一种用于检测汞的生物传感器及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种用于检测汞的生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术：

自20世纪80年代以来，随着我国城市化进程的加速，工农业的飞速发展，水污染状况日趋严重。在排入水体的大量环境污染物中，重金属污染的危害尤为严重。目前中国由于在重金属的开采、冶炼、加工过程中，造成不少重金属如铅、汞、镉、钴等进入大气、水、土壤中，引起严重的环境污染。重金属对环境的污染主要表现在水污染中。随废水排出的重金属，即使浓度小，也可在藻类和底泥中积累，被鱼和贝类体表吸附，产生食物链浓缩，从而造成公害。重金属在人体内能和蛋白质及各种酶发生强烈的相互作用，使它们失去活性，也可能在人体的某些器官中富集，如果超过人体所能耐受的限度，会造成人体急性中毒、亚急性中毒、慢性中毒等，对人体会造成很大的危害，例如，日本发生的水俣病(汞污染)和骨痛病(镉污染)等公害病，都是由重金属污染引起的。

汞是一类具有高毒性的重金属污染物，广泛存在于环境中。即使低浓度的汞离子也能通过水、食物链等途径富集在人体内，导致对中枢神经系统、消化系统以及肾脏等的不可逆转的损害。为此，美国环境保护署规定饮用水中汞离子的最大污染水平为10nm。常见的汞离子的检测方法有原子吸收光谱、原子放射光谱、电感耦合等离子体质谱等方法，尽管这些方法拥有高灵敏性和选择性，但是仪器本身昂贵且不便携，此外，还需要进行复杂的样品预处理、专业的技术操作等。因此，研究出一种快速、简便、低成本、高灵敏性的汞离子检测手段具有十分重要的意义。

现今，电化学及生物学检测技术日益发展成熟，这为环境样品中重金属离子的快速检测提供了各种可行的技术手段。其中，运用生物传感器来检测环境中的重金属、病原微生物、有毒有机物时，生物传感器具有特异性强、检测灵敏度高、检测效率高、成本低廉的特点，因此成为了环境保护工作中的一个研究热点。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种使用寿命长、抗干扰能力强、检测精度和效率高的用于检测汞的生物传感器，此外相应提供一种方法简单、成本低廉、制作快速的生物传感器的制备方法，在此基础上，还提供一种前述生物传感器的应用，该应用能够以低成本、操作简单、快速响应、高检测精度及较强抗干扰性等特点实现对汞离子的高效检测。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。

一种用于检测汞的生物传感器，包括一在三电极系统中用作工作电极的玻碳电极，所述玻碳电极的反应端表面修饰有氮硫共掺杂有序介孔碳，所述氮硫共掺杂有序介孔碳表面修饰有金纳米粒子，所述金纳米粒子表面自组装有巯基修饰的探针p1，所述探针p1为具有seqidno.1所示的核苷酸序列，所述生物传感器还包括二茂铁标记的探针p2，当hg²⁺存在时，探针p1与探针p2通过t-hg²⁺-t错配形成双链dna结构，所述探针p2为具有seqidno.2所示的核苷酸序列。

上述的生物传感器中，巯基修饰后的探针p1的核苷酸序列为seqidno.1所示的核苷酸序列，巯基修饰后的探针p1具体为：

5'-sh-(ch2)6-ggcgacgttttgtcgcc-3'；

二茂铁标记的探针p2的核苷酸序列为seqidno.2所示的核苷酸序列，二茂铁标记的探针p2具体为：

5'-gacttttcgtgcgg-(ch2)6-fc-3'(fc＝ferrocene)。

上述的生物传感器中，在汞离子不存在时，dna探针p1通过碱基配对形成发夹结构，稳定的连接在玻碳电极反应端表面；在汞离子存在时，dna探针p1与二茂铁标记的dna探针p2通过t-hg²⁺-t错配形成双链，此时，dna探针p1的发夹结构被打开，二茂铁信号分子端接近电极表面，引起氧化电流的变化。随着汞离子浓度的增加，接近电极表面的二茂铁信号分子数量也增加，我们可以通过分析汞离子浓度和由二茂铁引起的氧化电流的变化的关系而实现对汞离子的高效检测。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种用于检测汞的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

