本发明属于应用环境微生物和农业领域，涉及硝基还原酶基因cnrb及其编码硝基还原酶和应用，具体涉及抗生素氯霉素的硝基还原酶基因cnrb及其硝基还原酶和应用。
背景技术
氯霉素(chloramphenicol，cap)由streptomycesvenezuela的代谢所得，是一种应用广泛的抗生素，能够很好地抑制肠杆菌科细菌及炭疽杆菌的生长，对传染性厌氧菌引发的疾病有特效治疗效果。氯霉素不仅具备良好的抗菌作用且易于大规模生产，因此被普遍用于人类以及动物的多类疾病治疗。但氯霉素存在诱使机体病变、癌变的风险，已有医学研究表明它会对人类造血以及消化系统造成严重的毒性损害。且氯霉素及其分解产物会从土壤迁移进入地下水，造成生产生活水源污染，这些物质被人体吸收后会引起血液红细胞减少、贫血、消化系统和神经系统肌肉的紊乱以及婴儿的灰色综合症等不良反应。美国食品与药品管理局(fda)2002年颁布了禁止在进口动物源性贸易品中使用氯霉素的法规，欧盟(eu)卫生标准规定不得在进口食品中检测到氯霉素。但由于其代谢动力学特性良好、易于获得和价格低廉等原因，依然有人在畜禽养殖业中大量使用氯霉素。畜禽养殖业中使用的氯霉素，随着养殖粪便废水进入环境，加之氯霉素性质稳定，能在环境中长期存在，会导致诸如抗药性基因转移、破坏环境生态平衡等诸多问题，并威胁到人类的生存和健康。
获得氯霉素的降解基因在治理环境中的氯霉素残留的技术研发中具有以下作用和功能，(一)用于畜禽养殖场废水和环境水体中氯霉素的降解与去除，(二)用于有用化工产品及药物合成的生物转化。因此该降解基因在消除该类抗生素残留危害的研究中具有非常重要的理论和应用价值。
技术实现要素：
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种硝基还原酶基因cnrb，该基因为一种氯霉素硝基还原酶基因，是一个全新的硝基还原酶基因，该基因编码的硝基还原酶cnrb能够在还原力nadph存在条件下将氯霉素化学结构式中的硝基还原成氨基。
本发明还提供该硝基还原酶基因cnrb编码的硝基还原酶及其应用。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种硝基还原酶基因cnrb，所述基因cnrb的核苷酸序列为seqidno.1。
本发明所述的硝基还原酶基因cnrb编码的硝基还原酶cnrb，所述硝基还原酶cnrb的氨基酸序列为seqidno.2。
含有本发明所述的硝基还原酶基因cnrb的重组表达载体pet28a-cnrb。
所述重组表达载体pet28a-cnrb由硝基还原酶基因cnrb插入载体pet-28a(+)的ncoi和xhoi位点之间所得。
含有本发明所述的硝基还原酶基因cnrb的基因工程菌。
所述的基因工程菌是将权利要求3所述的重组载体pet28a-cnrb导入大肠杆菌rosetta(de3)获得。
本发明所述的硝基还原酶基因cnrb在降解和转化氯霉素中的应用。
本发明所述的硝基还原酶cnrb在降解和转化氯霉素中的应用。
本发明所述的在降解和转化氯霉素中的应用。
所述硝基还原酶cnrb在降解和转化水体、土壤中氯霉素残留的应用。
此外，所述硝基还原酶基因cnrb还可以应用在构建降解氯霉素的转基因作物中。
所述的重组表达载体pet28a-cnrb应用在构建降解氯霉素的转基因作物中。
本发明硝基还原酶基因cnrb是在一株氯霉素降解菌种中克隆得到，所用降解氯霉素的菌株为类诺卡氏菌lms-cy，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctccno:m2016591，保藏日期2016年10月24日，该菌株在专利(cn106754578a)中已经保藏。本发明克隆该基因采取的策略为全基因组测序比对筛选目的基因，提供比对筛选出的原始序列，设计引物，通过pcr扩增基因，胶回收试剂盒纯化后，采用双酶切获得目的片段。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明从一种氯霉素降解菌株lms-cy中成功克隆到一种硝基还原酶基因cnrb，该基因为一种氯霉素硝基还原酶基因，在genbank比对结果表明该基因为一个新的基因，全长(从起始密码子到终止密码子)为744bp，编码247个氨基酸，基因cnrb是首个公开的能降解氯霉素的降解基因，同时也是能催化还原苯环上硝基的新型氯霉素硝基还原酶基因。
