本发明涉及生物和化学技术领域中，蛋白质和糖蛋白的酶解方法。
背景技术：
研究蛋白质酶解具有如下意义：1、通过酶把蛋白质酶切获得蛋白质肽段，用质谱采集获得肽段指纹图谱用于鉴定蛋白质，可以生产蛋白质鉴定试剂盒或蛋白质酶解试剂盒；2、获得特定的酶解肽段进行科学研究，如获得需要研究的糖肽，获得带有氨基酸突变的肽段等；3、确定研究蛋白质的翻译后修饰位点，如：糖基化位点，甲基化位点、乙酰化位点等。
目前蛋白质酶解的方法有：
(1)、传统的酶解方法：酶解时间在12小时或以上，该方法的缺点：耗时，且一般很少用于小体积或小质量蛋白质的酶解。
(2)、把酶固定在固体材料表面的方法：固体材料表面酶的浓度升高，加快酶解速度。该方法的缺点：消耗固体材料和酶，使简单的酶解过程变复杂，引入的材料不利于后面的科学研究，以及损失蛋白质和酶(固体材料表面吸附作用)，更不利于小体积或小质量蛋白质的酶解。
(3)、微波法、超声波法、红外线辐射法和激光辐射法等：这些方法通过提供能量使被酶解蛋白质暴露出更多的酶解位点，而加快酶解速度。这些方法的缺点：需要额外设备，使酶解操作变得复杂，而且也不利于野外作业。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是如何快速酶解蛋白质或糖蛋白。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或糖蛋白的酶解方法，所述方法包括：将待酶解物质与蛋白酶于反应体系中孵育0.5-15分钟，完成所述待酶解物质的酶解；
所述待酶解物质为蛋白质或糖蛋白；
所述反应体系含有nh4hco3。
上述方法中，所述反应体系中nh4hco3的浓度可大于0mm小于等于100mm。
上述方法中，所述反应体系中所述待酶解物质与所述蛋白酶的质量比可为1：(0.0001-3)。
所述孵育的时间可为0.5-10分钟。所述孵育的时间进一步可为5分钟。所述孵育的时间满足使所述待酶解物质的酶解，该时间因所述待酶解物质的量或浓度的不同而有所变化，如2ng/μl≤所述待酶解物质的浓度≤10ng/μl时，所述孵育的时间可为5min；10ng/μl≤所述待酶解物质的浓度时，所述孵育的时间可小于等于5min。
所述孵育的温度可为4-80℃。
上述方法中，所述反应体系的体积可满足在所述孵育结束时所述反应体系中液体全部蒸发，所述待酶解物质的酶解可在所述反应体系中液体的蒸发过程中完成，将该方法记为方法1。
上述方法1中，所述反应体系的体积可为0.1-10μl。所述反应体系可处于开放的环境中。所述环境可为普通空气环境。由于所述反应体系的体积比较小，在进行所述孵育时，所述反应体系中的水逐渐蒸发，进而导致所述反应体系的体积逐渐减少，在所述孵育结束时，得到体积变小的反应体系或所述反应体系在所述反应体系所在容器中由反应产物形成的靶点。
上述方法1中，所述反应体系中所述待酶解物质与所述蛋白酶的质量比可为1：(0.3-3)。所述反应体系中所述待酶解物质与所述蛋白酶的质量比进一步可为1：(0.5-2)。
上述方法1中，所述孵育的温度可为25-39℃。所述孵育的温度进一步可为30-37℃。
上述方法1中，所述反应体系中nh4hco3的浓度可为1-20mm。所述反应体系中nh4hco3的浓度进一步可为2-10mm。
上述方法1中，所述方法还可包括：在所述孵育结束后向反应结束后的反应体系中加水。
更进一步，所述反应体系中所述待酶解物质与所述蛋白酶的质量比可为1:1。
所述孵育的温度可为35℃。
所述反应体系中nh4hco3的浓度可为5mm。
