本发明属于动物分子生物学领域，涉及一种猪副流感病毒5型巢式pcr试剂盒。
背景技术：
猪副流感病毒5型(porcineparainfluenzavirus5，ppiv-5)属于副黏病毒科(paramyxoviridae)，副黏病毒亚科(paramyxovirinae)，腮腺炎病毒属(rubulavirus)。ppiv5感染猪可导致咳嗽、流鼻等急性呼吸道症状。该病呈地方性流行，虽然发病率较低、多为隐性感染，但对养猪业潜在的危害巨大。随着ppiv-5感染猪的病例不断在国外报道，加之有研究表明该病毒可以感染人而被所越来越重视，为了应对该病毒感染可能带来的重大经济损失，世界各国都在加紧研制有效的临床诊断技术。国内对该病的研究起步较晚，目前还没有有效的检测方法。目前仅通过临床症状进行诊断，结果不准确，往往因误诊而导致全群动物感染，导致巨大的潜在经济损失；由于ppiv-5在鼻腔分泌物和粪便中含量极少而常规rt-pcr敏感性低易导致漏检，未能准确检测出ppiv-5。针对以上原因，建立一种准确性高、特异性好，灵敏度高的ppiv-5检测方法具有较高的临床应用价值。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种猪副流感病毒5型巢式pcr试剂盒，克服由于ppiv-5在鼻腔分泌物和粪便中含量极少而常规rt-pcr敏感性低易导致漏检，不能准确检测出ppiv-5的问题。
本发明通过以下技术方案来实现：一种猪副流感病毒5型巢式pcr试剂盒，包括10×pcr反应缓冲液，mg2+，dntp，引物和taq酶，所述的引物为：
(1)检测ppiv-5f基因的外套引物：
ppiv-5-of：tcgccgattagtggatgtaatataa(seqidno.1)
ppiv-5-or：atataggtcaaatctaatcccacaatct(seqidno.2)
(2)检测ppiv-5f基因的内套引物：
ppiv-5-if：cccaagatgctatcattggctcaat(seqidno.3)
ppiv-5-ir：ctaatttttcaagcacggctac(seqidno.4)。
进一步的，所述的试剂盒的外套pcr反应体系为cdna模板3μl，2×permix12.5μl，10pmol/μl的ppiv-5-of1μl，10pmol/μl的ppiv-5-or1μl，加ddh2o至25μl体系。
进一步的，所述的试剂盒的外套pcr反应条件为94℃2min，95℃20s，55℃20s，72℃30s，30个循环，72℃5min。
进一步的，所述的试剂盒的内套pcr反应体系为外套pcr扩增产物1μl，2×permix12.5μl，10pmol/μl的ppiv-5-if1μl，10pmol/μl的ppiv-5-ir1μl，加ddh2o至25μl体系。
进一步的，所述的试剂盒的内套pcr反应条件为94℃2min，94℃20s，58℃20s，72℃10s，25个循环，72℃5min。
ppiv5基因组为单股负链不分节段的rna，长15246bp，在副黏病毒科病毒中最小，可编码6个结构蛋白，其中f蛋白是病毒附着宿主细胞后，病毒核衣壳释放到胞浆前与宿主细胞表面脂蛋白膜融合的主要因子，主要功能区相对保守，可做为核酸检测的良好靶点，本试验以f基因为靶基因设计了ppiv-5-of、ppiv-or与ppiv-5-if、ppiv-5-ir两对引物。巢式pcr方法可通过两对引物对少量模板进行两轮扩增，能最大限度的实现ppiv-5的快速检测，成功扩增出目的基因片段，提高了检测灵敏度。
采用上述技术方案的积极效果：本发明通过巢式pcr方法对ppiv5基因进行检测，提高了检测的灵敏度和特异性，为临床ppiv-5检测提供有效技术手段，克服了现有的rt-pcr的弊端，但本发明与常用rt-pcr检测方法所用仪器相同，在有pcr仪的条件下，无需再添加仪器设备，节省了实验经费并且检测结果更加准确，操作方便，在临床上可用于大批样品的检测。
附图说明
图1是rt-pcr扩增结果，其中，m：dl2000；1：空白对照；2-5：ppiv-5-of、ppiv-5-orrt-pcr扩增结果；
图2是巢式pcr扩增结果，其中，m：dl2000；1：空白对照；2-5：ppiv-5-if、ppiv-5-ir巢式pcr扩增结果；
图3是rt-pcr敏感性试验结果，其中，m：dl2000；1：空白对照；2-12：rna浓度1.249×102ng/μl-1.249×10-8ng/μlppiv-5-of、ppiv-5-orrt-pcr扩增结果；
图4是巢式pcr敏感性试验结果，其中，m：dl2000；1：空白对照；2-12：rna浓度1.363×102ng/μl-1.249×10-8ng/μlppiv-5-if、ppiv-5-ir巢式pcr扩增结果；
图5是巢式pcr特异性试验结果，其中，m：dl2000；1：空白对照；2：阳性对照；3-5：ppiv-5-if、ppiv-5-ir巢式pcr扩增结果；
图6是rt-pcr的临床检测结果，其中，m：dl2000；1：空白对照；2-12：ppiv-5-of、ppiv-5-orrt-pcr扩增结果；
图7是巢式pcr的临床检测结果，其中，m：dl2000；1：空白对照；2-12：ppiv-5-if、ppiv-5-ir巢式pcr扩增结果。
具体实施方式
本发明中生物材料的来源：
1、猪ppiv-5hlj2015/dp1-1株：该菌株已经记载在jiangn,wange,guod,wangx,sum,kongf,yuand,zhaij,sund.isolationandmolecularcharacterizationofparainfluenzavirus5indiarrhea-affectedpigletsinchina[j].jvetmedsci.2018feb20.doi:10.1292/jvms.17-0581.中，并由本专利的申请人保证自申请日起向公众发放该生物材料二十年；
