本发明属于胶原纤维的提取和应用技术领域。具体地，本发明涉及一种胶原纤维的提取方法，和胶原纤维在制造软、硬组织填充剂上的应用。该方法的制作过程中，是在偏光显微镜的监控下进行的。
背景技术：
目前，组织填充剂分为软组织填充剂和硬组织填充剂。作为软组织填充剂的动物来源注射性胶原已经在临床应用多年，而作为硬组织填充剂一般很难从胶原提取液中制取。
胶原纤维比较硬，有较高的张力，由三条α构型的多肽链组成；每条链含1052个氨基酸残基，其中甘氨酸占三分之一，脯氨酸和羟脯氨酸各占四分之一，每隔二个氨基酸有一个甘氨酸，甘氨酸与脯氨酸、羟脯氨酸或其他氨基酸组成三氨基酸联合体。多肽链的n末端和c末端均无三氨基酸联合体。胶原交联是指胶原分子内部和胶原分子间的结构关系，为纤维成熟提供更多的张力和稳定性，交联在组织成熟过程中进行，在酶的作用下赖氨酰或羟脯氨酰转变为相应的醛，然后与醛亚氨或羟基形成schiff碱或醛亚氨型化合物，这种反应自发产生。
胶原是一种具有刚性的纤维蛋白，一般的蛋白酶很难将其降解，其生理性转化也远远低于其它蛋白质。胶原半衰期较长，常以月或年计算，但当组织迅速进行重建时，胶原的降解或蜕变相对地要快些，其半衰期则以天或小时计算。异种或同种胶原移植最关键的问题是材料的抗原性问题，从分子水平已经证实，可溶性胶原是一种弱抗原性材料。当提取胶原时这两个区域被选择性地水解或去除而失活，仅在分子体的三股螺旋结构内部保留微弱的抗原性，且不足以引起明显的排斥反应，从而大大降低了胶原的抗原性，对大多数病人来说与胶原的生物性接触对人体无害。
胶原分为可溶性胶原和不溶性胶原。不溶性的定义是相对的，其不溶的原因与细胞间质成分的相互作用有关，另外随着年龄的增长，胶原分子间及其它分子间也会形成架桥─交联。这些不溶性胶原分子与其他非胶原成分混在一起，给从组织中提取胶原造成了一定困难。人胎儿皮肤中可溶性胶原提取率有5％，进入少年期后提取率只有1％。在一定条件下反复抽提和加入抑制剂抑制胶原纤维的形成，可以使小牛皮肤胶原有50％变成可溶性胶原。
目前，提取胶原的方法通常是：将新生小牛皮肤或人胎盘组织去脂，切碎酸溶，酶解，酸提，高速离心，重复上述酸提离心步骤，盐析透析，交联重组，消毒，沉淀冷冻干燥。原材料、产物的检查方法比较多，其中形态的检查方法一般均用电子显微镜，观察其超微结构；用光学显微镜观察特殊染色组织切片法，由于原材料和产物混杂有非胶原物质，因此特异性不高，成分的检测法多用高压液相，红外线吸收光谱等，也由于其他物质的混杂，需提纯等操作步骤。本发明根据结晶光学原理用偏光显微镜观察原材料和产物(包括中间产物的生成)，既可以确定成分(胶原)，又可以观察到结构(原材料、中间产物、最终产品)。
胶原分子本应当是无光性物质(非晶体)，但是直径为1.5μm，长为280μm的胶原分子，两者差距悬殊，故有弱光性(一级灰)，在插入一个λ(一级红)，同时旋转物台，可以观察到胶原纤维由兰(干涉色升高)至黄(转90度，干涉色降低)的过程，由此可以观察到胶原的编制结构。(图1、图2)。因此可以认为胶原、生物丝等是生物体内的“晶体”。
现有胶原提取方法的提取物是ⅰ型可溶性胶原，由于动物材料来源局限性强，提取过程复杂，需要添加交联剂，产物粘滞度大，提取率不高，所以临床应用很受限制。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的第一个目的在于提出一种胶原纤维的提取方法，方法简单易行，产物稳定，该方法获得的胶原纤维可以在临床上得到广泛应用。
本发明的第二个目的在于提出胶原纤维在制造组织填充剂上的应用。
为解决上述技术问题，本发明的第一个目的采用以下技术方案予以实现：
一种胶原纤维的提取方法，其是在偏光显微镜进行监控的情况下完成，所述提取方法包括下述步骤：
s1、选择健康动物的胶原纤维量多的组织作为原料，常温下用当量浓度为1～3n的酸溶液(盐酸或醋酸)浸泡24～120小时，以破坏细胞的结构并溶解细胞外可溶性成分；
s2、将待用的已软化原料取出，水清洗除酸，浸泡于质量浓度为5～15％的胃、肠道的消化酶溶液中进行酶解处理10～20小时，酸处理、酶水解，时间、浓度均与原材料有关，故是否细胞均已被破坏，均要在偏光显微镜下监控；可以用切片刀切下一小片组织(厚度大致为100～200μm)，经脱水、透明等步骤，在偏光显微镜下观察，此时原材料已无细胞；
s3、将原料取出清洗，即获得无细胞胶原框架，然后将无细胞胶原框架切割成0.05～0.5cm大小的组织块；
s4、将组织块研磨成直径为10～50μm，长度为300～500μm的胶原纤维丝。
作为优选地，所述原料为皮肤组织、肌腱组织、软骨组织、骨组织中的一种或多种。
本发明中胶原纤维的提取方法完全不同于现有的可溶性胶原提取工艺。本发明的制取原料包括动物的皮肤、肌腱、软骨、骨等组织，产率可达80％以上。通过采用盐酸或醋酸破坏了细胞的结构和溶解了细胞外可溶性成分，酶促反应消除种属特异性，制取无细胞胶原框架，不需要添加交联剂，不需要高速离心、盐析、透析等步骤，获得的产物中无胶原分子的降解产物和可溶性胶原，因此不是高粘物质，提取量从传统的35mg/ml提高到400mg/ml，通常产品使用80～120mg/ml。
