本发明涉及蚕蛹深加工技术领域，尤其是涉及一种小分子量蚕蛹胶原蛋白。
背景技术：
胶原蛋白，或称胶原，是由动物细胞合成的一种生物性高分子，广泛存在于动物骨、腱、软骨、皮肤及其它结缔组织中，具有支撑器官、保护机体的功能，约占动物总蛋白量的30%。海洋中的水生动物种类繁多，且不同的水生动物其形态及身体结构都存在巨大差异。作为无脊椎动物头足类的鱿鱼，其具有发达的真皮组织，其体内的胶原蛋白主要分布在真皮组织中。胶原蛋白分子结构很稳定，且免疫原性低，生物相容性良好，这些性质决定了它的用途，胶原蛋白用途非常广泛，产品有各种不同形状及用途，遍及食品化工医药等多个领域，胶原蛋白正成为食品医药和化妆品行业中的新宠。要开发利用胶原产品就会涉及到胶原蛋白的分离纯化工作。只有从原料中提取到比较纯的胶原才能进行后续研究，提取工作是基础。目前为止，提取胶原蛋白通常有四种方法：即酸法、盐法、酶法、以及热水浸提法。
自古以来，桑蚕业就在中国的农业中占有着重要地位，我国是世界上最早且最大的养蚕缫丝的国家。2014年，我国蚕茧年产量据报道有65万吨左右，约占世界总产量的80%。蚕蛹是将蚕茧缫丝后的副产物，一般每生产1吨生丝会产出0.8吨的干蛹，因而蚕蛹产量十分巨大。现代科学研究发现，蚕蛹富含蛋白质、脂肪、甲壳素、糖类以及多种蛋白激素、维生素、微量元素等生物活性成分，具有很高的营养、药用价值和广阔的市场前景。蚕蛹中的蛋白质在所有成分中的含量最高，含水量在4-6%的干蚕蛹中，蛋白质含量为50-65%左右，油脂约占23-30%，甲壳素含量约为2-3%，并富含糖类、多种维生素、丰富的微量元素及抗菌肽等生物活性成分等。因而蚕蛹在食品、饲料、化工等领域有着广泛的应用。而由于缺少深加工技术，大部分蚕蛹被用于饲料及肥料，附加值一直较低。蚕蛹经过脱脂、脱臭、脱色等工艺处理后，可得到高纯度的蚕蛹蛋白。蚕蛹蛋白含有多种氨基酸，近年来受到了国内外的广泛关注，蚕蛹蛋白的开发使蚕蛹资源得到了进一步的开发与利用。而用蚕蛹制备胶原蛋白还未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种纯度高、活性高、分子量较为集中，制备方法简单可行、脱脂效率高、得率高，易于工业化生产，安全性更高，提高蚕蛹附加值的一种小分子量蚕蛹胶原蛋白。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：
一种小分子量蚕蛹胶原蛋白，其分子量为600-1000da，该胶原蛋白营养丰富，蚕蛹蛋白氨基酸比例优良，能提高淋巴细胞活性，通过淋巴系统提高机体免疫功能，增强机体的防病、抗病能力，还能清除生物体内的自由基及促进机体血细胞再生，并且具有显著的抗肿瘤活性，可作为营养添加剂用于面包、面条、饼干、调味品或高蛋白饮料中。
一种小分子量蚕蛹胶原蛋白的制备方法，其具体包括以下步骤：
脱脂：按料液比为1:4-6（g/ml）向蚕蛹粉中加入脱脂剂，然后在35-45℃下脱脂20-30min，冷却后抽滤，滤渣即为脱脂蚕蛹，然后在50-70℃下烘干，备用，该脱脂步骤具有脱脂率高、溶剂无残留、无毒不易燃、蛋白质不变形等优点，同时脱脂剂容易回收，能够降低脱脂成本；
酶解：按料液比为1:20-30（g/ml）向脱脂蚕蛹中加入ph为7.5-8.5的磷酸缓冲液，再加入脱脂蚕蛹重量2-4%的中性蛋白酶，在45-55℃下酶解1-2h，然后将温度升至90-100℃，保温10-20min进行灭酶，冷却后在温度为1-5℃、转速为8000-10000rpm的离心机中离心8-10min，上清液即为粗蛋白液，酶法水解安全性更高，在温和条件下进行定位水解，水解过程也比较容易控制，胶原蛋白主要为酶溶性的，用蛋白酶将胶原蛋白分子的非螺旋区域切断后，胶原的三螺旋主区域很容易溶于提取液中，并且蛋白酶不会对胶原蛋白的三螺旋结构产生影响，其提取量很大，且其结构和酸法提取的胶原蛋白结构一样，该胶原蛋白松散且多孔，有规则均匀的蜂窝状多孔，这种网状多孔结构适合于做药物载体，不仅有利于药物的均匀分布，还有利于液体的挥发；
