本发明属于医药技术领域，具体涉及一种plexinb2基因沉默的人肺癌稳定细胞株及其构建方法。
背景技术：
肺癌是发病率和死亡率增长最快、对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。肺癌的病因至今尚不完全明确，复发和转移是许多患者治疗失败和死亡的主要原因，因而揭示肺癌转移的机制，进而预测肺癌的转移潜能，对判断预后和选择合理而有效的治疗方案、延长患者的生存期和提高生活质量等具有重要的意义。
神经丛素(plexins)是一个广泛分布的跨膜受体家族，是信号素(semaphorins)的受体，介导semaphorins在细胞内信号传导，分为4个亚家族：plexin-a(1-4)、plexin-b(1-3)、plexin-c1和plexin-d1。研究表明，plexins在多种肿瘤细胞中广泛表达，有些plexins高表达与肿瘤转移有关。其中，plexin-b2位于第22号染色体，包含37个编码外显子，有1838个氨基酸组成，为sema4c的高亲和力受体，可受肝细胞生长因子hgf的介导的细胞内信号调控而促进细胞迁移。最近的研究显示，在神经元细胞中plexin-b2与rnd3表达可能是负相关的关系，plexin-b2可通过激活rhogefs蛋白，在进一步活化rhoa蛋白，从而促进神经元迁移，而rnd3通过抑制rhogap激活，从而抑制rhoa蛋白活化，最终降低神经元的迁移，同时rnd3可能还受plexin-b2负调控。在细胞骨架研究方面，plexins通过与larg和pdz-rhogef结合可使rho活化，在plexins家族中只有plexinb亚家族成员含有pdz域结合位点，一些semaphorins作用于plexinb可以调控rho，从而在轴突导向和细胞迁移时调节细胞骨架肌动蛋白、整合素功能、细胞粘附等，这提示plexin-b2可能在肺癌中也能起到微丝骨架调控作用。pak1可能在多种信号通路中处于关键位置，是多种信号分子的下游靶蛋白，同时也是多种信号分子的上游调控蛋白，研究证实，pak1可被多种生长因子如hgf、igf、pdgf、egf等通过多种路径激活。已有多项报道pak1是rho家族cdc42和rac1下游的重要靶蛋白，参与了细胞骨架的调节、细胞凋亡、细胞转分化等生物学行为，提示它在信号网络中可能起到关键的调控作用。此外，大量研究结果表明，激活的pak1可通过下游效应物的作用limk1/2、cofilin促进细胞骨架重构和肿瘤细胞迁移，而失活的pak1则引起相反的效应。关于plexin-b2在肿瘤中的研究尚少，其在肺癌中的作用尚不明确。我们以往的研究及其他文献报道，pak1/limk-1/微丝骨架蛋白在肺癌增殖、转移过程中发挥重大作用。然而，plexin-b2是否调控pak1/limk-1/cofilin通路并影响肺癌的增殖和转移，目前尚不清楚。我们前期的预实验表明plexin-b2在肺癌组织中的表达明显高于癌旁组织，提示plexin-b2可能参与肺癌发生及转移的调控。
目前，文献报道plexin-b2功能研究主要采用表达质粒瞬时转染方法，其缺点是plexin-b2的表达不稳定、不持久。然而，慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，能特异、持续、稳定促进目的基因表达的优点。现有技术中尚无持续、稳定沉默plexin-b2基因的人肺癌细胞株。本发明通过慢病毒转染得到的稳定细胞株，为研究肺癌plexin-b2/pak1/limk-1/cofilin信号通路与肿瘤转移提供有力工具。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种plexinb2基因沉默的人肺癌稳定细胞株及其构建方法，为研究肺癌pak1/limk-1/cofilin信号通路与肿瘤转移提供有力工具。
本发明通过以下技术方案实现：该细胞株利用基因重组技术将人plexinb2基因克隆入慢病毒表达载体，通过293t细胞包装得到病毒载体，然后将获得的病毒感染目的细胞，puromycin进行药物筛选，rt-pcr鉴定阳性细胞簇、扩大培养，收获蛋白再用westernblot进行鉴定，最终获得稳定细胞株，将其冻于液氮中保藏。与现有技术相比，本发明通过慢病毒转染得到的稳定细胞株，具有转染效率高，用量少，能特异、持续干扰plexinb2表达的优点。本发明为研究肺癌pak1/limk-1信号通路与肿瘤转移提供有力工具。
附图说明
图1是本发明的载体图谱
图2是本发明的重组质粒的测序鉴定
图3是本发明通过稳定沉默plexinb2基因表达的肺癌a549及pc-9稳定细胞株在激光共聚焦显微镜(200×)的细胞荧光鉴定图
图4是本发明通过稳定沉默plexinb2基因表达的肺癌a549及pc-9稳定细胞株rt-pcr鉴定图
图5是本发明通过稳定沉默plexinb2基因表达的肺癌a549及pc-9稳定细胞株westernblot鉴定图
具体实施方式
1材料与方法
