本发明涉及作物分子标记辅助育种技术领域，特别是涉及一种玉米耐盐基因及其indel分子标记及其应用。
背景技术
玉米是重要的粮食、饲料和经济农作物。然而，其为盐敏感农作物。全球有20％以上的耕地为盐害地，严重制约着玉米的生长、发育及产量(munns等,2008,annualreviewofplantbiology59：51-681)。随着可耕地面积的逐渐减少，耐盐玉米种质资源的开发及利用愈加迫切及必要。因此，如何提高玉米耐盐性，培育耐盐玉米新品种是全球亟待解决的问题，对玉米产业的长期发展具有重要意义。
遗传因素是造成不同玉米材料耐盐性差异的根本原因。大量的育种及生产实践都证明不同玉米材料的耐盐性存在着广泛的遗传变异，故而，利用现有种质资源挖掘耐盐基因，开发耐盐功能标记，进而通过分子标记辅助选择的手段选育耐盐优良自交系和杂交种，对玉米育种具有重要意义。
目前，植物耐盐基因研究已取得大量进展。拟南芥模式作物中，其耐盐性主要由三条信号通路介导：sos信号通路维持离子平衡，丝裂原活化蛋白激酶信号通路介导渗透平衡，和抗氧化系统调节氧化还原平衡。其中，sos信号通路由sos1,sos2和sos3三个成员构成，ca2+与sos3蛋白结合后，与sos2相互作用形成sos2-sos3激酶复合物，通过磷酸化激活na+/h+逆向转运蛋白sos1，使sos1发挥将na+离子转运出细胞膜外的作用，从而减少na+毒性(zhu,2001,trendsinplantscience6:66-71；zhu,2016,cell167:313-324)。在水稻和小麦中，分别克隆到编码na+离子特异性转运子的基因osskc1(ren等，2005，naturegenetics37:1141-1146)和tmhkt1；5-a(munns等,2012,naturebiotechnology30:360-364)，并已应用于育种实践中。
作物在长期进化过程中，形成了复杂的耐盐机制，涉及的基因较多。为了能够有效地、针对性地改变农作物的耐盐性，迫切需要挖掘新的耐盐基因，开发功能标记，为分子标记辅助育种提供技术支撑。
技术实现要素：
本发明的第一个目的在于提供一种玉米耐盐基因及其应用。
本发明的第二个目的在于提供与玉米耐盐性状相关的indel分子标记，及扩增该分子标记的特异性引物对。
本发明的第三个目的是提供上述分子标记的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
以北京市农林科学院玉米研究中心选育的玉米自交系京724(耐盐性)和d9h(盐敏感性)为基础材料。京724为我国生产上大面积推广的玉米品种京科968的母本，其具有耐盐性；d9h与京724互为姐妹系，且具有盐敏感性。280个京724×d9h的f2中，有215个f2材料表现盐耐受，65个f2材料表现盐敏感，符合3:1(χ21:3＝0.48,p＝0.49),表明其耐盐性由显性单基因控制。在京724×d9h的f2中，选择30个具有耐盐表型的f2材料和30个具有盐敏感表型的f2材料，利用bsr-seq技术将玉米耐盐基因初定位在基因组1号染色体167mb-183mb的物理区间。在此基础上，利用京724×d9h的3635个f2材料和图位克隆技术将耐盐基因精细定位到129kb(chr1:180862086-180991157，b73refgen_v3)的区间内。对此区间内的基因进行序列分析、功能注释分析和突变体等位测验验证鉴定到grmzm2g098494为耐盐基因，命名为zmst1。
本发明提供的玉米耐盐基因zmst1位于玉米基因组第1染色体，其具有seqidno.1所示的核苷酸序列，或其截短序列，或与其有95％以上同源性的编码相同功能蛋白的特异性序列。
上述玉米耐盐基因zmst1编码的蛋白属于本发明的保护范围。
本发明提供了上述玉米耐盐基因zmst1或其编码的蛋白在作物分子辅助育种中的应用。
本发明提供了上述玉米耐盐基因zmst1或其编码的蛋白在选育耐盐能力高的作物中的应用。
上述应用中，所述作物包括但不限于玉米、小麦、水稻、高粱、大豆。
本发明提供了上述玉米耐盐基因zmst1或其编码的蛋白在制备耐盐能力高的玉米品种中的应用。
本发明提供了上述玉米耐盐基因zmst1或其编码的蛋白在预测玉米耐盐能力中的应用。
本发明提供了与玉米耐盐性状相关的分子标记，其为序列如seqidno.1所示的第17604-17607bp的aaga/-。具有耐盐性状的玉米，在seqidno.1所示的第17604-17607bp的碱基排列顺序为aaga；当基因组第1染色体上如seqidno.1所示的第17604-17607bp的碱基发生缺失，则该玉米为感盐。
