本发明属于生物技术领域，具体提供一种从脂肪组织中分离、纯化脂肪干细胞的方法。
背景技术：
脂肪干细胞（adipose-derivedstemcells，adscs）是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。脂肪干细胞可以分化成多胚层细胞，包括中胚层，内胚层和外胚层细胞，并且能分泌许多对人体组织有利的细胞因子。脂肪干细胞是一群多功能间充质干细胞，可以分化为其他的细胞系，在脂肪组织的非脂肪(间质)碎片中存在大量的脂肪干细胞，且易于分离获取。脂肪干细胞可以恢复组织细胞的修复功能，促进细胞的再生，恢复年轻面容；同时也能使身体机能得到充分改善，可以有效改善亚健康、早衰等疾病，由内而外真正的有效抵抗衰老。
大量的研究证实adscs具有其它类型间充质干细胞如骨髓间充质干细胞所没有的一些优势：脂肪组织来源广泛，取材方便，干细胞获取量大，容易分离纯化，脂肪组织供区损伤微小，分化能力强。因而，脂肪干细胞是一种很好的组织工程和再生医学种子细胞。
脂肪干细胞已经在临床上开始应用并且效果显著，目前在医疗美容、免疫力提升等方面应用较为广泛，并且在心血管疾病、糖尿病、神经性疾病、消化道疾病、生殖系统疾病等危害人类生命与健康的重大疾病方面均已开展多项临床研究。
综上所述，脂肪干细胞在应用优势、存在优势、现实应用、潜力开发等方面都有非常突出的优势，所以被称之为“明星干细胞”。目前，脂肪干细胞类的产品制备工艺复杂、生物学活性受各种外界条件限制，保存起来不方便。
目前现行的最接近的技术方案：中国专利cn104560868a公开了一种脂肪干细胞的原代分离培养方法，其中涉及了用i型胶原酶和胰蛋白酶的混合液体消化脂肪组织；用含有egf和fbs的dmem来培养脂肪干细胞。
目前技术缺陷：现有技术方法中，仍多采用机械法去除血管、单一酶消化法、使用裂解液裂解红细胞、等步骤，尽可能的获得纯度较高的adscs的细胞群；在培养时添加青-链霉素等抗生素，虽然能防止污染，但也对细胞造成不同程度的伤害且在使用上存在一定争议。脂肪干细胞的分离培养过程操作复杂、耗时长、生产成本较高。除此之外，由于使用了较多的化学试剂，adscs在分离后活力较低、增殖速度较慢。使用品种单一的消化酶对脂肪组织进行消化，消化不彻底导致脂肪干细胞分离效率低。总的来说，adscs的分离和培养方法都有较大的改善空间。
本发明既可以有效降低成本又可以快速获得优质的脂肪干细胞，减少对细胞的伤害，缩短了培养周期，减少污染，而且能够提高细胞纯度。
技术实现要素：
本发明提供一种从脂肪组织中分离脂肪干细胞并进行传代培养，最终获得细胞产品的方法，要解决脂肪干细胞分离、培养过程中可能出现的分离效率低、周期长、安全性不足等问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
在脂肪组织获得、脂肪组织运输、脂肪组织制备和细胞培养过程中采取检测排查、添加抗生素等方法保证获得无污染的脂肪干细胞从而保障安全性，在分离、培养过程中采用改良的消化方法、培养体系和培养方法提高分离效率，缩短培养周期并能获得高纯度、表征优良的细胞。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种从脂肪组织中分离、纯化脂肪干细胞的方法，包括脂肪干细胞制备、脂肪间充质干细胞的传代培养、细胞收获。
所述的脂肪干细胞制备为：
（1）脂肪组织转移至50ml离心管，每管40ml，800g，8分钟；
（2）离心后的脂肪组织转移至新的离心管中，等体积加入0.9%生理盐水，800g8分钟；
（3）弃掉上清，重复步骤2洗涤脂肪组织两次；
（4）等体积向脂肪沉淀中加消化液，充分混匀封口后放入37℃摇床，150rpm，30-50min；
（5）取出消化好的脂肪组织，离心，800g，10分钟；
（6）弃掉上层脂肪，用dmem/f12培养基重悬离心后的细胞沉淀，离心，800g10分钟；重复步骤6洗涤细胞沉淀；
（7）弃掉离心后的上清，dmem/f12培养基重悬细胞沉淀并混匀，先用40um滤网过滤细胞；过滤后的细胞离心，800g10分钟，弃上清；
（8）1.0mldmem/f12培养基重悬细胞沉淀，混匀后加入4.0ml预冷的0.3%nacl溶液，室温放置10分钟，裂解红细胞；
（9）离心，400g5分钟，弃掉上清；
