本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及基于crispr/cas9技术构建的lmna基因敲除的细胞系及其构建方法。
背景技术：
：近几年发展起来的crispr/cas9基因组定向编辑技术能够实现对基因组的特异性和精确敲除。基因组定向编辑技术可以导致目标位点的缺失、插入或替换。继zfn和talen技术之后，crispr/cas9系统已经迅速发展为第3代基因组编辑技术。crispr/cas9系统是crispr/cas系统ⅱ经过改造而成。与zfn和talen技术相比，crispr/cas9系统在设计、合成和筛选上都非常简便，而且易于操作、成本低、构建周期短并且可以实现同时对多个基因的编辑，成倍的提高对基因编辑的效率。lmna基因位于染色体的1q21.2-q21.3，基因组序列全长56.7kb，含有12个外显子，在10号外显子上选择性剪接产生2种mrna，分别编码lamina和laminc蛋白。这两种蛋白与lmnb基因编码的laminb蛋白共同组成细胞的核纤层（nuclearlamin）。核纤层紧贴于内层核膜（innernuclearmembrance）的内表面，它与中等纤维蛋白家族具有高度的同源性，在维持核膜完整性、提供染色体锚着位点、调节细胞的分化及核周期性的解体和重组装过程中发挥重要作用。lamina能与特定的结构蛋白相互作用,从而在核膜处形成复杂而牢固的网络结构,进一步增强了细胞核的稳定性。lamin还能够与众多转录因子相互作用，共同参与细胞内信号通路和转录的调控,对细胞的增殖、分化和凋亡等生命过程起重要的调控作用。近年来的研究表明，lmna基因突变与人类一系列疾病密切相关，这类疾病统称为核纤层病（laminopathy）。lmna基因突变主要导致以神经和肌肉症状为主要特征的疾病。worman和bonne报道了人lmna基因突变与扩张性心肌病、脂肪代谢障碍综合征、早衰综合征等疾病有关。目前对于lmna基因与疾病的关系的研究仍然不够充分，并且缺少相应的基因敲除细胞系，因此有必要提供lmna基因敲除的细胞模型，从而为科研提供必要的工具。技术实现要素：本发明一方面提供一种lmna基因敲除的细胞系。在一个实施方式中，该lmna基因敲除的细胞系是293t细胞。在一个实施方式中，该lmna基因敲除的细胞系是hepg2肿瘤细胞。本发明另一方面提供构建lmna基因敲除的细胞系的方法，所述方法基于crispr-cas9技术利用seqidno.1-4所示的两对grna或seqidno.7-10所示的两对grna构建的质粒载体转染待敲除细胞，经抗性筛选得到所述lmna基因敲除的细胞系。本发明另一方面提供一种质粒载体，其包含seqidno.1-4所示的两对grna或seqidno.7-10所示的两对grna。本发明再一方面提供所述质粒载体的应用，其用于基于crispr-cas9技术构建lmna基因敲除的细胞系。本发明利用发明人设计的grna成对引物能够精确且高效地敲除lmna基因，所提供的lmna基因敲除的细胞系能够为衰老和扩张性心肌病干预药物提供细胞模型，能够为lmna基因调控的相关基因影响细胞周期和凋亡提供对照细胞模型，并且能够为lmna基因与肿瘤发生发展和药物干预提供细胞模型。附图说明图1是lmna基因敲除的293t细胞pcr测序结果。图2是lmna基因敲除的hepg2细胞pcr测序结果。图3是蛋白免疫印迹结果：293twt为293t细胞的野生型，293tko为293t细胞lmna基因敲除后的细胞；hepg2wt为hepg2的野生型，hepg2ko为hepg2细胞lmna基因敲出后的细胞。具体实施方式实施例1lmna基因敲除的293t细胞系的构建(a)grna的设计以待敲除的lmna基因全序列为基础，发明人设计出了两对grna引物，分别为：grna7caccggcacgcagctcctggaagggt（seqidno.1），aaacacccttccaggagctgcgtgcc（seqidno.2），和grna8caccggcgccgtcatgagacccgac（seqidno.3），aaacgtcgggtctcatgacggcgcc（seqidno.4）。(b)载体构建(b1)酶切空质粒和凝胶纯化用限制性内切酶bbsi消化1ug质粒，37℃，30min：bbsi1ulpx4591ug10xbbsibuffer5ul灭菌水补至50ulqiaquick凝胶提取试剂盒消化过的质粒，凝胶纯化，并在eb中洗脱。(b2)磷酸化和退火grna反应体系：grna-f1ulgrna-r1ul10xt4ligationbuffer1ult4pnk（neb)0.5ulddh2o6.5ul参数设置：37℃，30min,95℃，5min,以5℃/min降至25℃(b3)质粒重组和转化筛选质粒重组反应体系：grna1ul酶切质粒50ngt4连接酶1.5ult4buffer1.5ul灭菌水补至15ul混匀，室温孵育10min，置于4℃冰箱连接过夜获得重组质粒。(b4)转化筛选：重组质粒转入感受态大肠杆菌，并筛选阳性克隆转化：在50μl新鲜配制的感受态细胞中加入重组质粒500ng，混匀。冰上放置30min。将管放到42℃循环水浴热冲击90s。取出，迅速冰浴5min。每管加800μllb液体培养基，37℃,220rpm慢摇复苏1h。将复苏好的菌液6000rpm室温离心3min，吸去700μl上清后，将剩余的上清与沉淀的菌体充分悬浮，然后涂布于含有氨苄青霉素的固体lb培养基上。