1.1材料人肺癌a549细胞、pc-9细胞、人肾上皮细胞293t购自中国科学院上海细胞所，慢病毒包装试剂盒购自上海吉凯基因，胎牛血清和rpmi1640培养基购自gibco公司，xhoi、hpai内切酶和t4dna连接酶购自neb公司，质粒提取试剂盒试剂盒购自omega公司，转染试剂lipofectamine2000和总rna提取试剂trizoi购自invitrogen公司，反转录试剂盒primescriptrtreagentkit(perfectrealtime)和荧光定量pcr试剂盒sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)购自takara公司，gapdh、plexinb2抗体购自美国cellsignaling公司，化学发光试剂购自bio-rad公司，倒置荧光显微镜leica，凝胶成像系统，imark型全自动酶标仪购自美国bio-rad公司。
1.2方法
1.2.1干扰序列设计
在genbank检索出入plexinb2基因核苷酸序列(基因号nm_012401)，设计针对人plexinb2的2个干扰rna序列(tab1)。正义与反义sirna之间由6个碱基(ctcgag)的loop环连接，同时设计1条无关序列作为阴性对照，作用序列为5′-ttctccgaacgtgtcacgt-3′，通过blast验证该序列对任何基因无干扰效应。
tab1：plexinb2干扰rna序列
1.2.2慢病毒表达载体的构建及鉴定
空载体gv248含有增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorecenceprotein，egfp)序列，用限制性内切酶agei\ecori双酶切空载体，并回收酶切片段。上下游oligodna经退火形成双链dna，然后与线性化后的空载体gv248在t4dna连接酶作用下16℃过夜连接，连接产物转化感受态细胞stb13。37℃培养16h后挑阳性克隆进行菌落pcr鉴定，pcr引物为载体多克隆位点两端的引物，序列为f：5′-tacgtcaagtcttacggcaagaata-3′，r：5′-gagcttatcgataccgtcgac-3′，空载体质粒会扩增出239bp的片段，插入shrna序列的质粒会扩增出305bp的片段。pcr鉴定阳性的菌落接种lb液体培养基中培养过夜，提取质粒送测序。经测序鉴定正确的重组质粒分别命名为plxnb2-rnai(42950-1)、plxnb2-rnai(42951-2)。
1.2.3慢病毒包装
收集对数生长期的293t细胞，接种5×107个于15cm的培养皿中，37℃、5％co2的培养箱中培养过夜。按照lipofectamine2000说明书用脂质体进行共转染：在灭菌ep管中加入配制好的各dna溶液，与相应体积的opti-mem混合均匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5min；在另一灭菌ep管中取lipo2000试剂与2.4mlopti-mem混合，在室温下温育5min；把稀释后的dna与稀释后的lipo2000进行混合，在室温下温育20min，以便形成dna与lipo2000稀释液的转染复合物；将转染复合物转移至293t细胞的培养液中，混匀，于37℃，5％co2细胞培养箱中培养。转染48h后收集293t细胞的上清，用0.45μm滤器进行过滤，滤液经超速离心后浓缩，分装，保存于-80℃。plxnb2-rnai(42950-1)和plxnb2-rnai(42951-2)经包装后获得的慢病毒分别命名为plexinb2-shrna-1和plexinb2-shrna-2。
1.2.4病毒滴度测定
滴度测定采用逐孔稀释法，测定前1d将5×104/ml293t细胞按每孔100μl接种于96孔板中，常规培养24h。准备10个无菌的ep管，每个管中加入90μl培养基，取病毒原液10μl加入到第1个管中，混匀后，取10μl加入到第2个管中，如此依次做10∶1倍比稀释。选取96孔板中所需的细胞孔，吸去90μl培养基，加入稀释好的病毒溶液，37℃培养48h后，加入新鲜培养基100μl继续培养。96h后在荧光显微镜下观察荧光表达情况，计数孔中荧光细胞数，结合稀释倍数计算病毒滴度：滴度(tu/ml)＝荧光细胞数×有效稀释倍数。
1.2.5稳定干扰细胞株的建立
取对数生长期状态良好的a549细胞按每孔5×105个接种于6孔板。24h细胞贴壁后，加入上述包装好的病毒。培养8h后，更换为新鲜rpmi1640完全培养基2ml继续培养，72h后荧光显微镜下观察感染效率。转染96h后，加入终浓度2mg/ml的puromycin进行药物筛选；每3天更换一次含2mg/mlpuromycin的rpm1-1640培养基，筛选4周。然后在显微镜下挑取阳性细胞簇，再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。在荧光显微镜下观察单克隆形成的情况，对荧光强度较高的阳性克隆孔，扩大培养，为下一步检测作准备。得到的2株稳定干扰细胞分别命名为a549/shplexinb2-1和a549/shplexinb2-2，阴性对照细胞命名为照细胞命名为a549/shcontrol。