（10）用msc无血清培养基重悬细胞沉淀，台盼蓝染色细胞计数，调整细胞密度为2.0*10^6/ml，每个培养瓶先加14ml培养基，再加1.0ml细胞悬液，混匀；24小时后细胞换液，去除未贴壁细胞，以后每三天换液一次；培养至第五天后，细胞生长密度达到90%，脂肪间充质干细胞传代培养。
所述消化液中含0.075~0.5wt.%i型胶原酶+0.1wt.%iv型胶原酶+0.1wt.%胰蛋白酶。
msc无血清培养基为msc无血清培养基+5ng/mlegf+5ng/mlfgf+5ng/mlifn-γ+5ng/mltnf-α+1wt.%l-glutamax。
所述的脂肪间充质干细胞的传代培养为：
（1）取出准备传代的脂肪间充质干细胞细胞，吸掉培养基；
（2）每个培养瓶加0.25%胰酶1.0ml消化细胞，显微镜下发现细胞变圆立即加入5.0ml终止液终止消化，将细胞轻柔吹吸后转移至50ml离心管中，并用生理盐水20.0ml洗底培养瓶一次，将洗涤的细胞转移至离心管中，800g6分钟；
（3）吸弃上清，用无血清培养基重悬细胞沉淀，台盼蓝染色细胞计数，调整细胞密度为4.0*10^5/ml，每个培养瓶先加23.0ml无血清培养基，再加2.0ml细胞悬液，混匀后放置于培养箱中静止培养。
所述细胞收获为：
1）观察细胞，细胞生长至80~90%时进行收获冻存或者供给使用；
2）将细胞培养瓶取出，用75%酒精消毒瓶底，放入生物安全柜内；
3）用移液管吸弃旧培养基；
4）每瓶加入3ml0.25%胰酶，37℃消化1min，当细胞明显回缩后，加入终止液10ml/瓶，终止消化，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中；
5）1200rpm离心6min，弃上清，细胞沉淀用16ml生理盐水悬浮，混匀取1ml做计数和流式检测；
6）加生理盐水至40ml，取500μl上清做内毒素检测，1200rpm，离心6min；
7）将上清倒入洁净的离心管中，做菌检和支原体检测；
8）冻存的细胞：离心沉淀用2.5mlfbs悬浮，再缓慢加入2.5ml冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml；
应用的细胞：离心沉淀用0.9%生理盐水溶液重悬，细胞数量及体积根据使用情况而定；重悬后的细胞悬液转移至细胞回输袋或者回输管中；
9）标记细胞代数、密度、条形码和操作时间于管壁外；
10）冻存的细胞按程序降温盒法进行冻存，应用的细胞通过冷链运输至应用地点。
本发明的优点在于：
1、消化液为0.075%~0.5%i型胶原酶+0.1%iv型胶原酶+0.1%胰蛋白酶的混合酶液，可以有效提高酶解效率，缩短制备时间。
2、用0.3%nacl溶液裂解红细胞，可以获得纯度更高的脂肪干细胞。
3、在培养基中加入5ng/mlegf+5ng/mlfgf+5ng/mlifn-γ+5ng/mltnf-α+1%l-glutamax,这些因子同时加入培养体系中可以有效促进msc的增殖，从而有效缩短培养时间。
4.细胞收获时进行计数、流式检测、内毒素检测、支原体检测、细菌培养检测等，只有各项检测均合格才准予入库储存或者供给客户使用，从细胞数量、细胞表征和有无微生物污染等多方面保证了细胞产品的有效性和安全性。
在脂肪获得、脂肪制备和细胞培养过程中采取检测排查等方法保证获得无污染的脂肪干细胞从而保障安全性，在分离、培养过程中采用改良的分离方法和培养体系提高分离效率，缩短培养周期并能获得高纯度、表征优良的细胞。
附图说明
图1.脂肪干细胞铺瓶2天之后的细胞状态图：细胞大多呈圆形，少数细胞呈梭形，细胞数量还较少。
图2.脂肪干细胞铺瓶5天之后的细胞状态图：细胞数量明显增多，且呈现经典的间充质干细胞形态。
图3.脂肪干细胞p0传p1第3天的细胞状态图：细胞生长均匀、形态标准，数量较多。
图4.脂肪干细胞流式检测结果图。从流式检测结果中，可以看出本方案分离的细胞表型符合脂肪干细胞的特征（cd44/cd105为阳性，cd34/cd45为阴性）。
具体实施方式
实施例1
1、脂肪干细胞制备
（1）传染病检测合格的客户通过吸脂手术留取脂肪标本，低温保存尽快运到实验室。
（2）脂肪组织转移至50ml离心管，每管40ml，800g，8分钟。
（3）离心后的脂肪组织转移至新的离心管中，等体积加入0.9%生理盐水，800g，8分钟。