本发明的第二个目的采用以下技术方案予以实现：
一种胶原纤维在制造组织填充剂上的应用。
一种胶原纤维在制造软组织填充剂上的应用，所述应用包括如下步骤：将胶原纤维丝用生理盐水或磷酸缓冲溶液稀释成80～120mg/ml，装入注射器，封口，用co60照射灭菌。
一种胶原纤维在制造硬组织填充剂上的应用，所述应用包括如下步骤：将胶原纤维丝置入一定形状的模具内，加压成型，在40℃～90℃下干燥，用co60照射灭菌。
本发明所述的软组织和硬组织填充剂的制造方法是在上述胶原纤维丝的基础上进一步深化的结果。其所获得的软组织填充剂保存期长，产率高，产品稳定；硬组织填充剂填补了目前这一产品从动物组织直接获得的空白。
附图说明
图1为10000倍电镜下猪皮组织图：a、正常：见细胞核与细胞器；b、ecm：已无细胞核与细胞器电镜；
图2为100倍光镜下猪皮组织图：a、正常b、ecm：已无细胞，仅见胶原框架h.e；
图3：a为40倍偏光显微镜下猪皮呈密集的编织结构图；b为100倍偏光显微镜下动物正常皮肤呈密集的编织结构图；
图4：a为胶原纤维提取过程中胶原纤维丝交叉编织结构(中间产物)；b为胶原纤维丝生产的示意图。
具体实施方式
为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。
一、检查和监控的方法创新：
1、在结晶光学指导下，用偏光显微镜观察ⅰ型胶原纤维、软硬组织充填剂，以及监控可溶性胶原的生产过程。
1)、选择健康动物的胶原纤维量多的组织作为原料，常温下用当量浓度为1～3n酸溶液(盐酸或醋酸)浸泡24～120小时，以破坏细胞的结构并溶解细胞外可溶性成分；
2)、将待用的已软化原料取出，水清洗除酸，浸泡于胃、肠道的消化酶浓度为5～15％溶液中进行酶解处理10～20小时(有时可以加入1～2％的rna酶)，酸处理、酶水解，时间、浓度均与原材料有关，故是否细胞均已被破坏，均要在偏光显微镜下监控；用切片刀切下一小片组织(厚度大致为100～200μm)，经脱水、透明等步骤，在偏光显微镜下观察，此时原材料已无细胞即可取出；
3)、将原料取出清洗，即获得无细胞胶原框架，然后将无细胞胶原框架切割成0.05～0.5cm大小的组织块；
4)、将组织块研磨成直径为10～50μm，长度为300～500μm的胶原纤维丝.
图1、2、3、4是猪皮，在浓度为2.5n的hcl酸解24小时。
用上述获得的胶原纤维进行下述成分鉴定实验。
[目的]：与标准物、阳性对照物对照，用红外吸收光谱(分子光谱)、高压液相分析降解的氨基酸种类和百分比含量，确定本发明获得的注射性胶原的质量。
[标本来源与测试单位]：
标准品----胶原蛋白，sigma公司出品。
阳性对照物----人胎盘制成的注射性胶原，中国预防科学院医用胶原公司出品。
测试单位---清华大学，进行红外吸收光谱实验。
辽宁省分析测试研究中心，进行高压液相分析氨基酸百分含量、化学法测糖。
[结果]本发明所获得的产物是胶原蛋白，不是一般蛋白质；
糖的测定法是常规法。胶原纤维蛋白属于一段顺序中，呈周期性结构的少数蛋白质。一般蛋白质是由20种氨基酸组成，胶原由18种氨基酸组成。一般蛋白质分子中无羟脯氨酸和羟赖氨酸，胶原分子中无色氨酸、天门冬酰胺和谷氨酰胺。胶原分子由三条链组成每条链含1052个氨基酸残基，甘氨酸占总分子数的1/3，脯氨酸和羟脯氨酸占1/4，每个甘氨酸和脯氨酸或羟脯氨酸与其他氨基酸组成三联体连接组成一个长链的多肽，三个这样的多肽链组成胶原分子。胶原纤维比较硬，有较高的张力，直径为1mm的胶原束可承受10kg的重量。一个胶原分子，直径为1.5μm，长为280μm，由三条多肽链(x链)组成。x链的氨基端(1-16个氨基酸残基)和羟基端(1028-1052个氨基酸残基)均无三联体但留有酸性和碱性氨基酸。胶原分子的这些区域叫作端肽，不形成三股螺旋。因此用高压液相分析经处理的原材料，如果甘氨酸占总氨基酸含量的1/3，无色氨酸，即可认定为胶原蛋白。糖检查(—)，此产物即为纯胶原蛋白(降解产物)。(表1)
表1、样品氨基酸分析结果(高压液相)
(每种样品1000个氨基酸分子中氨基酸数)
注*：“市售(人)”胶原是中国预防医学科学院研制，国医械试字(94)第196057号
从表1可证实：
(1)标准品i型胶原iii型胶原(化学试剂)与市售品人胎盘提取的注射性胶原，和用本法从人、猪皮肤，牛肌腱制取的注射性胶原相比在氨基酸组成上无明显差异。
本发明所获得的产物与对照品各类胶原氨基酸含量无显著差异(p<0.05)；
本发明所获得的产物是纯胶原蛋白，无糖辅基。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。