2、所有引物为自行设计并委托哈尔滨博仕生物有限公司合成。
下面结合具体的实施例和试验例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：
实施例1
1、引物设计
参考本实验室分离的猪ppiv-5hlj2015/dp1-1株的f基因(ky364869)序列，使用ologo6.0软件设计两对引物，由哈尔滨博仕生物有限公司合成。引物信息见表1。
表1ppiv-5f基因引物
2、病毒基因组rna的提取
利用病毒检测用rna提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京，中国)，对肺脏样品中病毒rna进行提取，具体操作按照试剂盒说明书进行。
3、cdna合成
提取的病毒rna0.36μg，ppiv-5-of(10pmol/μl)1μl，5×reactionbuffer2μl，rna酶抑制剂(40u/μl)0.3μl，dntp(10mm)1μl，m-mulv反转录酶(200u/μl，上海近岸科技有限公司)0.5μl，加ddh2o至10μl，混匀，瞬时离心；25℃孵育5min；42℃孵育60min；75℃加热5min终止反应。将产物保存于-40℃冰箱。
4、ppiv-5f基因pcr扩增
以合成的cdna为模板，进行ppiv-5n基因外套引物的pcr扩增，扩增片段大小为626bp。通过试验对cdna模板用量、引物浓度，退火温度进行优化，反应体系如下：
外套pcr反应体系：提取的cdna模板3μl，2×permix(takara生物技术(大连)有限公司)12.5μl，ppiv-5-of(10pmol/μl)1μl，ppiv-5-or(10pmol/μl)1μl，加ddh2o至25μl体系。外套pcr扩增条件：94℃2min，95℃20s，55℃20s，72℃30s，30个循环，72℃5min，取3μl外套pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示。
5、ppiv-5f基因巢式pcr扩增
取外套pcr扩增产物为模板，进行ppiv-5n基因内套引物的pcr扩增，扩增片段大小为213bp。通过试验对外套pcr扩增产物用量、引物浓度，退火温度进行优化，反应体系如下：
内套pcr反应体系：外套pcr扩增产物1μl，2×permix(takara生物技术(大连)有限公司)12.5μl，ppiv-5-if(10pmol/μl)1μl，ppiv-5-ir(10pmol/μl)1μl，加ddh2o至25μl体系。内套pcr扩增条件：94℃2min，94℃20s，58℃20s，72℃10s，25个循环，72℃5min，取3μl内套pcr扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图2所示。
试验例1
本试验例用于说明本试剂盒的敏感性。
取ppiv-5分离株rna进行倍比稀释，浓度由1.249×102ng/μl稀释至1.249×10-8ng/μl。以此为模板，按建立的巢式pcr诊断方法进行扩增，确定可检测出rna最低浓度，以检验建立的巢式pcr方法的灵敏度。
敏感性试验结果显示，当rna稀释至1.249ng/μl时，rt-pcr可观察到目的条带，而当rna稀释至1.249×10-2ng/μl时，巢式pcr仍可观察到目的条带。由上述结果可知，在敏感性方面，巢式pcr优于rt-pcr，巢式pcr检测方法敏感性高出rt-pcr检测方法100倍。试验结果如图3、图4所示。
试验例2
本试验例用于说明本试剂盒的特异性。
用建立的巢式pcr诊断方法对猪腮腺炎病毒(lpmv)、猪流感病毒(siv)和猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(prrsv)等能引起引起呼吸道症状的病毒进行扩增，测试该方法的特异性。
采用建立的ppiv-5巢式pcr诊断方法对lpmv、siv和prrsv进行扩增时，无目的条带，结果均为阴性；检测只有时ppiv-5阳性病料内套能够扩增出特异性的目的条带。试验结果如图5所示。
试验例3
本试验例用于说明本试剂盒的临床样品检测。
用建立的巢式pcr诊断方法对来自黑龙江、上海、湖南和江西等地猪场的临床疑似感染ppiv-5的样品进行检测，以验证该方法的准确性。
用建立的ppiv-5巢式pcr诊断方法对11份疑似感染ppiv-5的病料进行检查，检出率为36％，而普通rt-pcr未能检出。试验结果如图6、图7所示。
本发明通过巢式pcr方法对ppiv5基因进行检测，提高了检测的灵敏度和特异性，为临床ppiv-5检测提供有效技术手段，克服了现有的rt-pcr的弊端，但本发明与常用rt-pcr检测方法所用仪器相同，在有pcr仪的条件下，无需再添加仪器设备，节省了实验经费并且检测结果更加准确，操作方便，在临床上可用于大批样品的检测。
序列表
<110>黑龙江八一农垦大学
<120>猪副流感病毒5型巢式pcr试剂盒
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>2
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
tcgccgattagtggatgtaatataa25
<210>2
<211>28
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
atataggtcaaatctaatcccacaatct28
<210>3
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
cccaagatgctatcattggctcaat25
<210>4
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
ctaatttttcaagcacggctac22