s1、修饰氮硫共掺杂有序介孔碳：准备一玻碳电极，将氮硫共掺杂有序介孔碳分散在全氟磺酸nafion中，然后滴涂于所述玻碳电极的反应端表面，得到氮硫共掺杂有序介孔碳修饰的玻碳电极；

s2、修饰金纳米粒子：在所述氮硫共掺杂有序介孔碳修饰的玻碳电极的反应端表面电沉积金纳米粒子，得到金纳米粒子/氮硫共掺杂有序介孔碳修饰的玻碳电极；

s3、组装探针p1：在所述金纳米粒子/氮硫共掺杂有序介孔碳修饰的玻碳电极的反应端表面滴加巯基修饰的探针p1，巯基修饰的探针p1通过金硫共价键固定在所述金纳米粒子/氮硫共掺杂有序介孔碳修饰的玻碳电极的反应端表面，得到组装有巯基修饰的探针p1的金纳米粒子/氮硫共掺杂有序介孔碳修饰的玻碳电极；

s4、准备探针p2：准备二茂铁标记的探针p2溶液，用于将组装有巯基修饰的探针p1的金纳米粒子/氮硫共掺杂有序介孔碳修饰的玻碳电极浸泡在二茂铁标记的探针p2溶液中培养，使当hg²⁺存在时探针p1与探针p2通过t-hg²⁺-t错配结构连接，完成用于检测汞的生物传感器的制备。

上述的用于检测汞的生物传感器的制备方法中，优选的，所述步骤s1中，所述氮硫共掺杂有序介孔碳与全氟磺酸的质量体积比为50mg～100mg∶5ml～10ml，所述分散为超声分散，所述超声分散的时间为2h～4h；

上述的用于检测汞的生物传感器的制备方法中，优选的，所述氮硫共掺杂有序介孔碳主要由以下方法制备得到：

s1-1、合成硅基分子筛sba-15：将嵌段共聚物p123和正硅酸四乙酯置于盐酸溶液中在35℃～40℃水浴条件下搅拌均匀，嵌段共聚物p123与正硅酸四乙酯的质量比为1∶2～3，然后在85℃～135℃下晶化，再在550℃～800℃下焙烧，得到硅基分子筛sba-15；

s1-2、合成氮硫共掺杂有序介孔碳：将所得硅基分子筛sba-15与双硫腙、四氯化碳混合并超声分散2h～4h，介孔分子筛sba-15与双硫腙的质量比为1∶1～1.25，将所得混合物在常温下搅拌10h～12h，然后升温至60℃～100℃进行聚合，聚合时间为6h～12h，再将聚合产物在惰性气体保护下，在600℃～900℃下进行高温热解，得到热解产物，将所得热解产物加入氢氧化钠溶液中进行搅拌刻蚀、洗涤和干燥，得到氮硫共掺杂有序介孔碳。

上述的用于检测汞的生物传感器的制备方法中，优选的，所述步骤s2中，将氮硫共掺杂有序介孔碳修饰的玻碳电极放入氯金酸水溶液中，采用循环伏安法将金纳米粒子电沉积在所述氮硫共掺杂有序介孔碳修饰的玻碳电极的反应端表面，所述循环伏安法中扫描电位为0～1.6v，扫描速率为20mv/s～50mv/s，扫描圈数为3圈～6圈。

