本发明属于生物领域的遗传方法，涉及一种内生真菌的遗传操作体系，尤其涉及一种高效遗传体系的构建方法及其应用。
背景技术：
：丝状真菌是天然产物的重要来源，齿梗孢霉(calcarisporiumarbuscula)是蘑菇内生丝状真菌，能生产线粒体f0f1-atp合成酶抑制剂aurovertin系列化合物，包括aurovertine，b(1)，d(2)等。研究发现，aurovertinb具有良好的抗乳腺癌活性，有望成为临床治疗乳腺癌的备选药物。aurovertins含有独特的2,6-二氧杂双环辛烷结构，该结构独特的生物合成途径已被解析。前期测序结果发现，齿梗孢霉中含68个天然产物生物合成基因簇，具有巨大的开发价值。然而，齿梗孢霉是一种非模式的内生丝状真菌，之前研究仅建立了基于原生质体转化的基因敲除体系，该方法操作周期长，成本高，步骤繁琐，限制了对其进一步的研究开发。丝状真菌遗传操作体系主要有原生质体转化法、电激转化法、醋酸锂转化法、农杆菌介导转化法、以及crispr-cas9等。前三种方法因需制备原生质体实验周期长、成本高。尽管crispr-cas9已成功运用于少数模式真菌，但农杆菌转化法凭其优越性仍是最主流的丝状真菌遗传操作方法。其基本原理是，农杆菌通过毒力因子将肿瘤诱发(ti)质粒上的转移dna(t-dna)整合到宿主染色体上，造成宿主的突变。它具有以下优点：(1)受体材料广泛；(2)转化效率高；(3)单拷贝转化比例高；(4)非同源的t-dna转化可导致随机突变,同源的t-dna转化时发生定向突变。此前齿梗孢霉未建立基于农杆菌介导的高效遗传体系。技术实现要素：本发明的目的是提供一种内生真菌高效遗传体系的构建方法，是一种新的齿梗孢霉遗传体系，该体系能对齿梗孢霉进行高效遗传改造。本发明所提供的一种内生真菌高效遗传体系的构建方法，所述内生菌为齿梗孢霉(calcarisporiumarbuscula，atcc46034，购自每个atcc)通过以下步骤实现：(1)农杆菌转化方法；(2)齿梗孢霉高表达系统的建立；(3)齿梗孢霉体内荧光表达系统；(4)定向基因敲除系统的建立。其中步骤(1)农杆菌转化方法主要包括如下步骤：(a)重组农杆菌菌液制备；(b)真菌孢子悬浮液制备；(c)农杆菌与真菌孢子共培养；(d)转化子培养；(e)转化子筛选。(a)重组农杆菌菌液制备：将重组质粒电转化入根癌农杆菌eha105，涂布于含50μg/ml卡那霉素lb固体培养基上，单菌落长出后进行pcr鉴定，将正确的重组农杆菌扩大培养并收集菌体，用含400μm乙酰丁香酮(as)的液体诱导培养基(im)重悬菌体至od600约0.1，继续培养至od600达到约0.8；其中重组农杆菌agrobacteriumtumefacienseha105，购自上海唯地生物技术有限公司。(b)真菌孢子悬浮液制备：用含1‰吐温20的无菌水冲洗马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)真菌菌丝，过滤收集分生孢子，用im稀释孢子浓度至107个/ml；(c)农杆菌与真菌孢子共培养：取步骤(a)100μl农杆菌菌液与步骤(b)100μl真菌孢子悬浮液混合均匀，涂布于含400μm铺有玻璃纸的固体im表面，25℃培养48h；(d)转化子培养：将步骤(c)玻璃纸平移至含300μg/ml孢噻肟钠和100μg/ml遗传霉素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)上，25℃倒置培养7天至转化子出现；(e)转化子筛选：将步骤(d)的转化子通过菌落颜色筛选法、pcr验证、蛋白提取验证、代谢产物鉴定确定基因型。所述步骤(a)重组农杆菌菌液应培养至od600约0.8，as浓度应为400μm。所述步骤(b)中真菌孢子悬浮液浓度应为107个/ml。所述步骤(c)中as浓度应为400μm，共培养温度为25℃，共培养时间为48h；步骤(2)齿梗孢霉的高效高表达系统，是通过高表达启动子与目的基因连接，再连上抗性基因标记形成高表达质粒，通过农杆菌转化法将质粒倒入齿梗孢霉体内。在齿梗孢霉体内表达水平高的启动子为：aurap、gpdap、tef1p、tubcp。抗性基因为遗传霉素抗性基因。步骤(3)齿梗孢霉体内荧光表达系统，是通过高表达启动子与荧光蛋白基因连接，再连上抗性基因标记形成荧光表达质粒，通过农杆菌转化法将质粒倒入齿梗孢霉体内。荧光蛋白基因为红色荧光蛋白基因。步骤(4)齿梗孢霉的高效基因定向敲除系统，是通过克隆目的基因上下游1200～1500bp序列作为同源臂，中间插入抗性基因行成定向敲除质粒，通过农杆菌转化法将质粒倒入齿梗孢霉体内。抗性基因为遗传霉素抗性基因。本发明的另一个目的是提供构建的内生真菌齿梗孢霉高效遗传体系在激活隐性基因簇、化合物生物合成机制以及酶功能研究中的应用。本发明所提供的内生真菌齿梗孢霉遗传体系，首次建立了齿梗孢霉体内高表达系统，筛选出四个与齿梗孢霉适配的强启动子；且与现有原生质体转化法相比，其成本低廉、操作简单、实验周期短、转化效率高，为齿梗孢霉的基因工程研究和遗传改造提供材料。