本发明涉及一种单克隆抗体，尤其涉及一种流感病毒单克隆抗体其制备方法。
背景技术：
流感病毒是一种重要的季节性传染性疾病，历史上的几次大爆发给人类健康和经济造成了巨大的危害和损失。自流感病毒被发现以来，人们就致力于流感病毒的诊断和防控。甲型流感病毒具有高度变异、亚型众多等特点，给其防控带来一定的困难。快速、准确诊断流感可以为正确治疗和防控流感提供时间。准确诊断流感病毒是否感染的的胶体金试纸条，以及检测a型流病毒的抗原elisa试剂盒，都离不开性能稳定、抗原效价高的流感单抗，国内生物制药公司，就是因为没有好的单抗，所以不能生产好用的流感病毒诊断试剂。
m1由252个氨基酸残基组成，分子量约26kda,它是病毒的主要结构蛋白,
占流感病毒蛋白总量的30％～40％。该蛋白具有型特异性，其抗原性差异是流感病毒分型的依据之一。m1还是一种多功能因子,在病毒复制中具有重要的调节功能，如控制病毒的转录和被感染细胞的胞核胞浆之间的物质运输。
技术实现要素：
本发明提供了一种流感病毒单克隆抗体，及其制备方法。本发明通过基因合成、载体构建，表达纯化m1重组蛋白，以该重组蛋白为抗原，制备单克隆抗体细胞株，单克隆抗体腹水，再将单克隆抗体纯化，得到一种性能稳定、抗原效价高的流感病毒单克隆抗体。
本发明的一方面，提供了一种m1重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白序列为seqno.1。
进一步，所述蛋白制备方法为在m1基因中插入表达载体pet32a。
进一步，所述m1基因为seqno.2。
进一步，所述载体pet32a为seqno.3。
本发明的另一方面，提供了一种单克隆抗体，其特征在于，通过以下步骤制备：以m1重组蛋白作为抗原，免疫动物，再进行细胞融合及亚克隆，腹水制备及抗体纯化。
进一步，所述免疫动物在初次免疫后至少加强注射3次。
本发明的优势在于，用m1重组蛋白免疫的动物，对重组蛋白质反应度优于天然蛋白质，能够产生性能稳定、抗原效价高的流感单抗。
附图说明
图1：sds-page检测表达情况
具体实施方式
下面对本发明的实施例作进一步详细描述。
实施例1抗原制备
1.制备m1基因的蛋白质序列matrixprotein1[influenzaavirus(a/puertorico/8/1934(h1n1))]如seqno.1，编号为c0131-trx：
制备方法为在m1基因中插入表达载体，插入指定载体:pet32a
m1基因序列如seqno.2：
阳性克隆鉴定：经测序验证，合成序列正确。
2.小样表达。挑选转化平板6个单克隆，分别接种3ml抗性培养基；培养至od600nm0.5-0.6，加入0.5mmiptg28℃诱导表达3.5小时；离心收集菌体，超声破碎，sds-page检测表达情况。小样表达结果分析：蛋白质在上清和包涵体中均有表达，可继续进行可溶性表达纯化。
3.大样表达。选择小样表达良好的菌株接种至抗性培养基；培养至od600nm0.5-0.6，加入0.5mmiptg28℃诱导表达3.5小时；离心收集菌体，超声破碎，加入镍柱孵育，以0.5mimidazole洗脱，分管收集；合并收集峰，对pbs透析过夜；sds-page检测表达情况。
大样表达结果分析：目标蛋白质为可溶性上清表达，总量1mg，预计分子量43kda，在表达过程中有降解。
实施例2动物免疫
1动物
5-8周龄balb/c小鼠5只，分别免疫重组蛋白质c0131-trx和客户提供的病毒蛋白质混合物c0131-h9。
2佐剂
第一次主注射使用弗氏完全佐剂，以后加强注射使用弗氏不完全佐剂，均与等体积抗原充分混匀后注射。
3免疫方法。背部多点注射。主注射100ug抗原/只实验鼠，加强注射50ug抗原/只实验鼠。
免疫周期
4.抗血清检测。从小鼠尾静脉取少量血，制备抗血清。间接elisa方法检测抗血清效价。
反应条件：抗原包被：37度2h
封闭：37度1.5h
血清抗体孵育：37度1h
二抗：37度30min，1：10000
显色：37度10min