盐析：向粗蛋白液中加入浓度为1.8-2.2wt%的壳聚糖溶液，粗蛋白液与壳聚糖溶液的重量体积比为1:4-6，调节ph至6.5-7，搅拌20-25min，在温度为1-5℃、转速为8000-10000rpm的离心机中离心8-10min，将上清液放入冰水浴中，加入硫酸铵使其浓度为50-55wt%，搅拌至硫酸铵完全溶解，静置过夜，然后在温度为1-5℃、转速为8000-10000rpm的离心机中离心8-10min，沉淀物即为盐析沉淀物，该步骤中加入大量的硫酸铵，使蛋白质得溶解度降低而沉淀析出，该方法优点在于硫酸铵浓度变化具有连续性，盐析效果好，节约能耗；
透析：将盐析沉淀物溶解于磷酸盐缓冲液，然后装入截留分子量为1000的透析袋中，排除气泡，封口，置于磷酸盐缓冲液中透析，更换缓冲液4-6次，即得透析液，该方法利用小分子物质在溶液中可通过透析袋，而大分子物质不能通过透析袋的性质，达到分离小分子杂质的目的，操作简单，效果好，节约能耗；
纯化：将用缓冲液浸泡10-12h的羟基磷灰石装入含有预加缓冲液和的柱子中，加入透析液，完全进入柱体后，加入缓冲液洗脱，冷冻干燥，即得小分子量蚕蛹胶原蛋白，该胶原蛋白营养丰富，能提高淋巴细胞活性，通过淋巴系统提高机体免疫功能，增强机体的防病、抗病能力，还能清除生物体内的自由基及促进机体血细胞再生，并且具有显著的抗肿瘤活性。
作为优选，脱脂步骤中脱脂剂为正己烷和柠檬烯的混合物，其比例为100:2.2-2.7，柠檬烯中左旋柠檬烯和右旋柠檬烯的重量比为1:0.3-0.4，该脱脂剂的脱脂效果好，能使得蚕蛹中的油脂迅速向外部表面扩散，在较短时间内快速溶出到脱脂剂中，脱脂效率高，不需要重复脱脂即可达到目的，而柠檬烯的加入能提高蚕蛹油在脱脂溶剂中的饱和度，进而减少脱脂剂的用量，而左旋柠檬烯和右旋柠檬烯的合理比例可保证胶原蛋白的结构不易变形，进而保证其活性不被破坏。
作为优选，酶解步骤中磷酸缓冲液中含有0.03-0.05%柠檬酸钠和0.01-0.02%苯甲酸钠，柠檬酸钠和苯甲酸钠的加入一方面能够协同磷酸缓冲液温度酶解体系的ph，能够使得酶与蚕蛹复合物快速分解，快速释放出胶原蛋白和酶，保证酶分子活性部位上相关基团的稳定性，提高反应体系的反应速率，另一方面可使更多的酶深入到蚕蛹蛋白内部促进蛋白质的水解，提高蚕蛹蛋白的水解度，且使获得的胶原蛋白的分子量较为集中，利于胶原蛋白的吸收利用。
作为优选，纯化步骤中层析柱规格为直径2-3cm，长48-52cm，缓冲液选用ph为6.5-7、浓度为0.008-0.012m的磷酸盐缓冲液和0.1-0.12m的kcl缓冲液，流速为0.6-0.8ml/min。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1）本发明小分子量蚕蛹胶原蛋白的纯度高、活性高、分子量较为集中，其制备方法简单可行、脱脂效率高、得率高，易于工业化生产，安全性更高，大大提高蚕蛹附加值；
2）该制备放大得到的胶原蛋白松散且多孔，有规则均匀的蜂窝状多孔，这种网状多孔结构适合于做药物载体，不仅有利于药物的均匀分布，还有利于液体的挥发；
3）本发明用脱脂剂的脱脂效果好，脱脂效率高，不需要重复脱脂即可达到目的，且脱脂剂的用量少，可保证胶原蛋白的结构不易变形，进而保证其活性不被破坏；