将平板置于37℃培养箱中培养过夜。筛选：将阳性克隆挑出，做菌落pcr并进行琼脂糖凝胶电泳，并做平皿培养和lb液体培养，有目的片段的菌液作测序处理进一步验证。①取空白pcr管，编号，加5ul灭菌ddh20。②用接种针随机挑选转化板上单克隆，放入对应pcr管内，混匀。③接种针在含氨苄霉素抗性的空白lb琼脂糖平板上轻划2-3下，室温培养过夜后，4℃保存。④取扩增产物5ul，电泳检测是否得到目的片断。⑤挑选保种板上编号对应的阳性克隆进一步培养，挑少量菌落置于预先加入5~10ml含氨苄青霉素抗性的lb液体培养基的50ml离心管中,37℃(220rpm)孵育过夜。菌落pcr反应体系：试剂体积模版（pcr管菌液）已含菌液计为3.5ul引物（上）0.2ul引物（下）0.2ultaq酶0.1ul1xtaqbuffer1.5uldntps0.2ulddh204.3ul总计10ul引物（上）gagggcctatttcccatgat(seqidno.5)，引物（下）gggcgtacttggcatatgat(seqidno.6)扩增条件：94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃30s；72℃5min；16℃保温。(c)细胞转染把构建好的载体利用lipofectamine3000脂质体转染进目的细胞株。同时转染分别插入grna7与grna8的px459质粒，以提高剪切效率。10ul脂质体与250ul无血清培养基混匀，室温放置五分钟，5ug重组质粒与250ul无血清培养基混匀，室温静置五分钟，两种液体混匀，室温静置20分钟，加入培养孔。转染6~8小时后换完全培养基，24h后换液，加入嘌呤霉素（2.0ug/ml的筛选浓度），持续筛选3-4天，直到看到只剩下少数细胞贴壁生长。(d)挑单克隆：嘌呤霉素筛选，96孔板单个分选将嘌呤霉素筛选后的细胞用胰酶消化下来，有限稀释法稀释细胞，96孔板每孔加入100ul细胞悬液，显微镜观察，单个细胞的培养孔做好标记，到第五天是更换新鲜培养基，等细胞铺板80%以上消化细胞，一半提取dna测序验证，一半细胞换六孔板扩大培养。(e)测序验证嘌呤霉素筛选过后的细胞，测序验证。提取细胞基因组以及pcr检测细胞基因组的完整性。阳性测序结果如图1所示。pcr反应体系如下：试剂体积lataq酶0.5ul10*lataqbuffer5uldntps8ul模板dna0.5ugforwardprimer1ulreverseprimer1ul灭菌h2o补至50ulforwardprimertgatgacagacttgggctgg（seqidno.13）reverseprimeraccaatcgagagcaagcacc（seqidno.14）(f)蛋白免疫印记293t的野生型和突变型六孔板铺板24小时候后，ripa加pmsf裂解收集蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳后转pvdf膜。封闭后，相应一抗4°c孵育过夜，二抗室温1h。凝胶成像系统成像，结果如图3所示，可见敲除后无lamina蛋白表达。实施例2lmna基因敲除的hepg2细胞系的构建(a)grna引物设计以待敲除的lmna基因全序列为基础，发明人设计出了两对grna引物，分别为：grna5caccggttccgccagcagccgccggc(seqidno.7),aaacgccggcggctgctggcggaacc(seqidno.8)；以及grna6caccggagcgggagatggccgagatg(seqidno.9),aaaccatctcggccatctcccgctcc(seqidno.10)。(b)载体构建(b1)酶切空质粒和凝胶纯化用限制性内切酶bbsi消化1ug质粒，37℃，30min：bbsi1ulpx4591ug10xbbsibuffer5ul灭菌水补至50ulqiaquick凝胶提取试剂盒消化过的质粒，凝胶纯化，并在eb中洗脱。(b2)磷酸化和退火grna反应体系：grna-f1ulgrna-r1ul10xt4ligationbuffer1ult4pnk（neb)0.5ulddh2o6.5ul参数设置：37℃，30min,95℃，5min,以5℃/min降至25℃(b3)质粒重组和转化筛选质粒重组反应体系：grna1ul酶切质粒50ngt4连接酶1.5ult4buffer1.5ul灭菌水补至15ul混匀，室温孵育10min，置于4℃冰箱连接过夜获得重组质粒。(b4)转化筛选：重组质粒转入感受态大肠杆菌，并筛选阳性克隆转化：在50μl新鲜配制的感受态细胞中加入重组质粒500ng，混匀。冰上放置30min。将管放到42℃循环水浴热冲击90s。取出，迅速冰浴5min。每管加800μllb液体培养基，37℃,220rpm慢摇复苏1h。将复苏好的菌液6000rpm室温离心3min，吸去700μl上清后，将剩余的上清与沉淀的菌体充分悬浮，然后涂布于含有氨苄青霉素的固体lb培养基上。将平板置于37℃培养箱中培养过夜。筛选：将阳性克隆挑出，做菌落pcr并进行琼脂糖凝胶电泳，并做平皿培养和lb液体培养，有目的片段的菌液作测序处理进一步验证。①取空白pcr管，编号，加5ul灭菌ddh2o。②用接种针随机挑选转化板上单克隆，放入对应pcr管内，混匀。