本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果的方法。
背景技术：
转移因子（transferfactor，tf）能调节动物机体免疫功能，协同疫苗免疫，缩短疫苗免疫应答期，提高动物免疫水平，具有非常广阔的应用前景。转移因子是存在于人和动物白细胞中的可透析小分子物质，能将供体所具有的细胞免疫功能转移给受体，从而非特异性地增强受体的免疫功能。转移因子的成分主要包括低聚核苷酸和多肽，能诱导机体免疫细胞活化，增强机体免疫力，能转移包括病毒、细菌、寄生虫、真菌、组织相容性抗原和肿瘤抗原等多种抗原的细胞免疫。此外，转移因子具有分子质量小、无毒、无抗原性、不引起过敏反应、不产生对抗抗体且可超越种系界限应用等优点。
由于转移因子使用安全、作用迅速、效果显著、无药物残留、无抗原性、无毒副作用，且来源广，同时，其作为免疫激发剂和辅助制剂，可显著提高对动物疾病的防控效果，市场认可度逐渐提高。因此，转移因子在兽医临床领域，将逐步地释放其应用优势，转移因子产品的开发与应用将对畜牧业的发展具有十分重要的现实意义。
猪蓝耳病又称“猪繁殖与呼吸障碍综合征”，是由猪繁殖与呼吸道综合征病毒引起的一种以成年猪生殖障碍、早产、流产和死胎，以及仔猪呼吸异常为特征的传染病，它破坏了猪机体巨噬细胞的免疫功能，造成免疫抑制，易继发多种呼吸道疾病。世界上许多国家和地区都发生过猪蓝耳病，该病于上世纪年代中期传入我国，世界动物卫生组织将其列为法定报告动物疫病，我国列为二类动物疫病。该疫情侵袭繁殖和呼吸系统，主要表现为母猪繁殖障碍、仔猪断奶前高死亡率、育成猪的呼吸道疾病三大症状。经产和初产母猪多表现为高热、精神沉郁、厌食、呼吸困难，少数母猪耳朵、乳头、外阴、腹部、尾部发给，以耳尖最为常见。出现这些症状后，大量怀孕母猪流产或早产，产下木乃伊、死胎和病弱仔猪，死产率可达一。早产母猪分娩不顺，少奶或无奶。仔猪特别是吃奶猪，死亡率很高，可达80%以上。
大量的试验研究表明，转移因子对猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒活疫苗具有协同作用，能显著提高机体细胞免疫水平，缩短机体免疫应答期，促进抗体的产生，并延长抗体高峰期，使之维持更长的时间。但目前检测转移因子与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒活疫苗联合使用效果的主要通过检测抗体及细胞因子来展现，检测成本高、周期长且生物体个体差异大，检测结果较不稳定。因此建立一种快速、方便、检验成本低且检验结果相对稳定的检测猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果的方法具有重要意义。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种在细胞上展现的、检验成本低且检验结果相对稳定的检测猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果的方法
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种检测猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果的方法，其包括以下步骤：
1）取猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗原液，用含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基稀释至含200tcid50的病毒液；
取猪脾转移因子，用含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基稀释将多肽含量稀释至1mg/ml；
2）在含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基中将细胞培养至单层；
3)取步骤2)中的单层细胞，用含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基稀释，调整细胞浓度为2~3×105个/ml，将稀释后的细胞接种于细胞培养板中，继续培养；形成细胞单层后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞板，去除培养基；
4）将步骤1）稀释后的病毒液以及稀释后的猪脾转移因子上样于步骤3）的细胞培养板中，并培养孵育细胞；上样量为100μl/孔，具体如下：
含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基35-45μl；
病毒液20-30μl；
猪脾转移因子30-40μl；
5)将步骤4）孵育的细胞用mtt溶液进行反应，继续孵育；
6)将步骤5）孵育的细胞用二甲基亚砜进行溶解处理；
7）将步骤6）处理后的细胞板放置于酶标仪中测量od值，测定细胞活性。
步骤1）中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗为ch-1r株。
步骤2）中，所述细胞为pk-15细胞。
步骤3）中，所述细胞培养板为96孔细胞培养板。
进一步，步骤3）中，细胞稀释的具体步骤如下：将步骤2)中的单层细胞用无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液洗2-3次，然后加入1.0ml胰酶消化液，轻轻摇动培养皿，使消化液布满所有细胞表面，于37℃放置数分钟，然后弃去消化液，用含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基将细胞洗脱，将洗脱后的细胞悬液进行稀释，调整细胞浓度为2~3×105个/ml。
进一步，步骤3）中，稀释后的细胞培养条件为：细胞接种量100μl/孔，在36.5-37.5℃、4.5-5.5%co2条件下培养18-24h形成细胞单层。
优选的，步骤4）中，上样量具体如下：
含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基40μl；