上述的用于检测汞的生物传感器的制备方法中，优选的，所述步骤s3的具体过程为：将10μl～20μl巯基修饰的探针p1滴加在所述金纳米粒子/氮硫共掺杂有序介孔碳修饰的玻碳电极的反应端表面，在4℃下反应10h～12h，再转入6-巯基己醇溶液中培养1h～2h，得到组装有巯基修饰的探针p1的金纳米粒子/氮硫共掺杂有序介孔碳修饰的玻碳电极；

和/或，所述步骤s4中，所述培养的时间为1h～2h。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的用于检测汞的生物传感器或者上述的制备方法制得的用于检测汞的生物传感器在检测汞中的应用。

上述的应用中，优选的，所述应用包括以下步骤：

(1)将组装有巯基修饰的探针p1的金纳米粒子/氮硫共掺杂有序介孔碳修饰的玻碳电极浸泡在含有汞离子和二茂铁标记的探针p2的磷酸盐缓冲溶液中60min～120min，取出冲洗后浸泡在磷酸盐缓冲溶液中，用差分脉冲伏安法进行测量，其中，二茂铁是作为信号分子使用的；

(2)根据汞离子浓度与电流差的变化构建线性回归方程，根据线性回归方程即可测定待测溶液中的汞离子浓度。

上述的应用中，优选的，所述汞离子浓度与电流差的变化的线性回归方程为：

y＝(-0.43393±0.01518)x+(5.85393±0.13994)(1)

式(1)中，y为汞离子检测时不同浓度的hg²⁺和空白样之间的电流峰值差值，即δi，单位为μa；x为待测溶液中汞离子浓度值的对数负值，即-lg[hg²⁺]，单位为m；式(1)的相关系数r²＝0.9927，汞离子检测线性范围为0.001nm～1000nm，检出限为0.45pm。

上述的应用中，优选的，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为10mm，所述磷酸盐缓冲溶液中还包含有0.5m～1m的氯化钠。

本发明中，浓度单位中的m指mol/l。

本发明的主要创新点在于：

1、本发明的生物传感器采用了氮硫共掺杂有序介孔碳修饰玻碳电极，氮硫共掺杂有序介孔碳本身具有巨大的比表面积，此外，由于氮、硫元素的掺杂引起碳材料中相邻原子间的自旋密度和电荷密度再分配，使得该材料具有大量的活性位点、催化性能显著提高以及具有更高的电子转移速率，很大程度上提高了该材料电化学检测性能，使得生物传感器的汞离子检测线性范围在0.001nm～1000nm，检出限为0.45pm，而现有常规生物传感器检测线性范围通常较窄，检出限通常达不到pm水平，本发明明显优于现有技术。

2、本发明的生物传感器采用全氟磺酸作为黏附剂将氮硫共掺杂有序介孔碳稳定的连接在裸玻碳电极表面，全氟磺酸本身导电性良好，在防止材料掉落的同时并不会对有序介孔碳材料的导电性能有负面影响，能够大大提高本发明生物传感器的检测灵敏性。

3、本发明在制备氮硫共掺杂有序介孔碳材料的过程中，采用了介孔分子筛sba-15的合成、氮硫共掺杂有序介孔碳的聚合、高温热解以及模板刻蚀工艺，其中，聚合工艺主要是使sba-15与双硫腙发生聚合，使得氮、硫元素能够成功的掺杂进有序介孔碳材料中，在聚合工艺中，还特意采用超声分散，目的是使双硫腙(氮、硫元素提供源)能够充分填充进sba-15的孔道中，提高材料介孔结构成型的成功率。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明提供的用于检测汞的生物传感器具有优化的微观结构。首先，将玻碳电极用氮硫共掺杂有序介孔碳修饰，使金纳米粒子能够更多的固定在修饰电极表面，使得金纳米粒子的分布更加均匀，同时也提高了传感器的使用寿命；其次，金纳米粒子具有优越的电子传递能力和导电性能，能够显著提高生物传感器和待测溶液间电子的转移速度；此外，电沉积的金纳米粒子为探针p1提供了结合位点，使得探针p1通过金硫共价键(au-s)能够稳定的固定在玻碳电极上，对生物传感器起到了协同增效作用，大大提高了生物传感器的稳定性、重复性和传感器结构的可靠性，同时也提高了生物传感器的检测水平。