在本发明的一个实施例中采用的是1μl的反应体系，将反应体系直接点在384孔的靶板上，随着水分的蒸发，浓度变大，大约需要5分钟室温干燥成为固体附着在靶板的靶点上。由于靶板对蛋白质和酶的吸附以及还有一少部分的蛋白质没有酶解，还可通过滴加水使蛋白质和酶再一次溶解而蛋白质酶解更彻底。在向所述反应体系中加水时，可为向所述体积变小的反应体系中加水或向所述靶点上加水。所述加水的次数可为0-5次。在所述加水次数大于1时，每次加水时可在前一次所加水蒸发一部分或全部时进行。
上述方法中，所述反应体系可处于密闭的环境中，也可处于开放的环境中，在所述待酶解物质的酶解结束时，所述反应体系的体积无明显变化，将该方法记为方法2。方法2的反应体系下的酶解反应可通过增加所述待酶解物质与所述蛋白酶的接触机会进行，如摇晃和/或震动所述反应体系。
上述方法2中，所述反应体系的体积可大于等于1μl，如100μl。
上述方法2中，所述反应体系中所述待酶解物质与所述蛋白酶的质量比可为(1-10)：1。所述反应体系中所述待酶解物质与所述蛋白酶的质量比进一步可为(2-10)：1。所述反应体系中所述待酶解物质与所述蛋白酶的质量比更进一步可为(2:5)：1。
上述方法2中，所述孵育的温度可为25-39℃。所述孵育的温度进一步可为30-37℃。
上述方法2中，所述反应体系中nh4hco3的浓度可为10-50mm。
更进一步，所述反应体系中所述待酶解物质与所述蛋白酶的质量比可为2:1。
所述孵育的温度可为37℃。
所述反应体系中nh4hco3的浓度可为25mm。
上述方法中，所述蛋白质可为bsa、albumin、hemoglobin、has；所述糖蛋白可为fetuin或hrp。
上述方法中，所述蛋白酶具体可为tripsin。所述tripsin具体可为sigma-aldrich公司产品，货号为t1462，≥10000baeeunits/mg。
上述方法在蛋白质的鉴定、或目的肽段的获取、或蛋白质翻译后修饰位点的确定、或医学蛋白质检测中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述目的肽段可为糖肽或带有氨基酸位点突变肽段。
所述蛋白质翻译后修饰位点可为糖基化位点、甲基化位点或乙酰化位点等。
本发明的蛋白质酶解方法具有以下特点：1、操作简便，只要把酶和蛋白质混合在一起后直接点靶或是在溶液中混合即可，且需要额外的设备最少，有利于野外作业；2、酶解快速，5分钟即可完成；3、体积小或少量的蛋白质也可以进行酶解，如：2ng；4、可以酶解糖蛋白。本发明的方法可应用于需要蛋白质酶解的领域：如蛋白质的鉴定，获得特定的糖肽，鉴定带有突变氨基酸的肽段，用于研究糖基化、甲基化、乙酰化等的修饰位点的位置、医学蛋白质鉴定等。
附图说明
图1为nh4hco3浓度为1mm时的质谱图。
图2为nh4hco3浓度为2mm时的质谱图。
图3为nh4hco3浓度为5mm时的质谱图。
图4为nh4hco3浓度为10mm时的质谱图。
图5为nh4hco3浓度为20mm时的质谱图。
图6为孵育温度为25℃时的质谱图。
图7为孵育温度为30℃时的质谱图。
图8为孵育温度为35℃时的质谱图。
图9为孵育温度为37℃时的质谱图。
图10为孵育温度为39℃时的质谱图。
图11为bsa与tripsin的质量比为1:3时的质谱图。
图12为bsa与tripsin的质量比为1:2时的质谱图。
图13为bsa与tripsin的质量比为1:1时的质谱图。
图14为bsa与tripsin的质量比为1:0.5时的质谱图。
图15为bsa与tripsin的质量比为1:0.333时的质谱图。
图16为反应混合液中bsa与tripsin的浓度均为5ng/μl时的质谱图。
图17为反应混合液中bsa与tripsin的浓度均为5ng/μl且在采集数据前加1次水时的质谱图。
图18为反应混合液中bsa与tripsin的浓度均为5ng/μl且在采集数据前加2次水时的质谱图。
图19为反应混合液中bsa与tripsin的浓度均为5ng/μl且在采集数据前加3次水时的质谱图。