结果：用重组蛋白免疫的3只小鼠，对重组蛋白质反应度很好，对天然蛋白质反应不好；用天然蛋白质免疫的2只小鼠，对两种蛋白质反应度都很好。决定用m0131-4这只小鼠进行后续实验，并用重组蛋白质进行筛选。
实施例3细胞融合及亚克隆
1.骨髓瘤细胞制备
融合前一周，复苏sp2/0细胞，正常培养至对数期。
2.脾细胞制备
选定要融合的小鼠，融合当天用颈椎脱臼法处死，取脾，标准流程收集脾细胞并计数。
3.细胞融合
按1:3-1：10的比例混合骨髓瘤细胞和脾细胞，标准流程进行细胞融合操作，随后用hatdmem完全培养基培养，融合后3天即可以看到杂交瘤细胞，第7天换1/2hat完全培养基，第8天换1/2ht培养基。融合后10天左右开始进行筛选检测。
细胞融合结果：融合后用hat选择性培养基培养，显微镜下观察，看到多个生长的杂交瘤细胞，证明融合操作成功。
4.融合筛选
吸取细胞上清100ul/孔进行间接elisa检测。根据elisa结果，判断阳性孔。用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次复检，进一步确认阳性孔。
5.亚克隆
对复筛的阳性孔细胞做两轮亚克隆。(因为第一次亚克隆得到的阳性孔细胞株尚不稳定，有可能包含多个杂交瘤细胞，普遍认为第二次亚克隆后杂交瘤细胞为单个细胞株，并确定为阳性)。
第一次亚克隆有限稀释阳性孔中细胞，至多个孔中，加htdmem培养基培养，7天左右在显微镜下观察，间接elisa检测有克隆生长的孔，取od值高的孔为阳性孔；挑取阳性孔的细胞进行第二次亚克隆，检测出稳定阳性的杂交瘤细胞株，作为最终制备单抗的细胞，并扩大培养。
6.单克隆抗体亚型鉴定
用美国southernbiotech的单抗亚型鉴定试剂盒分别测各个上清的亚型。准备好包被有免疫原蛋白的板条，50ng/孔，每个克隆收集600ul上清，分别滴加到6个对应蛋白的酶标孔中，100ul/孔。37°孵育1h,pbst洗三遍，将稀释好的分型二抗抗igm，iga，igg1，igg2a，igg2b，igg3的抗体加入6个孔中，37°孵育1h,pbst洗三遍，tmb显色。有信号反应的孔对应的鉴定二抗亚型即为该抗体的亚型。
7.经过两轮亚克隆及复检，确定以下阳性细胞株及亚型。
8.最后确定的阳性细胞株号及亚型，确认阳性细胞株。
实施例4腹水制备及抗体纯化
1腹水制备
将上述阳性细胞扩大培养并注射至balb/c小鼠(经弗氏不完全佐剂至敏)的腹腔，一般7-10日可见小鼠腹部隆起即代表有腹水产生。当小鼠有明显腹水产生时及时抽取腹水。
2腹水纯化。将上述细胞的腹水，进行纯化，纯化后抗体纯度大于90％。纯化方法如下：辛酸硫酸铵+deae离子柱法纯化(igg1,igg2a,igg2b,igg3亚型抗体)，腹水离心，吸出淡黄色液体计算体积，用4倍体积的60mm醋酸缓冲液(ph4.0)1:3稀释，逐滴加入辛酸(终浓度为25μl/ml稀释腹水)，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。10000r/min，4℃，20min，收集上清，加入1/10体积的10*pbs(0.1mph7.4)。根据每ml上述混合液加0.277g固体硫酸铵(0℃条件下，45％饱和硫酸铵为0.291g/ml)，继续静置至少60min以上。10000r/min，4℃，20min，弃上清，将沉淀溶解于少量pbs中。对pbs透析，4℃透析过夜。检测浓度纯度后，调整浓度至2mg/ml。
以上所述，仅为本发明专利较佳的实施例，但本发明专利的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明专利所公开的范围内，根据本发明专利的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都属于本发明专利的保护范围。
序列表
<110>山东省农业科学院畜牧兽医研究所
<120>一种单克隆抗体及其制备方法
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
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