本领域技术人员能够理解，本发明提供的与玉米耐盐性状相关的分子标记，也可由seqidno.1所示核苷酸的互补配对序列的第343-346bp的tctt/-来表征。
所述的分子标记，由核苷酸序列如seqidno.2-4所示的引物扩增获得。该引物适用于kasp平台检测玉米耐盐性状相关的分子标记。
进一步地，本发明提供了上述分子标记在作物分子辅助育种、选育耐盐能力高的作物、筛选耐盐玉米品种、预测玉米耐盐能力中的应用。
本发明还提供了用于检测与玉米耐盐性相关的分子标记的特异性引物对，由三条引物组成，其核苷酸序列分别如seqidno.2-4所示。
本发明的有益效果在于：本发明利用京724×d9h的3635个f2材料和图位克隆技术将耐盐基因精细定位到129kb(chr1:180862086-180991157，b73refgen_v3)的区间内，对此区间内的基因进行序列分析、功能注释分析和突变体等位测验验证鉴定到grmzm2g098494为耐盐基因，命名为zmst1，进一步通过设计11对引物，进行多次pcr扩增，获得有重叠的dna片段后拼接得到zmst1基因的如seqidno.1所示的核苷酸序列，并验证了zmst1基因的耐盐功能。基于玉米耐盐功能基因而开发的玉米耐盐kasp功能分子标记，可用于高通量、快速、准确鉴定及筛选耐盐玉米种质资源，可通过分子标记辅助育种手段加速玉米品种的遗传改良。
附图说明
图1为bsr-seq对本发明的玉米耐盐基因初步定位结果。
图2分子标记对50份玉米dh材料的分型结果。根据laboratoryofthegovernmentchemist(lgc)公司的标准实验步骤进行kasp法检测indel位点，数据用kraken软件分析并导出。左上角：indel位点的碱基为缺失，右下角：indel位点的碱基为tctt，左下角：阴性对照。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
本发明实施例中所用的玉米种质资源均来自北京市农林科学院玉米研究中心玉米种质资源库。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1玉米耐盐性的遗传分析和耐盐基因的定位与克隆
280个京724×d9h的f2材料，其种子用1％naclo消毒10min后，用灭菌水洗三次，然后在玉米幼苗鉴定装置(已在中国专利zl200920177285.0中公开)中水培种植。培养条件控制在26±1℃，12h光照/12h黑暗，光照强度为150-180μmolm-2s-1，湿度为70％。含有100mmnacl的水溶液中培养10天后，以根长作为耐盐表型，发现280个材料中，有215个材料表现出耐盐性(根长≥5cm)，65个材料表现出盐敏感(根长<5cm)，符合3：1(χ21:3＝0.48,p＝0.49)，可见玉米根长耐盐性受显性单基因控制。
利用bsr-seq技术进行耐盐基因的初定位：京724×d9h的f2玉米种子在含有100mmnacl的水溶液中培养10天后，分别取30株耐盐和盐敏感的f2的叶片，构建抗、感池进行bsr-seq分析。bsr-seq根据data2bio公司的标准实验步骤进行，其主要实验步骤如下：每个材料取等量混匀提取rna，构建耐盐和盐敏感两个rna池。rna样品反转录成cdna后用hiseqx高通量测序仪进行测序。对原始测序数据进行质控处理后，与参考基因组(https://www.maizegdb.org/；b73refgen_v3)进行序列比对分析，对比对到参考序列唯一位置的测序序列进行snp检测。然后用经典贝叶斯算法分析snp位点，预测耐盐基因所在的染色体区域。将耐盐基因初定位在第1号染色体167mb-183mb的物理区间内(图1)。
利用图位克隆技术进行耐盐基因的精细定位：3635个京724×d9h的f2玉米种子在含有100mmnacl的水溶液中培养10天，测定其根长后，用tiangen公司的植物dna提取试剂盒提取其叶片dna。在1号染色体167mb-183mb的物理区间内开发snp分子标记，对3635个材料的基因型进行检测，根据检测到的交换单株数量来寻找与目标基因紧密连锁的snp标记。最终将耐盐基因定位到snp27和snp29之间，间距为129kb(chr1:180862086-180991157，b73refgen_v3)。snp27和snp29的引物信息如表1所示。
表1引物信息