2、本发明通过pcr技术扩增末端含ncoi和xhoi位点的完整的氯霉素硝基还原酶基因片段，将它连接到大肠杆菌高效表达载体pet-28a(+)的ncoi和xhoi酶切位点上，转化表达宿主菌rosetta(de3)，进行iptg诱导后可以高效表达。
3、本发明硝基还原酶基因cnrb编码的还原酶硝基cnrb能在够在还原力nadph存在条件下将氯霉素结构式中的硝基还原成氨基，该硝基还原酶cnrb可用于环境中氯霉素残留的去除及药物合成的生物转化，具有非常重要的理论和应用价值。
4、本发明对氯霉素硝基还原酶基因基因表达的产物(即硝基还原酶)，进行酶活性测定，能高效的降解氯霉素，1h能对100mg/l氯霉素的降解率为83.5％。
5、通过本发明的基因构建的工程菌株能高效表达氯霉素硝基还原酶，生产的酶制剂可用于水体、土壤中氯霉素残留的降解或转化。
附图说明
图1为硝基还原酶基因cnrb的pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；
图2为pet28a-cnrb质粒pcr鉴定琼脂糖凝胶电泳图；
图3为硝基还原酶基因cnrb在rosetta(de3)中表达策略图；
图4为重组菌株rosetta(de3)/pet28a-cnrb全菌表达鉴定sds-page蛋白电泳图；
图5为cnrb蛋白ni-ida纯化蛋白电泳图谱；
图6为硝基还原酶cnrb降解氯霉素hplc图；
图7为氯霉素硝基还原酶cnrb催化降解氯霉素的lc/ms/ms图谱；
a：氯霉素的酶降解产物总离子流图谱；b：保留时间为4.965min的物质一级质谱图；c：保留时间为4.965min的物质二级质谱图；
图8为氯霉素的lc/ms/ms图谱；
a：氯霉素的总离子流图谱；b：保留时间为4.976min的物质一级质谱图；c：保留时间为4.976min的物质二级质谱图；
图9氯霉素硝基还原酶cnrb降解氯霉素的途径。
具体实施方式
以下结合附图和实施例作进一步说明。
实施例中使用的微生物来源如下：
ncoi、xhoi购自宝生物工程(南京)有限公司；
大肠杆菌感受态top10购自宝生物工程(南京)有限公司；
大肠杆菌高表达载体pet-28a(+)购自novegen公司；
表达宿主菌大肠杆菌rosetta(de3)购自上海英骏生物技术有限公司。
实施例1菌株lms-cy的培养以及氯霉素硝基还原酶基因cnrb的克隆
菌株lms-cy，经鉴定为类诺卡氏菌属(nocardioidessp.)，已保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)，保藏时间为2016年10月24日，保藏编号为cctccno:m2016591，该菌株在专利(cn106754578a)中已经保藏。
1、细菌基因组总dna的提取
lb培养基配方(1l)为：nacl10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，ph7.2-7.5。
将菌株lms-cy(cctccno:m2016591)在lb培养基中大量培养后，采用ctab法提取高纯度、大片段的lms-cy的基因组总dna，溶于te缓冲液(ph8.0)中，置于－20℃保藏，具体方法参考f·奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。
2、基因组草图测序及结果分析
细菌基因组测序要求样品od值在1.8-2.0之间，将准备好的足量的菌株lms-cy基因组总dna，于干冰保温下寄送至北京奥维森生物科技公司测序。样品检测采用：1、琼脂糖凝胶电泳分析dna降解程度以及是否有rna污染；2、nanodrop检测dna的纯度(od260/280比值)；3.qubit对dna浓度进行精确定量。其中od值在1.8-2.0之间，含量在1.5μg以上的dna样品被用来建库。
3、基因组草图测序结果分析
菌株lms-cy基因组测序结果：菌株基因组草图大小为5,377,688bp，最后选取大于500的scaffold序列进行分析，共45个scaffold，其中大于1000的有41个，g+c％含量为71.94％。