图20为albumin的酶解质谱图。
图21为hemoglobin的酶解质谱图。
图22为hsa的酶解质谱图。
图23为fetuin(糖蛋白)的酶解质谱图。
图24为hrp(糖蛋白)的酶解质谱图。
图25为液体中bsa与trypsin的质量比为2：1时的质谱图。
图26为液体中bsa与trypsin的质量比为1：1时的质谱图。
图27为液体中bsa与trypsin的质量比为5：1时的质谱图。
图28为液体中bsa与trypsin的质量比为10：1时的质谱图。
图29为常规方法的质谱图。
图30为常规方法直接点靶后，再加1次1μlh2o的质谱图。
各图中，横坐标均为质核比，纵坐标均为肽段质谱信号强度。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的tripsin为sigma-aldrich公司产品，货号为t1462，≥10000baeeunits/mg。
实施例1、靶板原位快速蛋白酶解
一、bsa的酶解
所用bsa为sigma-aldrich公司产品。
一)nh4hco3浓度的优化
1、称量100mg的bsa标准蛋白质，用100mlddh2o溶解，放入沸水中煮沸10分钟，然后放入冰水混合物里面冷却，得到1mg/ml变性bsa溶液；利用去离子水溶解tripsin，得到tripsin浓度为100ng/μl的tripsin水溶液；
2、将1mg/ml变性bsa溶液利用去离子水进行稀释，得到bsa浓度为100ng/μl的变性bsa溶液；将1μl100ng/μl的变性bsa溶液、1μl100ng/μl的tripsin水溶液、1μlnh4hco3浓度为50mm的nh4hco3水溶液和7μl去离子水迅速混匀，得到反应混合液，该反应混合液中，bsa和tripsin的浓度均为10ng/μl，二者的质量比为1:1，nh4hco3的浓度为5mm；
3、迅速取1μl步骤2的反应混合液作为酶解体系滴加到384孔质谱靶板上，放在35℃的普通空气环境下孵育5分钟，得到含有干燥酶解混合物的靶点；
4、在含有干燥酶解混合物的靶点上加入1μl20mg/mldhb，室温干燥；用maldi源的质谱(bruker公司，autoflexspeedmalditof)采集数据。
按照上述方法，将酶解体系中nh4hco3的浓度由5mm分别替换为1mm、2mm、10mm和20mm，其他步骤均不变，利用相同的质谱采集数据。酶解体系中nh4hco3浓度为1mm、2mm、5mm、10mm和20mm时的质谱图分别如图1-5所示，肽段质谱信号强度分别为2.1×104、2.3×104、2.9×104、1.65×104和1.4×104。结果表明，各nh4hco3浓度下均可实现对bsa的酶解，酶解体系中nh4hco3最佳浓度为5mm，此时酶解体系的ph为8.38。
二)最佳酶解温度的优化
按照步骤一)中1-4中的方法，将步骤3中的孵育温度由35℃分别替换为25、30、37和39℃，其他步骤均不变，利用相同的质谱采集数据。同一批次实验中，孵育温度为25、30、35℃、37和39℃时的质谱图分别如图6-10所示，孵育温度为25、30、37和39℃时的肽段质谱信号强度分别为1.45×104、1.55×104、1.65×104和1.35×104。结果显示，各温度浓度下均可实现对bsa的酶解，所用最佳孵育温度为35℃。
三)bsa与tripsin最佳比例的优化
