的缺点。因此，需要与常规方法相比以更高简化和更高经济效益的方式使间充质干细胞的数目增加到足够临床或者治疗应用的程度的新方法。
技术实现要素：
本发明将宫血干细胞早期的体外扩增氧分压调节为低氧(10％以下)，模拟人体正常生理状态，从而使细胞更快地适应营养环境，较早进入分裂期，加速分裂；之后，再将培养条件调节为常氧环境，以维持干细胞的特性。本发明可以有效缩短宫血干细胞在体外扩增培养的时间，且细胞维持干细胞特有的表型，自我更新及分化能力，进而为干细胞药物研究提供安全可靠的细胞来源。
简而言之，本发明利用间歇性的低氧条件，促进宫血干细胞更快的适应新的营养环境，加速分裂，实现细胞体外大规模扩增；避免了细胞长时间体外培养，或者添加其他刺激因子带来的潜在风险。
因此，本发明的一方面是提供用于快速扩增培养间充质干细胞的方法。
本发明的另一方面是提供通过所述方法制备的间充质干细胞，所述间充质干细胞表现出显著增强的增殖能力。
本发明的还一个方面是提供包含所述间充质干细胞的细胞制剂(例如治疗剂)。
根据上述本发明的一个方面，提供了用于培养间充质干细胞的方法，所述方法包括在2％～5％氧气浓度的低氧条件下于培养基中培养间充质干细胞，然后在常氧条件下于培养基中培养间充质干细胞。
根据上述本发明的另一个方面，提供了通过所述方法制备的间充质干细胞，其具有改善的增殖能力，同时保留干细胞的特性。
根据上述本发明的还一个方面，提供了包含本发明的间充质干细胞的细胞制剂，例如细胞治疗剂。
本发明的培养方法通过间歇性培养可在很少的传代数内增加间充质干细胞的群。另外，通过本发明培养方法制备的间充质干细胞不仅由于其缺乏免疫原性可有效用作安全的细胞治疗剂，例如用于骨再生药物或者成脂药物。
传统培养环境下，大多数细胞在48小时后开始分裂。本发明首次利用间歇性低氧环境，使宫血干细胞在24小时内适应新的营养环境，提高了代谢水平，细胞更短时间内进入分裂期。持续的低氧环境下，往往可以加速分裂，但是由于端粒极速缩短，细胞虽然仍表达干细胞特有标记，但是其分化潜能及传代次数却逐渐减弱；本发明利用低氧环境加速细胞分裂的同时，在细胞进入分裂期后转回传统培养条件中，维持细胞特有的表型及分化能力，同时缩短细胞体外扩增的时间，获得大量地细胞，满足临床应用的需求。
附图说明
图1：常氧或间歇性低氧环境下宫血干细胞的葡萄糖消耗率。培养的前7天，间歇性低氧环境下葡萄糖的消耗率明显更低。
图2：常氧或间歇性低氧环境下宫血干细胞的代谢产物乳酸的产生率。培养的前7天，间歇性低氧环境下所培养的宫血干细胞的代谢产物乳酸的产生率更低。
图3：常氧或间歇性低氧环境下宫血干细胞的生长曲线。
图4：常氧或间歇性低氧环境下宫血干细胞表面标记的表征。
图5：常氧或间歇性低氧环境下宫血干细胞的细胞分裂动力学。间歇性低氧环境下，细胞更早开始分裂，这与该环境下细胞在前期葡萄糖消耗率高相对应，而后期7天后，两种培养环境下的细胞基本持平。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
根据一个优选实施方案，本发明提供一种用于培养间充质干细胞的方法，所述方法包括在2％至5％(优选为3％)的低氧条件下培养间充质干细胞，同时还包括在常氧条件下培养间充质干细胞。
在本发明的培养间充质干细胞的方法中，低氧培养和常氧培养相互间隔和循环，例如循环1-20次，优选，3-15次，更优选6-10次。
进一步地，在本发明的培养间充质干细胞的方法中，在一个低氧培养/常氧培养循环中，低氧培养10-40小时，优选12-30小时，最优选24小时。再进一步地，在本发明的培养间充质干细胞的方法中，在一个低氧培养/常氧培养循环中，常氧培养的时间大于低氧培养，例如大于24小时。
优选地，在本发明的培养间充质干细胞的方法中，首先进行低氧培养，然后进行常氧培养，以此类推。
进一步优选地，在本发明的培养间充质干细胞的方法中，在每次换培养基(例如培养液)和/或在传代的时候切换至低氧环境，10-40小时后(优选12-30小时后，更优选24小时后)，回归常氧培养，以此类推。
本发明的培养方法可适用于多种来源的间充质干细胞。可用于本发明的间充质干细胞的实例包括来源于脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、皮肤、羊水、脐带或牙齿的那些，但不限于此。在本发明的一个优选实施方案中，本发明的培养方法用于经血来源的间充质干细胞。
另外，可应用本发明培养方法的间充质干细胞可来源于多种对象。例如，可用于本发明的间充质干细胞可获自哺乳动物(包括人)，但不限于此。在本发明的一个优选实施方案中，使用人来源的间充质干细胞。