根据细菌全基因组草图扫描结果，结合已经报道的硝基还原酶，运用生物学软件omiga3.0与lms-cy全基因组序列进行本地比对，在基因组预测分析结果中，以nitroreductase(硝基还原酶)为关键词进行检索，找到注释为氯霉素硝基还原酶的orf，在ncbi上比较分析orf，从而筛选出目的基因cnrb。在ncbi上进行blastx比对，从序列中分析编码氯霉素硝基还原酶的基因cnrb序列，其编码的氨基酸序列与来源于rhodococcusopacus的nitroreductase(登录号为wp005242866.1)，序列相似度为53％，与来源于rhodococcusjostii的nitroreductase(登录号为wp073360756.1)，序列相似度为49％。
实施例2基因cnrb序列验证
将获得的氯霉素硝基还原酶的基因cnrb定向克隆到广宿主载体rosetta(pet-28a(+))上，以氯霉素为底物，验证序列是否有功能。
1、序列的pcr扩增
设计引物扩增目的基因：
正向引物seq3：catgccatggggatctcctacgacatcacg；
反向引物seq4：ccgctcgaggtcgtcgtcgtcccataaga。
从菌株lms-cy总dna基因组中扩增出氯霉素硝基还原酶基因片段。
pcr扩增体系(50μl)：
加灭菌ddh2o至50μl
pcr扩增程序：
98℃变性3min；98℃变性10s；58℃退火10s；72℃延伸15s；进行再延伸10min，冷却至室温。
氯霉素硝基还原酶基因cnrb的pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。
2、pcr产物回收
步骤1中pcr扩增片段通过胶回收试剂盒纯化后，采用双酶切获得目的片段，以下体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h后，胶回收获得目的基因片段。载体pet-28a(+)采用ncoi/xhoi双酶切线性化后通过胶回收获得载体片段。
酶切反应体系(50μl)如下：
载体的酶切体系(50μl)：
将上述回收纯化好的目的dna片段和载体片段，进行酶连，按下述反应体系22℃pcr仪反应1h后得到重组表达载体pet28a-cnrb。
酶连体系(20μl)：
采用42℃热激法进行转化，感受态菌株为top10，转化取10μl酶连产物转化200μl感受态细胞，具体方法参照f.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》p23，涂布于含50μg/ml卡那霉素的lb平板上，37℃培养箱，倒置过夜培养。挑选上述过夜培养的单菌落在含50μg/ml卡那霉素的3mllb试管中培养到对数期，提取质粒，含有pet28a-cnrb重组表达载体的阳性克隆子质粒pcr鉴定琼脂糖凝胶电泳图如图2所示，证明重组载体构建成功。
3、基因核苷酸序列测定
将步骤2获得的的阳性克隆子提取质粒委托上海英骏生物技术有限公司进行序列测定，测得氯霉素硝基还原酶基因cnrb的核苷酸序列为seqidno.1，全长为744bp；根据氯霉素硝基还原酶基因cnrb核苷酸序列所推断的247个氨基酸序列为seqidno.2，理论大小为27.3kda。
seq1:gtgagctcgaccgcgcccgaggacgtggcccggcctctgctcgctctgcccgcgatcgaagccttcgacgcgatcgtaaggggtcgacgcagtgtgcgctcatacgctgacgtccaggtcccgcgacggactgtccgggacgtccttgagttggccgcccgcgcgcccagcaactcgaacgtgcaaccctggcatacctacgtcttgaccggtcggcacaagcgggcactgacggacagcgtgctgcgttactacgacacgatcggtaggacggtgcgtgagttcgactaccagcccggccctgatgggtgggaggagccgtacaaggagcgccgcgagagcttcggtgagggactctacggacgagctctcggattgagcctcgcggacgtggatgatcgcgagttctaccaccggcgcaactatgacttcttcgccgccccggtcggcttgatcgttactgttgcaaggaacccacggttgagcgctctaatcgacgcgggcgcctacatccagacgattctgctcagcgcccgcagccgcggcctgtccacgtgtgcgcaggcatcgttcctggacttccacccagccgtgcgggaatgtctggcgatccccacccaccgaaccatcgtctgcggcatctcgcttggatacgaagacgctcagcatcccatcgcctccaatgccacgacgcgagagccagtcgaccgccacgtgacgttcttatgggacgacgacgactga