（4）弃掉上清，重复步骤3洗涤脂肪组织两次。
（5）等体积向脂肪沉淀中加消化液（0.5%i型胶原酶+0.1%iv型胶原酶+0.1%胰蛋白酶），充分混匀封口后放入37℃摇床，150rpm，30min。
（6）取出消化好的脂肪组织，离心，800g，10分钟。
（7）弃掉上层脂肪，用dmem/f12基础培养基重悬离心后的细胞沉淀，离心，800g，10分钟。
（8）重复步骤7洗涤细胞沉淀。
（9）弃掉离心后的上清，dmem/f12重悬细胞沉淀并混匀，先用40um滤网过滤细胞。
（10）过滤后的细胞离心，800g，10分钟。弃上清。
（11）1.0mldmem/f12培养基重悬细胞沉淀，混匀后加入4.0ml预冷的0.3%nacl溶液，室温放置10分钟，裂解红细胞。
（12）离心，400g5分钟。弃掉上清。
（13）用msc无血清培养基（msc无血清基础培养基+5ng/mlegf+5ng/mlfgf+5ng/mlifn-γ+5ng/mltnf-α+1%l-glutamax）重悬细胞沉淀，台盼兰染色细胞计数，调整细胞密度为2.0*10^6/ml。每个t75培养瓶先加14ml培养基，再加1.0ml细胞悬液，混匀。
（14）24小时后细胞换液，去除未贴壁细胞。以后每三天换液一次。
（15）培养至第五天左右，细胞生长密度达到90%左右，脂肪间充质干细胞传代培养。
、脂肪间充质干细胞的传代培养
（16）取出准备传代的脂肪间充质干细胞细胞，吸掉培养基。
（17）每个t75培养瓶加0.25%胰酶1.0ml消化细胞，显微镜下发现细胞变圆立即加入5.0ml终止液终止消化，将细胞轻柔吹吸后转移至50ml离心管中，并用生理盐水20.0ml洗底培养瓶一次，将洗涤的细胞转移至离心管中，800g，6分钟。
（18）吸弃上清，用无血清培养基重悬细胞沉淀，台盼兰染色细胞计数，调整细胞密度为4.0*10^5/ml，每个t175培养瓶先加23.0ml培养基，再加2.0ml细胞悬液，混匀后放置于培养箱中静止培养。
、细胞收获：
1）观察细胞，细胞生长至90%时进行收获冻存或者供给客户使用。
2）将细胞培养瓶取出，用75%酒精消毒瓶底，放入生物安全柜内。
3）用移液管吸弃旧培养基。
4）每瓶加入3ml0.25%胰酶，37℃消化1min，当细胞明显回缩后，加入终止液10ml/瓶，终止消化，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中。
5）1200rpm离心6min，弃上清，细胞沉淀用16ml生理盐水悬浮，混匀取1ml做计数和流式检测。
6）加生理盐水至40ml，取500μl上清做内毒素检测，1200rpm，离心6min。
7）将上清倒入洁净的离心管中，做菌检和支原体检测.
8）冻存的细胞：离心沉淀用2.5mlfbs悬浮，再缓慢加入2.5ml冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml。
应用的细胞：离心沉淀用0.9%生理盐水溶液重悬，细胞数量及体积根据客户使用情况而定。重悬后的细胞悬液转移至细胞回输袋或者回输管中。
9）标记细胞代数、密度、条形码和操作时间于管壁外。
10）冻存的细胞按程序降温盒法进行冻存，应用的细胞通过冷链运输至应用地点。
实施例2
1、脂肪干细胞制备
（19）传染病检测合格的客户通过吸脂手术留取脂肪标本，低温保存尽快运到实验室。
（20）脂肪组织转移至50ml离心管，每管40ml，800g，8分钟。
（21）离心后的脂肪组织转移至新的离心管中，等体积加入0.9%生理盐水，800g，8分钟。
（22）弃掉上清，重复步骤3洗涤脂肪组织两次。
（23）等体积向脂肪沉淀中加消化液（0.1%i型胶原酶+0.1%iv型胶原酶+0.1%胰蛋白酶），充分混匀封口后放入37℃摇床，150rpm，40min。
（24）取出消化好的脂肪组织，离心，800g，10分钟。
（25）弃掉上层脂肪，用dmem/f12基础培养基重悬离心后的细胞沉淀，离心，800g，10分钟。
（26）重复步骤7洗涤细胞沉淀。
（27）弃掉离心后的上清，dmem/f12重悬细胞沉淀并混匀，先用40um滤网过滤细胞。
（28）过滤后的细胞离心，800g，10分钟。弃上清。
（29）1.0mldmem/f12培养基重悬细胞沉淀，混匀后加入4.0ml预冷的0.3%nacl溶液，室温放置10分钟，裂解红细胞。