本发明培养方法可以使用典型培养基进行培养间充质干细胞。典型培养基的实例包括dulbecco改良eagle培养基(dmem)、最小必需培养基(mem)、α-mem、mccoys5a培养基、eagle基本培养基、cmrl(connaughtmedicalresearchlaboratory)培养基、glasgow最小必需培养基、hamf-12培养基、imdm(lscove改良dulbecco培养基)、leibovitzl-15培养基、rpmi(roswellparkmemorialinstitute)1640培养基、培养基199和hank培养基199，但不限于此。优选地，本发明培养方法中所使用的培养基是加了4mmol/l谷氨酰胺、5mg/ml的人血清替代物(购自武汉维诺赛生物科技有限公司，货号r007)、10ng/ml的egf、10ng/ml的pdgf-bb、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的αmem培养基。任选地，培养基可以含有或可不合血清。另外，可在培养基中使用血清替代物而不是血清。例如，培养基含有5％至30％的胎牛血清(fbs)。任选地，培养基含有血清替代物。除了市售产品外，可使用人血清或人血小板裂解物中的多种生长因子(包括pdgf、tgf、igf)和这些蛋白质家族的细胞因子可用作血清替代物。优选地，本发明方法中所使用的培养基中不含有血清。
在本发明的培养方法中，进一步优选地，所述培养基(例如αmem)进一步含有氯化铁和硫酸亚铁，其中所述氯化铁的浓度为1.0至3.0mm的浓度、优选1.5至2.5mm的浓度、并且更优选约2.0mm的浓度，所述硫酸亚铁的浓度为0.3至1.5mm的浓度、优选0.5至1.0mm的浓度、并且更优选约0.8mm的浓度。
此外，本发明培养方法的另一个特征在于间充质干细胞的间歇式低氧/常氧培养条件。在本发明中，低氧条件是氧气含量为2％至5％的气氛。氧气浓度低于2％或高于5％时的问题是间充质干细胞的增殖显著降低。在本发明的一个优选实施方案中，间充质干细胞培养在约3％氧气的气氛中。可通过调节细胞孵育器的氧气浓度来达到低氧条件。例如，可用氮气(100％)或氮气/二氧化碳(95％/5％)净化孵育器以将常氧气氛调节为低氧气氛。可通过安装在孵育器上的氧传感器来监测孵育器中的氧气条件。
当氯化铁和硫酸亚铁与低氧/常氧条件进行组合时，可获得协同效应。即，与单独氯化铁或硫酸亚铁相比，低氧/常氧条件允许间充质干细胞更加有效地增殖。例如，与单独条件相比，在组合条件下，间充质干细胞进一步增殖1.2至1.5倍。
本发明的培养方法可应用于间充质干细胞的传代。换言之，使用本发明培养方法培养的间充质干细胞可以以相同的方式传代培养。通过使间充质干细胞更有效地增殖，本发明的培养方法具有即使进行更少传代也能产生更多数目的间充质干细胞的优点。例如，在接种相同数目的细胞并且每一代的持续时间统一的情况下培养5代后，发现本发明培养方法产生的间充质干细胞数目的是常规方法的1.9-2.2倍。
另外，通过本发明培养方法培养的间充质干细胞不仅无免疫原性因而不引起免疫应答，而且还可有效用作人的细胞治疗剂。
据本发明的另一个方面，预期使用所述培养方法制备的间充质干细胞具有改善的增殖能力、改善的免疫学特性包括无免疫原性等。
根据另一个优选实施方案，本发明提供了包含间充质干细胞的细胞治疗剂。本发明的细胞治疗剂可应用于脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛β细胞、血管细胞或肺细胞的再生或保护。另外，本发明的细胞治疗剂可用于选自以下的情形：治疗肺病；抑制或治疗肺病诱发的炎症；肺组织再生；以及抑制肺纤维化。特别地，其可用于抑制或改善肺病诱发的炎症和纤维化。另外，本发明的细胞治疗剂可用于心血管疾病的治疗或软骨再生。另外，本发明的细胞治疗剂可降低免疫应答、免疫细胞渗透或免疫原性；提高免疫调节功能；以及抑制炎症反应。另外，本发明的细胞治疗剂用于治疗自身免疫病或移植物抗宿主病。
本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。
为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。
实施例1：样本采集
样本采集的志愿者为20-30岁女性，伦理审查通过后，签署知情同意书，在月经周期的中期，使用201510657971.8所描述的方法，收集经血，转入含采集液的储存管中，24小时内送入实验室。