附图说明图1为齿梗孢霉对遗传霉素的耐受性试验结果。图2为齿梗孢霉基于农杆菌转化法的建立遗传体系及条件优化；其中，图2a：当农杆菌浓度为0d600＝0.6、乙酰丁香酮浓度为200μg/ml时，不同的真菌孢子浓度对转化效率的影响；图2b：当真菌孢子浓度为107个/ml、乙酰丁香酮浓度为200μg/ml，不同的农杆菌浓度对转化效率的影响；图2c：当农杆菌浓度为0d600＝0.8、真菌孢子浓度为107个/ml，不同的乙酰丁香酮浓度对转化效率的影响。图3为齿梗孢霉体内高表达载体示意图，图中promoter＝aurap、tef1p、tubcp、gpdap。图4为齿梗孢霉高表达菌株代谢产物hplc检测结果。图5为齿梗孢霉高表达菌株蛋白表达检测结果，其中，图5a：高表达菌株体内总蛋白sds-page；图5b：高表达菌株体内总蛋白westernblot检测aurc；其中，泳道1-7代表的菌株与图4中i-vii菌株对应，泳道m：marker。图6为齿梗孢霉野生型菌株和红色荧光蛋白表达菌株在荧光显微镜下的形态，图中标尺代表长度为10μm，dic代表微分干涉相衬，rfp代表红色荧光蛋白，dapi代表4',6-二脒基-2-苯基吲哚。图7为齿梗孢霉体内基因定向敲除载体示意图。图8为基因定向敲除转化子pcr验证结果。图9为齿梗孢霉基因定向敲除菌株代谢产物hplc检测结果。具体实施方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例1：齿梗孢霉遗传体系的建立一、齿梗孢霉对抗生素的敏感性试验将齿梗孢霉野生型孢子均匀涂布于含有不同浓度遗传霉素的pda培养基上25℃培养7天，分别设置遗传霉素浓度为0，25，50，100，150，200μg/ml，测试齿梗孢霉对遗传霉素的耐受性。结果发现(见附图1)：当遗传霉素浓度达到100μg/ml时，齿梗孢霉完全无法生长。因此，本实验选择100μg/ml遗传霉素作为筛选压力。二、齿梗孢霉农杆菌转化法1.质粒构建质粒pfgl815n(购自addgene)含有t-dna，是农杆菌转化中的常用载体。用引物1+2(见表1)构巢曲霉(aspergillusnidulans)gpda启动子(gpdap)，trpc终止子(trpct)由引物3+4扩增自质粒pan710，然后将二者与kpni消化的pfgl815n用无缝克隆试剂盒(vazyme,china)拼接，形成质粒pfgl-angpdap。遗传霉素抗性基因neor(其序列见seqidno.7)由引物5+6扩增自质粒pbi101并与ncoi消化的pfgl-angpdap通过无缝克隆拼接得到pfgl-neor。表1构建质粒pfgl-neor所用引物2.齿梗孢霉的农杆菌转化方法齿梗孢霉的农杆菌转化方法主要包括如下步骤：1)将含目的dna质粒电转化入农杆菌eha105，涂布于含100μg/ml链霉素和50μg/ml卡那霉素lb固体培养基上，28℃培养48h，挑单菌落pcr鉴定得到重组农杆菌；2)将重组农杆菌单克隆接种于5ml液体含100μg/ml链霉素和50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基，200r/min，28℃过夜培养；3)取400μl重组农杆菌培养液，离心得菌体，并用5ml含400μm乙酰丁香酮的液体诱导培养基重悬菌体至od600约0.1-0.15，28℃避光振荡培养6h左右，使od600达到约0.8；4)将齿梗孢霉接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)25℃培养7天，用含1‰吐温20的无菌水洗下真菌孢子，并用塞了无菌脱脂棉的无菌注射器过滤收集分生孢子，用血球计数板计数后，用诱导培养基稀释孢子浓度至107个/ml；5)取100μl培养好的重组农杆菌菌液与100μl稀释好的分生孢子悬浮液混合，共200μl均匀涂布于含400μm并铺有玻璃纸的固体诱导培养基表面，25℃避光共培养48h；6)将共培养菌体的玻璃纸平移至含300μg/ml孢噻肟钠和100μg/ml遗传霉素的选择培养基上，25℃倒置培养7天至转化子出现；7)将转化子通过菌落颜色筛选法、蛋白提取验证、pcr验证、hplc检测代谢产物鉴定。8)将转化子转接到选择性平板上进行继代培养3-4次，进一步纯化鉴定。转化方法中培养基配方为：a)诱导培养基：葡萄糖1.8g/l、甘油5ml/l、2-(n-吗啉代)乙烷磺酸8.53g/l、七水硫酸镁0.6g/l、氯化钠0.3g/l、二水氯化钙0.01g/l、硫酸亚铁0.001g/l、硝酸铵0.5g/l、ph4.8磷酸钾缓冲液0.8ml/l、微量元素(七水硫酸锌0.1g/l、五水硫酸铜0.1g/l、硼酸0.1g/l、一水硫酸锰0.1g/l、二水钼酸钠0.1g/l)5ml/l，ph调整到5.5。b)选择培养基：pda附加0.3mg/l孢噻肟钠和0.1mg/l遗传霉素。3.