（30）离心，400g5分钟。弃掉上清。
（31）用msc无血清培养基（msc无血清基础培养基+5ng/mlegf+5ng/mlfgf+5ng/mlifn-γ+5ng/mltnf-α+1%l-glutamax）重悬细胞沉淀，台盼兰染色细胞计数，调整细胞密度为2.0*10^6/ml。每个t75培养瓶先加14ml培养基，再加1.0ml细胞悬液，混匀。
（32）24小时后细胞换液，去除未贴壁细胞。以后每三天换液一次。
（33）培养至第五天左右，细胞生长密度达到90%左右，脂肪间充质干细胞传代培养。
、脂肪间充质干细胞的传代培养
（34）取出准备传代的脂肪间充质干细胞细胞，吸掉培养基。
（35）每个t75培养瓶加0.25%胰酶1.0ml消化细胞，显微镜下发现细胞变圆立即加入5.0ml终止液终止消化，将细胞轻柔吹吸后转移至50ml离心管中，并用生理盐水20.0ml洗底培养瓶一次，将洗涤的细胞转移至离心管中，800g，6分钟。
（36）吸弃上清，用无血清培养基重悬细胞沉淀，台盼兰染色细胞计数，调整细胞密度为4.0*10^5/ml，每个t175培养瓶先加23.0ml培养基，再加2.0ml细胞悬液，混匀后放置于培养箱中静止培养。
、细胞收获：
1）观察细胞，细胞生长至80%时进行收获冻存或者供给客户使用。
2）将细胞培养瓶取出，用75%酒精消毒瓶底，放入生物安全柜内。
3）用移液管吸弃旧培养基。
4）每瓶加入3ml0.25%胰酶，37℃消化1min，当细胞明显回缩后，加入终止液10ml/瓶，终止消化，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中。
5）1200rpm离心6min，弃上清，细胞沉淀用16ml生理盐水悬浮，混匀取1ml做计数和流式检测。
6）加生理盐水至40ml，取500μl上清做内毒素检测，1200rpm，离心6min。
7）将上清倒入洁净的离心管中，做菌检和支原体检测.
8）冻存的细胞：离心沉淀用2.5mlfbs悬浮，再缓慢加入2.5ml冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml。
应用的细胞：离心沉淀用0.9%生理盐水溶液重悬，细胞数量及体积根据客户使用情况而定。重悬后的细胞悬液转移至细胞回输袋或者回输管中。
9）标记细胞代数、密度、条形码和操作时间于管壁外。
10）冻存的细胞按程序降温盒法进行冻存，应用的细胞通过冷链运输至应用地点。
对照例1
其余条件相同，采用0.05％的ⅰ型胶原酶+0.1%胰蛋白酶替代实施例1和实施2中的消化液，消化时间为40min；培养基为含有10％fbs的高糖dmem培养基。
实施例1、实施例2及对照例1各分离培养了三个不同样本，通过以下2个方面进行本发明的结果检测和对比。
1.不同消化液的酶解效率比较：
采用不同配方的消化液对人脂肪干细胞进行消化，结果如下：实施例1、实施例2及对照例1每100ml脂肪组织收获的平均活细胞数量分别如下：3.25*107个，3.20*107个,2.50*107个。如表1所示，实施例1和实施例2与对照例1的消化所得活细胞数量存在极显著差异。通过这些数据可以看出，本发明的消化液配方相对其他可明显提高酶解效率，细胞得率较高。
发明所探索的酶解条件稳定、高效，脂肪组织被彻底消化，组织内的细胞被尽可能释放出来；i型胶原酶溶度较小时（实施例2）需要适当延长消化时间，但是消化效果不受影响。
2.不同培养基培养的贴壁细胞数及培养周期比较：
采用不同配方的培养基对人脂肪干细胞进行培养，对p0代细胞进行计数，结果如下：实施例1、实施例2及对照例1培养的平均细胞数分别为：2.50*106个，2.45*106个，1.58*106个。采用不同配方的培养基培养脂肪干细胞，最终均收获2.50*107个细胞，统计所需的培养时间，实施例1、实施例2及对照例1的总平均培养时间分别为：14天，14天，20天。如表1所示，实施例1和实施例2与对照例1的p0代收获细胞数及培养天数存在极显著差异。
表1
结果表明，本发明在分离、培养过程中采用改良的培养体系和培养方法能提高分离效率，缩短培养周期并能获得高纯度、表征优良的细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。