seq2:valserserthralaprogluaspvalalaargproleuleualaleuproalaileglualapheaspalailevalargglyargargservalargsertyralaaspvalglnvalproargargthrvalargaspvalleugluleualaalaargalaproserasnserasnvalglnprotrphisthrtyrvalleuthrglyarghislysargalaleuthraspservalleuargtyrtyraspthrileglyargthrvalargglupheasptyrglnproglyproaspglytrpglugluprotyrlysgluargarggluserpheglygluglyleutyrglyargalaleuglyleuserleualaaspvalaspasparggluphetyrhisargargasntyraspphephealaalaprovalglyleuilevalthrvalalaargasnproargleuseralaleuileaspalaglyalatyrileglnthrileleuleuseralaargserargglyleuserthrcysalaglnalaserpheleuaspphehisproalavalargglucysleualaileprothrhisargthrilevalcysglyileserleuglytyrgluaspalaglnhisproilealaserasnalathrthrarggluprovalasparghisvalthrpheleutrpaspaspaspasp
实施例3氯霉素硝基还原酶基因cnrb在rosetta(de3)(pet-28a(+))中的高效表达
挑取实施例2中的阳性克隆子提取的质粒转化到表达宿主菌rosetta(de3)(转化方法参考实施例2)，将重组载体pet28a-cnrb导入大肠杆菌rosetta(de3)中，获得重组的基因工程菌株，涂布于含有50mg/l卡那霉素的平板，37℃培养箱，倒置过夜培养，挑取阳性转化子(即过夜培养出的单菌落rosetta(de3)/pet28a-cnrb)，硝基还原酶基因cnrb在rosetta(de3)中表达过程如图3所示。
挑取阳性转化子接种至新鲜的lb液体培养基(含50mg/l卡那霉素)37℃培养约4小时，od600为0.6左右，加入终浓度为0.6mm的iptg，37℃诱导2小时后收集菌体，100ml菌液离心，用15ml(50mm,ph7.4)pbs缓冲液重悬菌体，全菌表达鉴定sds-page蛋白电泳图如图4所示；将菌体继续超声破碎(autoscience,uh-650bμltrasonicprocessor,30％intensity)，5min，离心，处理后的菌体蛋白样品进行13％sds-page电泳，电泳图如图5所示，图5表明rosetta(de3)/pet28a-cnrb菌株可以大量表达产生cnrb蛋白。
cnrb蛋白纯化具体步骤：挑取阳性转化子接种至新鲜的2升lb液体培养基(含50mg/l卡那霉素)37℃培养至od600为0.6左右，加入终浓度为0.6mm的iptg，15℃诱导12小时，收集细胞，并用35ml冰浴的buffera(50mmpbs，300mmnacl，1％triton-100，ph7.4)重悬，超声裂解细胞，离心取上清过ni-ida柱。用100mlbuffere(50mmpbsph7.4，2mnacl，0.1％tritonx-100)洗涤ni-ida柱；50mlbufferf(50mmpbsph7.4，50mmnacl，0.1％tritonx-100，10mm咪唑)洗涤ni-ida柱；50mlbufferg(50mmpbsph7.4，50mmnacl，0.1％tritonx-100，250mm咪唑)洗涤ni-ida柱，纯化得到的氯霉素硝基还原酶cnrb，cnrb电泳图谱见图5，图5表明处理后的菌体蛋白样品进行sds-page电泳，在iptg诱导后，出现了一条约为29kd的蛋白条带。
实施例4硝基还原酶cnrb活力测定