病毒液25μl；
猪脾转移因子35μl（即猪脾转移因子d的浓度为350μg/ml）。
步骤4）中，培养孵育细胞的条件为在36.5-37.5℃、4.5-5.5%co2条件下培养40-48h。
步骤5）中，细胞继续孵育的时间为3.5-4.5h。
步骤7）中，于480-500nm波长处测量od值。
本发明采用以上方法对猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果进行检测，和现有技术不同点在于，现有技术检测均在实体动物上（猪）检测，检验成本高，周期长且生物个体差异大易导致结果不稳定，而本发明方法是在细胞上展现，快速、方便，检验成本低，结果相对稳定。
附图说明
图1为不同tf浓度对pk-15细胞体外增殖的测定结果；
图2为不同体积疫苗稀释液对pk-15细胞体外增殖的测定结果；
图3为8批tf溶液与猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合使用时，细胞增殖的测定结果。
具体实施方式
一种检测猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果的方法，包括以下步骤：
1）取猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗（ch-1r株）原液，用含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基稀释至含200tcid50的病毒液；
取猪脾转移因子，用含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基稀释将多肽含量稀释至1mg/ml；
2）在含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基中将pk-15细胞培养至单层；
3)将步骤2）中的单层细胞用无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液洗2-3次，然后加入1.0ml胰酶消化液，轻轻摇动培养皿，使消化液布满所有细胞表面，于37℃放置数分钟，然后弃去消化液，用含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基将细胞洗脱，将洗脱后的细胞悬液进行稀释，调整细胞浓度为2~3×105个/ml，将稀释后的细胞接种于96孔细胞培养板中，100μl/孔，在36.5-37.5℃、4.5-5.5%co2条件下培养20h左右（18-24h）形成细胞单层，然后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞板，去除培养基；
4）将步骤1）稀释后的病毒液以及稀释后的猪脾转移因子上样于步骤3）的细胞培养板中，在36.5-37.5℃、4.5-5.5%co2条件下培养40-48h；
其中，上样量为100μl/孔，具体如下：
含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基35-45μl；
病毒液20-30μl；
猪脾转移因子30-40μl（优选为35μl）；
5)在步骤4）的细胞培养板中加入mtt溶液，10μl/孔，继续孵育3.5-4.5h，然后弃去上清，加入二甲基亚砜溶液，100μl/孔，缓慢摇匀10min；在480-500nm波长处测量每孔吸光值，测定细胞活性，与对照组相比，计算细胞增值率。
实施例1
一种检测猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果的方法，包括以下步骤：
1）取猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗（ch-1r株）原液，用含2%新生牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基稀释至含200tcid50的病毒液；
取猪脾转移因子，用含2%新生牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基稀释将多肽含量稀释至1mg/ml；
2）在含10%新生牛血清、1.0%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基中将pk-15细胞培养至单层；
3)将步骤2）中的单层细胞用无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液洗2次，然后加入1.0ml胰酶消化液，轻轻摇动培养皿，使消化液布满所有细胞表面，于37℃放置数分钟，然后弃去消化液，用含10%新生牛血清、1.0%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基将细胞洗脱，将洗脱后的细胞悬液进行稀释，调整细胞浓度为2~3×105个/ml，将稀释后的细胞接种于96孔细胞培养板中，100μl/孔，在37℃、5.0%co2条件下培养20h左右形成细胞单层，然后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞板，去除培养基；
4）将步骤1）稀释后的病毒液以及稀释后的猪脾转移因子上样于步骤3）的细胞培养板中，在37℃、5.0%co2条件下培养44h；
其中，上样量为100μl/孔，具体如下：
含2%新生牛血清、1.0%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基40μl；
病毒液25μl；
猪脾转移因子35μl；
5)在步骤4）的细胞培养板中加入mtt溶液，10μl/孔，继续孵育4h，然后弃去上清，加入二甲基亚砜溶液，100μl/孔，缓慢摇匀10min；在490nm波长处测量每孔吸光值，测定细胞活性。
实施例2
一种检测猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果的方法，包括以下步骤：