③接种针在含氨苄霉素抗性的空白lb琼脂糖平板上轻划2-3下，室温培养过夜后，4℃保存。④取扩增产物5ul，电泳检测是否得到目的片断。⑤挑选保种板上编号对应的阳性克隆进一步培养，挑少量菌落置于预先加入5~10ml含氨苄青霉素抗性的lb液体培养基的50ml离心管中,37℃(220rpm)孵育过夜。菌落pcr反应体系：试剂体积模版（pcr管菌液）已含菌液计为3.5ul引物（上）0.2ul引物（下）0.2ultaq酶0.1ul1xtaqbuffer1.5uldntps0.2ulddh2o4.3ul总计10ul引物（上）gagggcctatttcccatgat(seqidno.5)引物（下）gggcgtacttggcatatgat(seqidno.6)扩增条件：94℃5min；94℃30s；55℃30s；72℃30s；72℃5min；16℃保温。(c)细胞转染把构建好的载体利用lipofectamine3000脂质体转染进目的细胞株。同时转染分别插入grna5与grna6的px459质粒，以提高剪切效率。10ul脂质体与250ul无血清培养基混匀，室温放置五分钟，5ug重组质粒与250ul无血清培养基混匀，室温静置五分钟，两种液体混匀，室温静置20分钟，加入培养孔。转染6~8小时后换完全培养基，24h后换液，加入嘌呤霉素（1.5ug/ml的筛选浓度），持续筛选3-4天，直到看到只剩下少数细胞贴壁生长。(d)挑单克隆嘌呤霉素筛选，96孔板单个分选：将嘌呤霉素筛选后的细胞用胰酶消化下来，有限稀释法稀释细胞，96孔板每孔加入100ul细胞悬液，显微镜观察，单个细胞的培养孔做好标记，到第五天是更换新鲜培养基，等细胞铺板80%以上消化细胞，一半提取dna测序验证，一半细胞换六孔板扩大培养。(e)测序验证嘌呤霉素筛选过后的细胞，测序验证。提取细胞基因组以及pcr检测细胞基因组的完整性。阳性测序结果如图2所示。pcr反应体系如下：试剂体积lataq酶0.5ul10*lataqbuffer5uldntps8ul模板dna0.5ugforwardprimer1ulreverseprimer1ul灭菌h2o补至50ulforwardprimertctggggaagctctgattgc（seqidno.11）reverseprimeragtgggggtctagtcaaggc（seqidno.12）(f)蛋白免疫印记hepg2的野生型和突变型六孔板铺板24小时候后，ripa加pmsf裂解收集蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳后转pvdf膜。封闭后，相应一抗4°c孵育过夜，二抗室温1h。凝胶成像系统成像，结果如图3所示，可见敲除后无lamina蛋白表达。sequencelisting<110>广西医科大学<120>基于crispr/cas9技术构建的lmna基因敲除的细胞系<130>17983cn<160>14<170>patentinversion3.5<210>1<211>26<212>dna<213>人工序列<400>1caccggcacgcagctcctggaagggt26<210>2<211>26<212>dna<213>人工序列<400>2aaacacccttccaggagctgcgtgcc26<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列<400>3caccggcgccgtcatgagacccgac25<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列<400>4aaacgtcgggtctcatgacggcgcc25<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5gagggcctatttcccatgat20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6gggcgtacttggcatatgat20<210>7<211>26<212>dna<213>人工序列<400>7caccggttccgccagcagccgccggc26<210>8<211>26<212>dna<213>人工序列<400>8aaacgccggcggctgctggcggaacc26<210>9<211>26<212>dna<213>人工序列<400>9caccggagcgggagatggccgagatg26<210>10<211>26<212>dna<213>人工序列<400>10aaaccatctcggccatctcccgctcc26<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11tctggggaagctctgattgc20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<400>12agtgggggtctagtcaaggc20<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列<400>13tgatgacagacttgggctgg20<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<400>14accaatcgagagcaagcacc20当前第1页12