3ml酶活反应体系：50mmpbs缓冲液(ph7.4)，100mg/l底物氯霉素、cnrb反应酶量(实施例3中纯化所得)30μl，还原力nadph30μl，30℃反应1h。每个反应以加入酶开始计时，用3ml乙酸乙酯终止反应，分层后有机相经无水硫酸钠脱水，吸取2ml有机相吹干，用400μl甲醇溶解，氯霉素含量用反向hplc测定。一个酶活力单位(u)定义为：在ph7.4，温度30℃条件下，每分钟催化减少1μmol氯霉素所需的酶量。降解试验表明纯化后的硝基还原酶cnrb对氯霉素还原的比酶活为34.2u/mgprotein。
实施例5硝基还原酶cnrb对氯霉素的降解和转化以及代谢产物的确定
3ml氯霉素的酶反应体系：50mmpbs缓冲液(ph7.4)，100mg/l底物氯霉素、cnrb反应酶量(实施例3中纯化所得)30μl，还原力nadph30μl，30℃反应1h，用3ml乙酸乙酯终止反应，分层后有机相经无水硫酸钠脱水，吸取2ml有机相吹干，用400μl甲醇溶解，用滤膜(孔径0.22μm)过滤。
采用紫外和高效液相色谱测定提取液中氯霉素的含量，液相色谱条件：流动相乙腈：水(50：50，v/v)，加入0.5％乙酸，zorbaxc218odsspherex反相柱(5μm，4.6mm×250mm，agilent，usa)，柱温为30℃，紫外检测器，测定波长254nm、272nm，进样量20μl，流速为1.0ml·min-1。外标法按峰面积定量。硝基还原酶cnrb对氯霉素的转化和降解如图6所示，由图6可知，硝基还原酶cnrb在1h对100mg/l氯霉素降解率为83.5％。
采用液质联用仪(lc/ms/ms)测定降解产物，方法如下：首先吸取上述2ml有机相吹干，然后加入1ml甲醇溶解(色谱纯)，用滤膜(孔径0.22μm)过滤。液相色谱条件：流动相为乙腈，色谱柱为phenomenexkinetec18(2.6μm，2.1mm×100mm)，进样量2μl，流速为0.3ml·min-1，程序为梯度洗脱(0.5-12min10％乙腈，12-15min90％乙腈，15-15.1min90％乙腈，15.1-18min10％乙腈)。质谱检测选用：absciex高分辨串联质谱仪，tripletof5600+lc/ms/ms系统，离子源为esi，正离子检测模式，质量扫描范围(m/z)：100—550；氯霉素硝基还原酶cnrb催化降解氯霉素的lc/ms/ms检测结果如图7所示。对照为氯霉素原药(99％纯度)，加入灭活的cnrb。采用上述相同的处理条件和液质条件进行检测，氯霉素原药的lc/ms/ms检测结果如图8所示。
由图7和图8的图谱数据分析得出氯霉素分别经氯霉素硝基还原酶cnrb水解断裂硝基还原键后生成氨基氯霉素，生化反应途径见图9。
实施例6硝基还原酶cnrb对水体中氯霉素的转化和降解
通过实施例3的方法大量纯化出硝基还原酶cnrb，采用酶固定化，选用常规的海藻酸钠为包埋剂，通过正交试验，确定最佳的包埋方法为：3％海藻酸钠水溶液(g/ml)包埋硝基还原酶，海藻酸钠水溶液和酶液的体积比为6∶1混合形成混合液。将混合液用注射器一滴一滴的滴入2％氯化钙水溶液(g/ml)中，交联时间4h，制成固定化小球，即固定化酶。
取多份100ml氯霉素制药厂废水，过滤后，调整氯霉素含量，使水体中氯霉素浓度为50mg/l(处理)，加入固定化酶，对照组为加入相同量的灭活酶，30℃摇培，反应1h后测定氯霉素的残留浓度，计算降解率。利用高效液相色谱测定残留量，计算多次平均降解率，结果见表1。
表1硝基还原酶cnrb固定化酶对水体中对氯霉素残留的降解效果
由表1可见，水体中氯霉素浓度为50mg/kg时硝基还原酶cnrb固定化酶对氯霉素的降解率达到80.2％，同时对照中的氯霉素没有被降解。结果表明，硝基还原酶cnrb固定化酶可有效降解水体中的氯霉素残留。同时，与实施例7类似，硝基还原酶cnrb还可有效降解或转化土壤中的氯霉素残留。
序列表
<110>南京农业大学
<120>一种硝基还原酶基因cnrb及其编码的蛋白和应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>744
<212>dna
<213>类诺卡氏菌(nocardioidessp.)
<400>1
gtgagctcgaccgcgcccgaggacgtggcccggcctctgctcgctctgcccgcgatcgaa60
gccttcgacgcgatcgtaaggggtcgacgcagtgtgcgctcatacgctgacgtccaggtc120