齿梗孢霉的农杆菌转化方法关键参数优化研究选择齿梗孢霉孢子浓度、农杆菌菌液浓度、诱导培养基中乙酰丁香酮浓度三个关键参数进行单因素优化，结果如附图2所示，分为三组：a)当农杆菌浓度为0d600＝0.6、乙酰丁香酮浓度为200μg/ml时，不同的真菌孢子浓度对转化效率的影响，结果发现(附图2a)当真菌孢子浓度为107个/ml时转化效率达到最高。b)当真菌孢子浓度为107/ml、乙酰丁香酮浓度为200μg/ml，不同的农杆菌浓度对转化效率的影响，结果发现(附图2b)当重组农杆菌菌液浓度为od600＝0.8时转化效率达到最高。c)当农杆菌浓度为0d600＝0.8、真菌孢子浓度为107/ml，不同的乙酰丁香酮浓度对转化效率的影响，结果发现(附图2c)当诱导培养基中乙酰丁香酮浓度为400μg/ml时转化效率达到最高。由优化实验结果可知，当齿梗孢霉孢子浓度为107个/ml、农杆菌浓度为od600＝0.8、乙酰丁香酮浓度为400μg/ml时转化效率最高，每个选择培养基上可获得约80个转化子。本实施例建立的方法应用于以下实施例中齿梗孢霉的转化。实施例2：建立齿梗孢霉体内高表达体系1.质粒构建研究选取齿梗孢霉体内aurovertin合成基因簇中聚酮合酶基因的启动子aurap(其序列见seqidno.26)，以及三种常用的丝状真菌中组成型启动子：gpdap(其序列见seqidno.27)、tef1p(其序列见seqidno.28)和tubcp(其序列见seqidno.29)作为试验启动子分别与aurc相连。分别用引物7和8、9和10以齿梗孢霉基因组dna为模版扩增出aura启动子(aurap)和aurc终止子(aurct)，然后整合到hindiii/smai消化的pfgl-neor构成质粒pflg-aurap。同样地，分别用引物11+12,13+14和15+16从齿梗孢霉基因组中扩增gpda启动子(gpdap),tef1启动子(tef1p)和tubc启动子(tubcp)，然后与bamhi和hindiii双酶切移除aurap的质粒pflg-aurap整合,分别得到pfgl-gpdap、pfgl-tef1p和pfgl-tubcp。进而，分别用引物17+21,18+21,19+21和20+21从齿梗孢霉基因组扩增aurc，然后与bamhi消化的pfgl-aurap、pfgl-gpdap、pfgl-tef1p和pfgl-tubcp整合，分别得到pfgl-aurap-aurc、pfgl-gpdap-aurc、pfgl-tef1p-aurc、pfgl-tubcp-aurc，高表达质粒示意图见附图3。表2构建高表达质粒所用引物2.齿梗孢霉体内高表达aurc及启动子筛选将以上质粒通过农杆菌转化法对齿梗孢霉进行转化，得到了不同颜色的转化子。前期研究发现：若齿梗孢霉aurovertin合成基因簇中聚酮合酶基因缺失，则菌株为白色；若单加氧酶基因缺失，则菌株为橙黄色；野生型为淡黄色。根据单克隆颜色的深浅，可以初步判断是否回补成功。挑取淡黄色的克隆提取代谢产物进行高效液相色谱(hplc)验证。高效液相色谱检测条件为：色谱柱：xdb-c18，规格：5μm，4.6×150mm、流动相：a相：水+1‰甲酸，b相：乙腈+1‰甲酸、流动相体积比：0—40min：b相：a相＝10：90—0：100、流速：1ml/min。并进一步进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)和蛋白质印迹法(westernblotting)检测aurc表达情况。蛋白表达验证蛋白提取方法为：将齿梗孢霉孢子接种于pdb，120rpm、25℃培养72h，离心得菌丝，加入500μl裂解液超声5min，12000rpm离心10min，上清即蛋白样品。前期研究发现齿梗孢霉中aurovertin生物合成路线为：aurovertin合成大致过程为：一系列前体物质在齿梗孢霉体内经酶aura和aurb催化生成多烯α-吡喃酮(3)，再通过酶aurc和aurd催化生成四氢呋喃多烯α-吡喃酮(4)，然后又在酶aurc、aurd和aurg的催化下生成aurovertinb(1)，最后aurovertinb(1)通过其他未知反应生成aurovertind(2)。结合aurovertin生物合成路线，结果发现(见附图4)，所有的启动子均能将中间产物3进一步氧化，说明aurc被成功表达。aurap和gpdap可完全生成产物1和2，而tef1p和tubcp可部分生成1和2而依然积累中间产物4。sds-page(见附图5b)和westernblotting结果(见附图5a)发现，在齿梗孢霉总蛋白上样量一致的情况下，aurap和gpdap的表达量较高，而tef1p和tubcp表达量较低，与hplc结果一致。4个启动子中aurap和gpdap表达强度最高，而tef1p和tubcp表达强度较弱，但均能在齿梗孢霉体内驱动aurc蛋白高表达。该结果也进一步证明了单加氧酶aurc在aurovertin合成途径中参与了将化合物3氧化为化合物4、将化合物4氧化为1两步氧化反应。综上所述，齿梗孢霉体内高表达系统建立成功。将这4个启动子其插入到齿梗孢霉体内隐性基因簇中的转录激活因子或途径特异性调控因子上游可实现隐性基因簇的激活。实施例3：建立齿梗孢霉体内红色荧光蛋白表达体系1.