4）本发明用磷酸缓冲液能够使得酶与蚕蛹复合物快速分解，快速释放出胶原蛋白和酶，保证酶分子活性部位上相关基团的稳定性，提高反应体系的反应速率，同时可使更多的酶深入到蚕蛹蛋白内部促进蛋白质的水解，且使获得的胶原蛋白的分子量较为集中。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种小分子量蚕蛹胶原蛋白，其分子量为600-1000da，该胶原蛋白营养丰富，蚕蛹蛋白氨基酸比例优良，能提高淋巴细胞活性，通过淋巴系统提高机体免疫功能，增强机体的防病、抗病能力，还能清除生物体内的自由基及促进机体血细胞再生，并且具有显著的抗肿瘤活性，可作为营养添加剂用于面包、面条、饼干、调味品或高蛋白饮料中。
一种小分子量蚕蛹胶原蛋白的制备方法，其具体包括以下步骤：
1）脱脂：按料液比为1:6（g/ml）向蚕蛹粉中加入脱脂剂，然后在35℃下脱脂30min，冷却后抽滤，滤渣即为脱脂蚕蛹，然后在50℃下烘干，备用，该脱脂步骤具有脱脂率高、溶剂无残留、无毒不易燃、蛋白质不变形等优点，同时脱脂剂容易回收，能够降低脱脂成本；
2）酶解：按料液比为1:30（g/ml）向脱脂蚕蛹中加入ph为7.5的磷酸缓冲液，再加入脱脂蚕蛹重量4%的中性蛋白酶，在45℃下酶解2h，然后将温度升至90℃，保温20min进行灭酶，冷却后在温度为1℃、转速为10000rpm的离心机中离心8min，上清液即为粗蛋白液，酶法水解安全性更高，在温和条件下进行定位水解，水解过程也比较容易控制，胶原蛋白主要为酶溶性的，用蛋白酶将胶原蛋白分子的非螺旋区域切断后，胶原的三螺旋主区域很容易溶于提取液中，并且蛋白酶不会对胶原蛋白的三螺旋结构产生影响，其提取量很大，且其结构和酸法提取的胶原蛋白结构一样，该胶原蛋白松散且多孔，有规则均匀的蜂窝状多孔，这种网状多孔结构适合于做药物载体，不仅有利于药物的均匀分布，还有利于液体的挥发；
3）盐析：向粗蛋白液中加入浓度为2.2wt%的壳聚糖溶液，粗蛋白液与壳聚糖溶液的重量体积比为1:4，调节ph至7，搅拌20min，在温度为1℃、转速为10000rpm的离心机中离心8min，将上清液放入冰水浴中，加入硫酸铵使其浓度为55wt%，搅拌至硫酸铵完全溶解，静置过夜，然后在温度为1℃、转速为10000rpm的离心机中离心8min，沉淀物即为盐析沉淀物，该步骤中加入大量的硫酸铵，使蛋白质得溶解度降低而沉淀析出，该方法优点在于硫酸铵浓度变化具有连续性，盐析效果好，节约能耗；
4）透析：将盐析沉淀物溶解于磷酸盐缓冲液，然后装入透析袋，排除气泡，封口，置于磷酸盐缓冲液中透析，更换缓冲液4次，即得透析液，该方法利用小分子物质在溶液中可通过透析袋，而大分子物质不能通过透析袋的性质，达到分离小分子杂质的目的，操作简单，效果好，节约能耗；
5）纯化：将用缓冲液浸泡12h的羟基磷灰石装入含有预加缓冲液和的柱子中，加入透析液，完全进入柱体后，加入缓冲液洗脱，冷冻干燥，即得小分子量蚕蛹胶原蛋白，该胶原蛋白营养丰富，能提高淋巴细胞活性，通过淋巴系统提高机体免疫功能，增强机体的防病、抗病能力，还能清除生物体内的自由基及促进机体血细胞再生，并且具有显著的抗肿瘤活性。
步骤1中脱脂剂为正己烷和柠檬烯的混合物，其比例为100:2.2，柠檬烯中左旋柠檬烯和右旋柠檬烯的重量比为1:0.4，该脱脂剂的脱脂效果好，能使得蚕蛹中的油脂迅速向外部表面扩散，在较短时间内快速溶出到脱脂剂中，脱脂效率高，不需要重复脱脂即可达到目的，而柠檬烯的加入能提高蚕蛹油在脱脂溶剂中的饱和度，进而减少脱脂剂的用量，而左旋柠檬烯和右旋柠檬烯的合理比例可保证胶原蛋白的结构不易变形，进而保证其活性不被破坏。
步骤2中磷酸缓冲液中含有0.03%柠檬酸钠和0.02%苯甲酸钠，柠檬酸钠和苯甲酸钠的加入一方面能够协同磷酸缓冲液温度酶解体系的ph，能够使得酶与蚕蛹复合物快速分解，快速释放出胶原蛋白和酶，保证酶分子活性部位上相关基团的稳定性，提高反应体系的反应速率，另一方面可使更多的酶深入到蚕蛹蛋白内部促进蛋白质的水解，提高蚕蛹蛋白的水解度，且使获得的胶原蛋白的分子量较为集中，利于胶原蛋白的吸收利用。
步骤5中层析柱规格为直径2cm，长52cm，缓冲液选用ph为6.5、浓度为0.012m的磷酸盐缓冲液和0.1的kcl缓冲液，流速为0.8ml/min。