实施例2：样本处理
样本包装经消毒后，在百级操作台上处理；pbs稀释宫血，使用120目细胞筛过滤，取滤液离心；收集沉淀使用pbs重悬，密度梯度离心收集单个核细胞；以201510657971.8描述的方法配置培养基，即加了4mmol/l谷氨酰胺、5mg/ml的人血清替代物(购自武汉维诺赛生物科技有限公司，货号r007)、10ng/ml的egf、10ng/ml的pdgf-bb、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的αmem培养基。
实施例3：细胞体外扩增培养实验：
使用实施例2中的αmem培养基重悬细胞，平均分成两份，置于常氧、间歇性低氧两种不同的环境下培养。
常氧环境培养：即将细胞置于传统的co2培养箱中培养。
间歇性低氧环境培养：即将细胞置于三气培养中，低氧(氧分压为3％)条件下培养24h后，将氧分压调整为常氧(21％)，继续培养，每次换液或传代后的24h内，将培养条件设置为低氧，之后恢复常氧环境，以此类推。
收集两种培养环境下的p3代细胞，取相同细胞量以3000-6000/cm2细胞浓度分别种于细胞工厂中，并置于相应的环境下继续间歇性培养。
分别收集不同时间点的培养上清，进行新陈代谢分析，营养物消耗和代谢物产生部分检测结果如图1和图2所示。
新陈代谢分析结果表明，培养的前7天，间歇性低氧环境下葡萄糖的消耗率明显更低，而代谢产物乳酸的产生率却更低。
实施例4：收集实施例3中常氧或间歇性低氧环境下宫血干细胞的p5代细胞，并计算总倍增数，相对端粒长度检测和克隆形成能力，并绘制宫血干细胞的生长曲线。其中宫血干细胞的生长曲线如图3所示，间歇性培养的环境下干细胞增殖更快。总倍增数、相对端粒长度检测和克隆形成能力检测结果如下。
表1：倍增数、端粒长度和集落形成能力
由此可见，间歇性培养的环境下干细胞增殖快，其总扩增倍数是常氧环境下的1.9倍，且集落形成能力显著增强。
实施例5：干细胞表面标记的表征
取实施例3中常氧或间歇性低氧环境下宫血干细胞的p5代细胞，并鉴定isct公布的部分干细胞表面标记，以表征其分化潜能，结果如图4所示。结果显示，宫血干细胞在间歇性低氧环境下，细胞维持干细胞特定表面标记，且仍具备多向分化潜能。
实施例6：取实施例3中常氧或间歇性低氧环境下宫血干细胞的p5代细胞，使用膜标记技术进行力学研究。染料与细胞膜上脂质区结合，且结合是不可逆的，因此，每一个代次的细胞，含有一半前一代的荧光，通过流式细胞术即可获得对应的荧光强度，结果如图5所示。从该图可以看出，间歇性低氧环境下，细胞更早开始分裂，这或许与该环境下细胞在前期葡萄糖消耗率高相对应。
实施例7：细胞体外扩增培养实验2：
使用实施例2中的αmem培养基(1、含2.0mm氯化铁；2、含0.8mm硫酸亚铁；3、含2.0mm氯化铁和0.8mm硫酸亚铁)重悬实施例2中离心收集的单个核细胞，平均分成两份，置于常氧、间歇性低氧两种不同的环境下培养。
常氧环境培养：即将细胞置于传统的co2培养箱中培养。
间歇性低氧环境培养：即将细胞置于三气培养中，低氧(氧分压为3％)条件下培养24h后，将氧分压调整为常氧(21％)，继续培养，每次换液或传代后的24h内，将培养条件设置为低氧，之后恢复常氧环境，以此类推。
收集两种培养环境下的p3代细胞，取相同细胞量以3000-6000/cm2细胞浓度分别种于细胞工厂中，并置于相应的环境下继续间歇性培养。
分别收集不同时间点的三种不同培养基的培养上清，进行新陈代谢分析，营养物消耗和代谢物产生部分检测结果如图1和图2一致。
新陈代谢分析结果也表明，培养的前7天，间歇性低氧环境下葡萄糖的消耗率明显更低，而代谢产物乳酸的产生率却更低。
收集常氧或间歇性低氧环境下宫血干细胞的p5代细胞，并计算总倍增数，相对端粒长度检测和克隆形成能力。培养基中添加单独的氯化铁和硫酸亚铁的总倍增数，相对端粒长度检测和克隆形成能力与没有添加的培养基之间没有显著差别(数据未示出)。而含氯化铁和硫酸亚铁两者的培养基对总倍增数和集落形成能力方面有显著提升，结果如下表2。
表2：倍增数、端粒长度和集落形成能力
由此可见，间歇性培养的环境下添加了氯化铁和硫酸亚铁的培养基使得干细胞增殖更快，其总扩增倍数是常氧环境下的2.12倍(明显优于没有添加氯化铁和硫酸亚铁的间歇培养)，且集落形成能力显著也更加地增强。
虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。