质粒构建质粒pfgl-tubcp-rfp构建过程是：tubcp和mcherrydna(rfp)(其序列见seqidno.34)分别由引物15+22和23+24从齿梗孢霉基因组和pfa6a-link-yopa-mcherry-kan扩增得到，然后整合到bamhi/hindiii双酶切的pfgl-tubcp质粒中。表3构建红色荧光蛋白质粒所用引物2.齿梗孢霉体内高表达rfp将上述质粒通过农杆菌对齿梗孢霉进行遗传转化，挑取长出的单克隆菌丝在荧光显微镜下观察，结果如附图6所示。相比于野生型菌株，导入rfp的突变株在红色荧光视野下具有强烈的红色荧光信号，而在微分干涉相衬(dic)视野下和用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)进行细胞核染色后的形态无明显差异，证明红色荧光蛋白表达成功。荧光表达系统的成功建立为后续研究酶的亚细胞器定位，从而进一步揭示化合物生物合成反应机理和酶的催化机制鉴定基础。实施例4：建立齿梗孢霉体内基因定向敲除体系1.质粒构建基于同源重组原理构建定向敲除aura载体。分别用引物25+26、27+28扩增出aura上游和下游同源区域，并与ecori/kpni双酶切的载体pfgl-neor拼接得到pfgl-neor-aural+r。定向敲除的示意图见附图7。表4构建定向敲除质粒所用引物seqidno.序列35attatggagaaactcgagaattctaggtgaggtgacttgatg36acaaatagaattaaatggtaccgttgttaggtggtcggtc37agaggtaatcctcccggggatcccaactcgccatcgagtg38tactagaaggactagtggatccgacgtgatgccgcggaag39gaagttgttgagagtgagg40agctatacgactttgatgg41gcctagtgaatgctccg42gaggggtgaagcagaag2.齿梗孢霉体内定向敲除试验将上述定向敲除载体通过农杆菌对齿梗孢霉进行转化，得到了大约50个克隆，其中有20个是白色的。挑取这些白色克隆提取dna分别用引物29+30、31+32pcr验证，pcr验证方法为：在待敲除基因同源臂上游基因组上设计一段引物，在待插入的抗性基因上设计引物，进行pcr分析。结果发现(见附图8)，所有的克隆均显示aura基因已敲除成功。提取阳性克隆次级代谢产物进行hplc验证，发现其产物情况与聚酮合酶基因敲除株一致(见附图9)，进一步证明aura基因敲除成功。综上所述，齿梗孢霉体内基因定向敲除系统建立成功，aura被成功敲除，敲除效率约为40％。应用此敲除系统，可以实现齿梗孢霉生物合成基因簇中基因的高效敲除，从而揭示化合物生物合成反应机制。序列表<110>浙江大学<120>一种内生真菌高效遗传体系的构建方法及其应用<160>42<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>35<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>1gagaattcgagctcggtaccatttaattctatttg35<210>2<211>52<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>2gtttgatgatttcagtaacgttaagtggaccatggtgatgtctgctcaagcg52<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>3aacgttactgaaatcatcaaac22<210>4<211>34<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>4tagtggatccccgggaggattacctctaaacaag34<210>5<211>33<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>5tgagcagacatcaccatgattgaacaagatgga33<210>6<211>35<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>6agtaacgttaagtggactcagaagaactcgtcaag35<210>7<211>795<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>7atgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattc60ggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtca120gcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactg180caggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtg240ctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcag300gatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg360cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgc420atcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaa480gagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgac540ggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaat600ggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggac660atagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttc720ctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttctt780gacgagttcttctga795<210>8<211>38<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>8gacggccagtgccaagctttaggtgaggtgacttgatg38<210>9<211>48<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>9cttatcgtcgtcatccttgtaatcggatccgttgttaggtggtcggtc48<210>10<211>45<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>10gattacaaggatgacgacgataagtgagctggtcagaccaaggcg45<210>11<211>41<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>11acttgtttagaggtaatcctcccgaactgtggacgatctcg41<210>12<211>40<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>12aacgacggccagtgccaagcttcttcacataatatgagtc40<210>13<211>47<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>13ttatcgtcgtcatccttgtaatcggatccgttgtgttgtgttaatcg47<210>14<211>46<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>14gtaaaacgacggccagtgccaagcttcttggctatcacctatatcg46<210>15<211>50<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>15ttatcgtcgtcatccttgtaatcggatccttttgcggttgtgagtgtttg50<210>16<211>38<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>16acgacggccagtgccaagctttcgatgcctagaatctg38<210>17<211>50<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>17cttatcgtcgtcatccttgtaatcggatccattgacgatttgttaaaatg50<210>18<211>36<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>18gaccgaccacctaacaacatgggagcgtattcattc36<210>19<211>36<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>19gttgtgttgtgttaatcgatgggagcgtattcattc36<210>20<211>36<212>dna<213>人工序列(unknown)<400>20acactcacaaccgcaaaaatgggagcgtattcattc36<210>21<211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