根据laboratoryofthegovernmentchemist(lgc)公司的标准实验步骤进行kasp高通量snp基因分型，其主要实验步骤为：用tiangen公司的植物dna提取试剂盒提取dna后，用replikator孔板复制机将dna稀释到40ng/μl，每个样品的1.5μldna转移到1536黑色板材里，55℃烘干。按照lgc公司的kasp基因分型标准反应体系配制反应液，每个反应总体积为1μl，包含kaspassaymix(72×)0.014μl、kaspmastermix(2×)0.5μl、dnase/rnase-freedeionizedwater0.486μl，配制好后用lgc公司的merdian微量分液器打入1536孔黑色板材内，孔板离心后用lgc公司的fusion激光封膜仪封膜。在hydrocycle水浴锅进行目标dna片段扩增，扩增体系为:94℃15min；94℃20s61-55℃1min(每个循环下降0.6℃),共10循环；94℃20s55℃1min，26个循环。扩增好的1536孔板用pherastarplussnp荧光检测仪读取荧光信号值，用kraken软件导出基因分型结果。
耐盐基因克隆：检索maizegdb数据库(https://www.maizegdb.org/；b73refgen_v3)，发现该区段有4个基因，对耐盐玉米自交系京724和盐敏感自交系d9h中的这4个基因进行测序分析，blastn序列比对发现grmzm2g098494的cds3′-末端在盐敏感玉米自交系d9h中存在4bp的缺失，命名该基因为zmst1。
从ems突变体库memd(http://www.elabcaas.cn/memd/)中索取到两个grmzm2g098494突变体，分别为密码子终止突变体ems3-00b974和错误剪接突变体ems3-00b98f，两个突变体的突变位点不同，但都是grmzm2g098494基因内发生突变，导致基因功能丧失。
田间种植自交系d9h和突变体ems3-00b974、ems3-00b98f玉米材料，开花授粉时，分别对d9h和ems3-00b974、d9h和ems3-00b98f做杂交授粉。玉米收获期，收集f1玉米种子。随机取15粒f1玉米种子分别在不含有(对照)和含有100mmnacl(盐胁迫)的水溶液中培养，10天后测量其根长。测量结果表明两个突变体与d9h的杂交f1玉米种子在盐胁迫下培养10天后，与对照组相比根长都受到显著性抑制(<5cm)(表2)。因此，等位测验实验表明zmst1的突变导致盐敏感，zmst1为耐盐基因。
表2d9h和ems3-00b974、ems3-00b98f杂交f1表型
zmst1基因序列较长，本实施例进行多次pcr扩增获得有重叠的dna片段后拼接得到seqidno.1所示的序列。其扩增采用了11对引物。引物按顺序编号为：zmst1-1，zmst1-2等。pcr扩增引物见表3，pcr扩增体系为：总反应液体系为50μl，其中dna模板3μl，正向引物(5μmol/l)2.5μl，反向引物(5μmol/l)2.5μl，dntp(2mmol/l)5μl，10×buffer(含有mg2+)5μl，pfudna聚合酶(2.5u/μl)1μl，ddh2o31μl。扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2-3min(据扩增产物大小确定延伸时间)，35个循环；72℃延伸7min。
表3zmst1基因扩增引物
实施例2与玉米耐盐性状相关的indel分子标记的开发与应用
zmst1在耐盐玉米自交系京724和盐敏感自交系d9h中序列存在4bp的碱基插入/缺失差异，根据该序列差异开发功能分子标记，所开发的功能分子标记st35功能位点为tctt/-，其kasp引物信息见表1。将50份玉米dh系材料在含有100mmnacl的水溶液中培养10天后，用直尺测定其根长，同时用tiangen公司的植物dna提取试剂盒提取叶片dna。利用该功能分子标记，根据laboratoryofthegovernmentchemist(lgc)公司的标准实验步骤进行kasp法检测indel位点，发现应用本申请的功能分子标记对玉米dh系材料基因型分型得出的耐盐性结果(图2)与其耐盐表型(表4)一致，证实此功能分子标记能够准确鉴定玉米材料的耐盐性。
表450份玉米dh系材料表型和耐盐位点基因型
虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>北京市农林科学院
<120>一种玉米耐盐基因及其分子标记与应用
<130>khp181113962.2
<160>32
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>17949
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
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