取对数生长期状态良好的pc-9细胞按每孔3×105个接种于6孔板。24h细胞贴壁后，加入上述包装好的病毒。培养8h后，更换为新鲜rpmi1640完全培养基2ml继续培养，72h后荧光显微镜下观察感染效率。转染96h后，加入终浓度0.5mg/ml的puromycin进行加药筛选；每3天更换一次含0.5mg/mlpuromycin的rpm1-1640培养基，筛选4周。然后在显微镜下挑取阳性细胞簇，再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。在荧光显微镜下观察单克隆形成的情况，对荧光强度较高的阳性克隆孔，扩大培养，为下一步检测作准备。得到的2株稳定干扰细胞分别命名为pc-9/shplexinb2-1和pc-9/shplexinb2-2，阴性对照细胞命名为照细胞命名为pc-9/shcontrol。
1.2.6rt-pcr检测细胞plexinb2mrna干扰效率
收集a549/shplexinb2-1、a549/shplexinb2-2、a549/shcontrol、pc-9/shplexinb2-1、pc-9/shplexinb2-2和pc-9/shcontrol细胞，按trizol试剂和反转录试剂盒说明书提供的方法提取细胞总rna，并将其反转录为cdna。以此cdna为模板，应用荧光定量pcr试剂盒进行pcr扩增，plexinb2和gapdh基因引物由上海生工合成。plexinb2：5′-gagcatttcagttccgctgtg-3′(上游)，5′-agtcagcagtgatgcaaagt-3′(下游)；gapdh：5′-gtctcctctgacttcaacagcg-3′(上游)，5′-accaccctgttgctgtagcc-3′(下游)。pcr反应条件：95℃60s；95℃15s、60℃1min，共40个循环。以2-δδct值表示plexinb2基因mrna的相对表达水平。
1.2.7westernblot检测细胞plexinb2蛋白干扰效率
收集a549/shplexinb2-1、a549/shplexinb2-2、a549/shcontrol、pc-9/shplexinb2-1、pc-9/shplexinb2-2和pc-9/shcontrol细胞，加入细胞裂解液冰上裂解30min，冰上进行操作。收集到ep管，bca蛋白定量法测定蛋白浓度定量。取10～15μg蛋白质进行10％sds-page电泳，分离后的蛋白质电转移至pvdf膜上，用含5％bsa的pbst封闭1h，分别加入对应一抗4℃孵育过夜，tbst洗膜3次后，加入对应二抗室温摇床孵育2h，tbst洗膜3次，ecl发光试剂盒发光显影，定影后进行分析。
1.3统计学方法
数据以均数±标准差表示，采用spss13.0统计软件分析，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析，p≤0.05为差异有统计学意义。
2实验结果
2.1荧光显微镜下观察plexinb2-shrna稳转后细胞的形态
用plexinb2-shrna1和plexinb2-shrna2两种慢病毒分别感染a549细胞和pc-9细胞后，都可观察到绿色荧光，感染率达到100％，如图2。
2.2rt-pcr检测稳转后细胞内plexinb2mrna的表达
应用实时荧光定量pcr检测结果显示，plexinb2-shrna1和plexinb2-shrna2稳定干扰a549细胞后plexinb2mrna的相对表达水平都明显低于plexinb2/shcontrol细胞。plexinb2-shrna1和plexinb2-shrna2mrna干扰率分别是(74.23±2.28)％和(61.46±2.39)，差异有统计学意义(p＜0.01)，如图3。plexinb2-shrna1和plexinb2-shrna2稳定干扰pc-9细胞后plexinb2mrna的相对表达水平也都明显低于plexinb2/shcontrol细胞。plexinb2-shrna1和plexinb2-shrna2mrna干扰率分别是(87.43±3.34)％和(78.45±2.29)，差异有统计学意义(p＜0.01)，如图3。
2.3westernblot检测稳转后细胞内plexinb2蛋白的表达
应用westernblot检测结果显示：plexinb2-shrna1和plexinb2-shrna2稳转a549细胞后plexinb2蛋白水平表达都较空白载体组显著降低，plexinb2-shrna1和plexinb2-shrna2蛋白表达水平分别为对照组0.34和0.53倍(p＜0.01)，如图4。plexinb2-shrna1和plexinb2-shrna2稳转pc-9细胞后plexinb2蛋白水平表达都较空白载体组显著降低，plexinb2-shrna1和plexinb2-shrna2蛋白表达水平分别为对照组0.11和0.19倍(p＜0.01)，如图4。