ccgcgacggactgtccgggacgtccttgagttggccgcccgcgcgcccagcaactcgaac180
gtgcaaccctggcatacctacgtcttgaccggtcggcacaagcgggcactgacggacagc240
gtgctgcgttactacgacacgatcggtaggacggtgcgtgagttcgactaccagcccggc300
cctgatgggtgggaggagccgtacaaggagcgccgcgagagcttcggtgagggactctac360
ggacgagctctcggattgagcctcgcggacgtggatgatcgcgagttctaccaccggcgc420
aactatgacttcttcgccgccccggtcggcttgatcgttactgttgcaaggaacccacgg480
ttgagcgctctaatcgacgcgggcgcctacatccagacgattctgctcagcgcccgcagc540
cgcggcctgtccacgtgtgcgcaggcatcgttcctggacttccacccagccgtgcgggaa600
tgtctggcgatccccacccaccgaaccatcgtctgcggcatctcgcttggatacgaagac660
gctcagcatcccatcgcctccaatgccacgacgcgagagccagtcgaccgccacgtgacg720
ttcttatgggacgacgacgactga744
<210>3
<211>247
<212>prt
<213>类诺卡氏菌(nocardioidessp.)
<400>3
valserserthralaprogluaspvalalaargproleuleualaleu
151015
proalaileglualapheaspalailevalargglyargargserval
202530
argsertyralaaspvalglnvalproargargthrvalargaspval
354045
leugluleualaalaargalaproserasnserasnvalglnprotrp
505560
histhrtyrvalleuthrglyarghislysargalaleuthraspser
65707580
valleuargtyrtyraspthrileglyargthrvalargglupheasp
859095
tyrglnproglyproaspglytrpglugluprotyrlysgluargarg
100105110
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115120125
alaaspvalaspasparggluphetyrhisargargasntyraspphe
130135140
phealaalaprovalglyleuilevalthrvalalaargasnproarg
145150155160
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165170175
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180185190
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195200205
thrilevalcysglyileserleuglytyrgluaspalaglnhispro
210215220
ilealaserasnalathrthrarggluprovalasparghisvalthr
225230235240
pheleutrpaspaspaspasp
245
<210>3
<211>30
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
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<210>4
<211>29
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
ccgctcgaggtcgtcgtcgtcccataaga29