(2)本发明提供的用于检测汞的生物传感器特异性强、检测精度高、效率高、成本低廉，可以实现对汞离子的高效检测，对汞离子检测线性范围为0.001nm～1000nm，检出限为0.45pm。

(3)本发明的生物传感器的制备方法不仅步骤简单、成本合理，且制作效率高。

(4)本发明采用生物传感器检测重金属汞离子的应用方法是：在汞离子不存在时，dna探针p1通过碱基配对形成发夹结构，稳定的连接在玻碳电极反应端表面；在汞离子存在时，dna探针p1与二茂铁标记的dna探针p2通过t-hg²⁺-t错配形成双链，此时，dna探针p1的发夹结构被打开，二茂铁信号分子端接近电极表面，引起氧化电流的变化。随着汞离子浓度的增加，接近电极表面的二茂铁信号分子数量也增加，我们可以通过分析汞离子浓度和由二茂铁引起的氧化电流的变化的关系而实现对汞离子的高效检测。

附图说明

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

图1为本发明实施例2中生物传感器的制备过程示意图。

图2为本发明实施例2中的氮硫共掺杂有序介孔碳的扫描电镜图。

图3为本发明实施例2中的氮硫共掺杂有序介孔碳的能谱图。

图4为本发明实施例2中的氮硫共掺杂有序介孔碳的透射电镜图。

图5为本发明实施例3中hg²⁺溶液浓度与差分脉冲伏安曲线的电流差的线性回归曲线图。

图6为本发明实施例4的生物传感器检测的再现性图。

图7为本发明实施例5的生物传感器检测不同重金属离子得到的选择性图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。

实施例1：

一种用于检测汞的生物传感器，包括在三电极系统中用作工作电极的玻碳电极，玻碳电极的反应端表面修饰有氮硫共掺杂有序介孔碳，氮硫共掺杂有序介孔碳表面修饰有金纳米粒子，金纳米粒子表面自组装有巯基修饰的探针p1，探针p1为具有seqidno.1所示的核苷酸序列，生物传感器还包括二茂铁标记的探针p2，当hg²⁺存在时，探针p1与探针p2可通过t-hg²⁺-t错配形成双链dna结构，探针p2为具有seqidno.2所示的核苷酸序列。

巯基修饰后的探针p1的核苷酸序列为seqidno.1所示的核苷酸序列，巯基修饰后的探针p1具体为：

5'-sh-(ch2)6-ggcgacgttttgtcgcc-3'；

二茂铁标记的探针p2的核苷酸序列为seqidno.2所示的核苷酸序列，二茂铁标记的探针p2具体为：

5'-gacttttcgtgcgg-(ch2)6-fc-3'(fc＝ferrocene)。

当待测水体中不存在汞离子时，探针p1通过碱基配对形成发夹结构，稳定的连接在玻碳电极反应端表面；当待测水体中存在汞离子时，探针p1与二茂铁标记的探针p2通过t-hg²⁺-t错配形成双链，此时，探针p1的发夹结构被打开，二茂铁信号分子端接近电极表面，引起氧化电流的变化。随着汞离子浓度的增加，接近电极表面的二茂铁信号分子数量也增加，我们可以通过分析汞离子浓度和由二茂铁引起的氧化电流的变化的关系而实现对汞离子的高效检测。

实施例2

一种本发明的用于检测汞的生物传感器的制备方法，如图1所示，采用该制备方法可制备得到实施例1的生物传感器，该方法包括以下步骤：

s1、修饰氮硫共掺杂有序介孔碳：制作一玻碳电极，将50mg氮硫共掺杂有序介孔碳加入5ml全氟磺酸nafion中超声分散2h，然后逐滴滴加到玻碳电极反应端的表面，得到氮硫共掺杂有序介孔碳修饰的玻碳电极。