按照步骤一)中1-4中的方法，将步骤1和2中tripsin水溶液中tripsin的浓度由100ng/μl分别替换为300ng/μl、200ng/μl、50ng/μl和33.3ng/μl(即反应混合液中bsa与tripsin的质量比由1:1分别替换为1:3、1:2、1:0.5和1:0.333)，其他步骤均不变，利用相同的质谱采集数据。bsa与tripsin的质量比分别为1:3、1:2、1:1、1:0.5和1:0.333时的质谱图分别如图11-15所示，bsa与tripsin的质量比分别为1:3、1:2、1:0.5和1:0.333时的肽段质谱信号强度分别为1.65×104、1.8×104、1.35×104和0.9×104。结果显示，各bsa与tripsin的质量比下，bsa均能得到酶解，bsa与tripsin的最佳质量比为1:1。
四)反应过程中加水对酶解的影响
1、利用去离子水溶解tripsin，得到tripsin浓度为50ng/μl的tripsin水溶液；
2、将步骤一)的1mg/ml变性bsa溶液利用去离子水进行稀释，得到bsa浓度为50ng/μl的变性bsa溶液；将1μl50ng/μl的变性bsa溶液、1μl50ng/μl的tripsin水溶液、1μlnh4hco3浓度为50mm的nh4hco3水溶液和7μl去离子水迅速混匀，得到反应混合液，该反应混合液中，bsa和tripsin的浓度均为5ng/μl，二者的质量比为1:1；
3、迅速取1μl步骤2的反应混合液滴加到384孔质谱靶板上，放在35℃的普通空气环境下孵育5分钟，得到含有干燥混合物的靶点；
4、在含有干燥混合物的靶点上加入1μl20mg/mldhb，室温干燥；
5、用maldi源的质谱(bruker公司，autoflexspeedmalditof)采集数据。
结果如图16所示，肽段质谱信号强度为6500。
按照上述方法，在步骤3结束后，向靶点上加1μlddh2o，干燥后，进行步骤4，室温干燥后用maldi源的质谱(bruker公司，autoflexspeedmalditof)采集数据。结果如图17所示，肽段质谱信号强度为1.15×104。
按照上述方法，在步骤3结束后，向靶点上加1μlddh2o，室温干燥后再向靶点上加1μlddh2o(即加两次水)，干燥后，进行步骤4，室温干燥后用maldi源的质谱(bruker公司，autoflexspeedmalditof)采集数据。结果如图18所示，肽段质谱信号强度为1.2×104。
按照上述方法，在步骤3结束后，向靶点上加1μlddh2o，室温干燥后再向靶点上加1μlddh2o，室温干燥后再向靶点上加1μlddh2o(即加三次水)，干燥后，进行步骤4，室温干燥后用maldi源的质谱(bruker公司，autoflexspeedmalditof)采集数据。结果如图19所示，肽段质谱信号强度为1.15×104。
上述结果表明，重复加水可使蛋白质进一步得到水解。
二、其他蛋白的酶解
按照步骤一中一)的1-4的方法，将bsa分别替换为albumin、hemoglobin、hsa、fetuin(糖蛋白)和hrp(糖蛋白)，其他步骤均不变，进行其他蛋白的酶解，结果如图20-24所示，结果表明，利用本发明的方法还可以对albumin、hemoglobin、hsa、fetuin(糖蛋白)和hrp(糖蛋白)进行酶解，实现对多种蛋白质的酶解。
其中，albumin(sigma-aldrich公司)、hemoglobin(sigma-aldrich公司)、hsa(sigma-aldrich公司)、fetuin(sigma-aldrich公司)(糖蛋白)均为sigma-aldrich公司产品；hrp(糖蛋白)为sigma-aldrich公司产品，货号为sre0082-5ku。
实施例2、液体中快速酶解蛋白质
1、称量200mg的bsa标准蛋白质，用100mlddh2o溶解，放入沸水中煮沸10分钟，然后放入冰水混合物里面冷却，得到2mg/ml变性bsa溶液；