1）取猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗（ch-1r株）原液，用含1.8%新生牛血清、0.8%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基稀释至含200tcid50的病毒液；
取猪脾转移因子，用含1.8%新生牛血清、0.8%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基稀释将多肽含量稀释至1mg/ml；
2）在含8%新生牛血清、0.8%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基中将pk-15细胞培养至单层；
3)将步骤2）中的单层细胞用无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液洗2次，然后加入1.0ml胰酶消化液，轻轻摇动培养皿，使消化液布满所有细胞表面，于37℃放置数分钟，然后弃去消化液，用含8%新生牛血清、0.8%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基将细胞洗脱，将洗脱后的细胞悬液进行稀释，调整细胞浓度为2~3×105个/ml，将稀释后的细胞接种于96孔细胞培养板中，100μl/孔，在36.5℃、4.5%co2条件下培养20h左右形成细胞单层，然后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞板，去除培养基；
4）将步骤1）稀释后的病毒液以及稀释后的猪脾转移因子上样于步骤3）的细胞培养板中，在36.5℃、4.5%co2条件下培养48h；
其中，上样量为100μl/孔，具体如下：
含1.8%新生牛血清、0.8%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基35μl；
病毒液25μl；
猪脾转移因子40μl；
5)在步骤4）的细胞培养板中加入mtt溶液，10μl/孔，继续孵育3.5h，然后弃去上清，加入二甲基亚砜溶液，100μl/孔，缓慢摇匀10min；在490nm波长处测量每孔吸光值，测定细胞活性。
实施例3
一种检测猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果的方法，包括以下步骤：
1）取猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗（ch-1r株）原液，用含2.2%新生牛血清、1.2%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基稀释至含200tcid50的病毒液；
取猪脾转移因子注射液，用含2.2%新生牛血清、1.2%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基稀释将多肽含量稀释至1mg/ml；
2）在含12%新生牛血清、1.2%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基中将pk-15细胞培养至单层；
3)将步骤2）中的单层细胞用无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液洗2次，然后加入1.0ml胰酶消化液，轻轻摇动培养皿，使消化液布满所有细胞表面，于37℃放置数分钟，然后弃去消化液，用含12%新生牛血清、1.2%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基将细胞洗脱，将洗脱后的细胞悬液进行稀释，调整细胞浓度为2~3×105个/ml，将稀释后的细胞接种于96孔细胞培养板中，100μl/孔，在37.5℃、5.5%co2条件下培养20h左右（18-24h）形成细胞单层，然后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞板，去除培养基；
4）将步骤1）稀释后的病毒液以及稀释后的猪脾转移因子注射液上样于步骤3）的细胞培养板中，在37.5℃、5.5%co2条件下培养40-h；
其中，上样量为100μl/孔，具体如下：
含2.2%新生牛血清、1.2%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基45μl；
病毒液25μl；
猪脾转移因子注射液30μl；
5)在步骤4）的细胞培养板中加入mtt溶液，10μl/孔，继续孵育4.5h，然后弃去上清，加入二甲基亚砜溶液，100μl/孔，缓慢摇匀10min；在490nm波长处测量每孔吸光值，测定细胞活性。
实施例4
一种检测猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果的方法，其具体步骤同实施例1，区别在于：
步骤4）中，上样量为100μl/孔，具体如下：
含2.2%新生牛血清、1.2%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基35μl；
病毒液30μl；
猪脾转移因子35μl。
实施例5
一种检测猪脾转移因子和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合免疫效果的方法，其具体步骤同实施例1，区别在于：
步骤4）中，上样量为100μl/孔，具体如下：
含2.2%新生牛血清、1.2%青霉素-链霉素双抗的完全dmem培养基40μl；
病毒液20μl；
猪脾转移因子40μl。
实施例6
猪脾转移因子对细胞体外增殖的最优浓度确定
本发明中，步骤4）中加入细胞培养板中的猪脾转移因子为每孔30-40μl，优选为35μl，即猪脾转移因子得优选浓度为350μg/ml，该最佳浓度是通过以下方法筛选确定的：
1、培养基配制
取dmem培养基，加入青霉素-链霉素双抗及新生牛血清，配置成含1%青霉素-链霉素双抗和10%新生牛血清的dmem培养基(以下简称10%dmem培养基)及含1%青霉素-链霉素双抗和2%新生牛血清的dmem培养基(以下简称2%dmem培养基)，置于4℃保存。