实施例2：
一种小分子量蚕蛹胶原蛋白，其分子量为600-1000da。
一种小分子量蚕蛹胶原蛋白的制备方法，其具体包括以下步骤：
1）脱脂：按料液比为1:4（g/ml）向蚕蛹粉中加入脱脂剂，然后在45℃下脱脂20min，冷却后抽滤，滤渣即为脱脂蚕蛹，然后在70℃下烘干，备用；
2）酶解：按料液比为1:20（g/ml）向脱脂蚕蛹中加入ph为8.5的磷酸缓冲液，再加入脱脂蚕蛹重量2%的中性蛋白酶，在55℃下酶解1h，然后将温度升至100℃，保温10min进行灭酶，冷却后在温度为5℃、转速为8000rpm的离心机中离心10min，上清液即为粗蛋白液；
3）盐析：向粗蛋白液中加入浓度为1.8wt%的壳聚糖溶液，粗蛋白液与壳聚糖溶液的重量体积比为1:6，调节ph至6.5，搅拌25min，在温度为5℃、转速为8000rpm的离心机中离心10min，将上清液放入冰水浴中，加入硫酸铵使其浓度为50wt%，搅拌至硫酸铵完全溶解，静置过夜，然后在温度为5℃、转速为8000rpm的离心机中离心10min，沉淀物即为盐析沉淀物；
4）透析：将盐析沉淀物溶解于磷酸盐缓冲液，然后装入透析袋，排除气泡，封口，置于磷酸盐缓冲液中透析，更换缓冲液6次，即得透析液；
5）纯化：将用缓冲液浸泡10h的羟基磷灰石装入含有预加缓冲液和的柱子中，加入透析液，完全进入柱体后，加入缓冲液洗脱，冷冻干燥，即得小分子量蚕蛹胶原蛋白。
步骤1中脱脂剂为正己烷和柠檬烯的混合物，其比例为100:2.7，柠檬烯中左旋柠檬烯和右旋柠檬烯的重量比为1:0.3。
步骤2中磷酸缓冲液中含有0.05%柠檬酸钠和0.01%苯甲酸钠。
步骤5中层析柱规格为直径3cm，长48cm，缓冲液选用ph为7、浓度为0.008m的磷酸盐缓冲液和0.12m的kcl缓冲液，流速为0.6ml/min。
实施例3：
一种小分子量蚕蛹胶原蛋白，其分子量为600-1000da。
一种小分子量蚕蛹胶原蛋白的制备方法，其具体包括以下步骤：
1）脱脂：按料液比为1:5（g/ml）向蚕蛹粉中加入脱脂剂，然后在40℃下脱脂25min，冷却后抽滤，滤渣即为脱脂蚕蛹，然后在60℃下烘干，备用；
2）酶解：按料液比为1:25（g/ml）向脱脂蚕蛹中加入ph为8.0的磷酸缓冲液，再加入脱脂蚕蛹重量3%的中性蛋白酶，在50℃下酶解1.5h，然后将温度升至95℃，保温15min进行灭酶，冷却后在温度为2℃、转速为9000rpm的离心机中离心9min，上清液即为粗蛋白液；
3）盐析：向粗蛋白液中加入浓度为2.0wt%的壳聚糖溶液，粗蛋白液与壳聚糖溶液的重量体积比为1:5，调节ph至6.8，搅拌20-25min，在温度为2℃、转速为9000rpm的离心机中离心9min，将上清液放入冰水浴中，加入硫酸铵使其浓度为52wt%，搅拌至硫酸铵完全溶解，静置过夜，然后在温度为2℃、转速为9000rpm的离心机中离心9min，沉淀物即为盐析沉淀物；
4）透析：将盐析沉淀物溶解于磷酸盐缓冲液，然后装入透析袋，排除气泡，封口，置于磷酸盐缓冲液中透析，更换缓冲液5次，即得透析液；
5）纯化：将用缓冲液浸泡11h的羟基磷灰石装入含有预加缓冲液和的柱子中，加入透析液，完全进入柱体后，加入缓冲液洗脱，冷冻干燥，即得小分子量蚕蛹胶原蛋白。
步骤1中脱脂剂为正己烷和柠檬烯的混合物，其比例为100:2.5，柠檬烯中左旋柠檬烯和右旋柠檬烯的重量比为1:0.35。
步骤2中磷酸缓冲液中含有0.04%柠檬酸钠和0.015%苯甲酸钠。
步骤5中层析柱规格为直径2.5cm，长50cm，缓冲液选用ph为6.8、浓度为0.01m的磷酸盐缓冲液和0.11m的kcl缓冲液，流速为0.7ml/min。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。