2、将步骤1的2mg/ml变性bsa溶液利用去离子水进行稀释，得到400ng/μl的变性bsa溶液；取400ng/μl的变性bsa溶液25μl，向其中添加50μl50mm的nh4hco3水溶液和25μl200ng/μl的tripsin水溶液，混合均匀后(混合后得到的反应体系中bsa与tripsin的质量比为2:1，tripsin的浓度为50ng/μl，nh4hco3的浓度为25mm)在37℃和1200rpm(增加蛋白质和酶的接触机会，采用干式恒温器(thermo-shaker)进行)下，孵育5分钟，得到酶解产物。
3、步骤2酶解结束后，用水稀释酶解产物，得到酶解稀释产物(bsa的浓度为10ng/μl)，取1μl酶解稀释产物，向其中加0.5μl10％的tfa(三氟乙酸)终止酶解反应后点靶(即滴加到384孔质谱靶板上)，然后放入4℃冷却干燥。在含有干燥混合物的靶点上加入1μl20mg/mldhb，4℃冷却干燥；
4、用maldi源的质谱(bruker公司的autoflexspeedmalditof)采集数据，结果如图25所示。也可在步骤2结束后终止酶解反应进行液质联用(lc-ms)采集数据。
按照上述方法，将混合后的体系中tripsin的浓度50ng/μl分别替换为100ng/μl、20ng/μl和10ng/μl(即反应体系中bsa与tripsin质量比分别为1:1、5:1和10:1，其他步骤均不变，检测不同bsa与tripsin质量比下bsa的酶解情况，结果分别如图26-28所示，结果显示，各bsa与tripsin的质量比下bsa均能得到酶解，但当bsa与tripsin的质量比为2:1时bsa的酶解效果最好。
实施例3、本发明的酶解方法与传统酶解方法的对比
一、传统方法
1、称量200mg的bsa标准蛋白质，用100mlddh2o溶解，放入沸水中煮沸10分钟，然后放入冰水混合物里面冷却，得到2mg/ml变性bsa溶液。
2、将步骤1的2mg/ml变性bsa溶液利用去离子水进行稀释，得到20ng/μl的变性bsa溶液；取20ng/μl的变性bsa溶液25μl，向其中添加50μl50mmnh4hco3水溶液和25μl0.4ng/μl的tripsin水溶液，混合均匀后(混合后得到的反应体系中的bsa与tripsin的质量比为50:1，nh4hco3的浓度为25mm)在37℃和1200rpm的转速下，孵育12小时，得到酶解产物。
3、步骤2酶解结束后，取1μl酶解产物，向其中加0.5μl10％的tfa(三氟乙酸)终止酶解反应后点靶(即滴加到384孔质谱靶板上)，然后放入4℃冷却干燥。
4、用maldi源的质谱(bruker公司的autoflexspeedmalditof)采集数据，结果如图29所示。结果中基本无bsa的质谱信号。
二、本发明方法
1、称量100mg的bsa标准蛋白质，用100mlddh2o溶解，放入沸水中煮沸10分钟，然后放入冰水混合物里面冷却，得到1mg/ml变性bsa溶液；利用去离子水溶解tripsin，得到tripsin浓度为50ng/μl的tripsin水溶液；
2、将1mg/ml变性bsa溶液利用去离子水进行稀释，得到bsa浓度为50ng/μl的变性bsa溶液；将1μl50ng/μl的变性bsa溶液、1μl50ng/μl的tripsin水溶液、1μlnh4hco3浓度为50mm的nh4hco3水溶液和7μl去离子水迅速混匀，得到反应混合液，该反应混合液中，bsa和tripsin的浓度均为5ng/μl，二者的质量比为1:1，nh4hco3的浓度为5mm；
3、迅速取1μl步骤2的反应混合液作为酶解体系滴加到384孔质谱靶板上，放在35℃的普通空气环境下孵育5分钟，得到含有干燥酶解混合物的靶点；滴加1次1μlh2o，35℃干燥；
4、在含有干燥酶解混合物的靶点上加入1μl20mg/mldhb，室温干燥；用maldi源的质谱(bruker公司，autoflexspeedmalditof)采集数据。
结果如图30所示，结果显示，图中有质谱信号。表明，本发明的方法明显优于传统方法。