2、细胞培养
将生长旺盛的pk-15单层细胞用无钙、镁离子的pbs洗2次，加入1.0ml胰酶消化液，轻轻摇动培养皿，使消化液布满所有细胞表面。于37℃放置数分钟。弃去消化液，用10%dmem培养基将细胞洗脱。将洗脱后的细胞悬液用10%dmem培养基进行稀释，调整细胞浓度为2~3×105个/ml。将稀释好的细胞接种于96孔细胞培养板，100μl/孔。在37℃、5%co2条件下培养20h左右形成细胞单层。
3、待检样品稀释
取猪脾转移因子，用含2%血清的dmem培养基将多肽含量稀释至1mg/ml，作待检样品。
取猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗（ch-1r株）原液，用含2%血清的dmem培养基稀释至含200tcid50的病毒液。
4、取猪脾转移因子（tf）对细胞体外增殖的最优浓度确定
tf浓度设计7个水平，分别是：200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml、350μg/ml、400μg/ml、450μg/ml、500μg/ml。在96孔细胞培养板上进行细胞增殖试验。试验设2个组别，1个试验组(细胞+tf)，1个对照组(细胞)，每个样品设4个重复孔。试验结果用mtt法测定。测出od490值后，计算出细胞增殖率，选出tf浓度最佳值。
计算细胞增殖率公式如下：细胞增殖率=试验组od值/对照组0d值。
5、实验结果
tf浓度对pk-15细胞体外增殖率的测定结果如图1所示，由图1确定tf对pk-15细胞体外增殖的最优浓度350μg/ml。
实施例7
疫苗稀释液（病毒液）对细胞体外增殖的最优体积确定
本发明中，步骤4）中加入细胞培养板中的疫苗稀释液为每孔20-30μl，优选为25μl，该最佳体积是通过以下方法筛选确定的：
1、培养基配制
取dmem培养基，加入青霉素-链霉素双抗及新生牛血清，配置成含1%青霉素-链霉素双抗和10%新生牛血清的dmem培养基(以下简称10%dmem培养基)及含1%青霉素-链霉素双抗和2%新生牛血清的dmem培养基(以下简称2%dmem培养基)，置于4℃保存。
2、细胞培养
将生长旺盛的pk-15单层细胞用无钙、镁离子的pbs洗2次，加入1.0ml胰酶消化液，轻轻摇动培养皿，使消化液布满所有细胞表面。于37℃放置数分钟。弃去消化液，用10%dmem培养基将细胞洗脱。将洗脱后的细胞悬液用10%dmem培养基进行稀释，调整细胞浓度为2~3×105个/ml。将稀释好的细胞接种于96孔细胞培养板，100μl/孔。在37℃、5%co2条件下培养20h左右形成细胞单层。
3、猪脾转移因子稀释
取猪脾转移因子，用含2%血清的dmem培养基将多肽含量稀释至1mg/ml。
取猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗（ch-1r株）原液，用含2%血清的dmem培养基稀释至含200tcid50的病毒液。
4、疫苗稀释液对细胞体外增殖的最优体积确定
疫苗体积设计9个水平，分别是：10μl、15μl、20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、45μl、50μl。在96孔细胞培养板上进行细胞增殖试验。试验设2个组别，1个试验组(细胞+转移因子+疫苗)，1个对照组(细胞+转移因子)，每个样品设4个重复孔。试验结果用mtt法测定。测出od490值后，计算出细胞增殖率，选出疫苗体积最适值。
计算细胞增殖率公式如下：细胞增殖率=试验组od值/对照组0d值。
5、实验结果
疫苗稀释液体积对pk-15细胞体外增殖率的测定结果如图2所示，由图2确定疫苗稀释液对pk-15细胞体外增殖的最优体积为25μl。
实施例8
猪脾转移因子（tf）和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合使用对pk-15细胞的作用
在tf浓度最佳值以及疫苗稀释液（病毒液）对细胞体外增殖的最优体积确定的条件下，取已长成单层细胞的96孔板，试验按照以下设计进行：
对照组：75μl2%dmem培养基+25μl猪繁殖与呼吸综合征病毒液；
试验组：40μl2%dmem培养基+25μl猪繁殖与呼吸综合征病毒液+35μl待检样品；
每组设4孔重复。置于37℃、5%co2条件下培养44h，加入mtt溶液，10μl/孔，继续培养4h，弃去上清，加入dmso溶液，100μl/孔，缓慢摇匀10min。在490nm处测量每孔吸光值，计算细胞增殖率。
不同批次tf联合猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗使用对pk-15细胞的作用结果如图3所示。试验共选用8批tf溶液进行，根据统计学t检验，试验组与对照组比较，除2017008批次tf与疫苗联合使用时pk-15细胞增殖率无差异(p>0.05)，其余批次差异显著(p<0.05)。2017011批tf与疫苗联合使用时，pk-15细胞增殖率可达到126.89%。不同批次tf与猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合使用时，pk-15细胞增殖率平均值为119.71%±5.64%。
本发明应用mtt法测定了tf溶液对pk-15细胞增殖的影响，结果发现，当tf浓度为350μg/ml时，试验组pk-15细胞的增殖速度极显著高于对照组（p<0.01），且在五次重复试验中试验组pk-15细胞的增殖速度相对稳定；当tf与猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗联合使用时，其促进pk-15细胞的增殖效应比单独使用猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗时刺激pk-15细胞增殖效果好(p<0.05)。说明本发明方法可增强猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗免疫效果，本发明的检测方法在细胞上展现，检验成本低，结果相对稳定。