氮硫共掺杂有序介孔碳是按照以下方法制备得到：

s1-1、合成硅基分子筛sba-15：将嵌段共聚物p123置于盐酸中溶解得到嵌段共聚物p123溶液，然后将正硅酸四乙酯逐滴加入嵌段共聚物p123溶液中，在35℃下水浴搅拌24h，再转移至聚四氟乙烯衬底的高温高压反应釜中，在100℃条件下水浴加热24h得到混合液，将混合液抽滤取沉淀，用去离子水洗涤至中性，风干，再放入管式炉中以5℃/min的升温速率升温至550℃并保持5h，得到硅基分子筛sba-15；

s1-2、合成氮硫共掺杂有序介孔碳：取1g上述硅基分子筛sba-15和1g双硫腙加入到15mlccl4中，将所得混合物超声分散2h后，在常温下再搅拌10h，然后将混合物置于60℃的真空烘箱中聚合12h，溶剂全部蒸发干之后，所得的聚合产物(黑褐色)在高纯氮气流中以2℃/min的加热速率升温至设定温度800℃(600℃、700℃、780℃、900℃均可实施)并保持2个小时得到热解产物。将所得热解产物在80℃下置于80ml、2mol/l的naoh溶液中搅拌一小时后过滤，然后更换新的naoh溶液重复前述步骤三次，以刻蚀去除介孔分子筛sba-15模板，随后用超纯水洗涤到中性，干燥后，获得氮硫共掺杂有序介孔碳。

s2、修饰金纳米粒子：将氮硫共掺杂有序介孔碳修饰的玻碳电极放入质量分数为0.1％的氯金酸水溶液中，采用循环伏安法将金纳米粒子电沉积在氮硫共掺杂有序介孔碳修饰的玻碳电极的反应端表面，循环伏安法中扫描电位为0～1.6v，扫描速率为50mv/s，扫描圈数为3圈，得到金纳米粒子/氮硫共掺杂有序介孔碳修饰的玻碳电极。

s3、组装探针p1：在金纳米粒子/氮硫共掺杂有序介孔碳修饰的玻碳电极的反应端表面滴加10μl、1μm巯基修饰的探针p1，在4℃下反应12h，使巯基修饰的探针p1能够充分固定在复合膜修饰的玻碳电极的反应端表面，得到组装有巯基修饰的探针p1的金纳米粒子/氮硫共掺杂有序介孔碳修饰的玻碳电极。用磷酸盐缓冲溶液(pbs)冲洗前述组装有巯基修饰的探针p1的金纳米粒子/氮硫共掺杂有序介孔碳修饰的玻碳电极，然后再浸泡在1mm的6-巯基己醇溶液中培养1h，用pbs溶液冲洗后，干燥待用。6-巯基己醇能够对复合膜修饰电极的表面进行封端，减少巯基修饰的探针p1的非特异性吸附并且让探针p1稳定的立在电极表面。

s4、准备二茂铁标记的探针p2溶液，完成用于检测汞的生物传感器的制备。将上述组装有巯基修饰的探针p1的金纳米粒子/氮硫共掺杂有序介孔碳修饰的玻碳电极浸泡在含有1μm二茂铁标记的探针p2和不同浓度的汞离子的pbs溶液中，在37℃水浴锅中培养1h，然后取出反应完成的玻碳电极，用pbs溶液冲洗，干燥后待用。

图2为本实施例所得氮硫共掺杂有序介孔碳的扫描电镜图，从图2可知，氮硫共掺杂有序介孔碳呈长带形，孔道结构规整有序的排列，这说明氮硫共掺杂有序介孔碳很好地复制了介孔分子筛sba-15的结构。

图3为本实施例氮硫共掺杂有序介孔碳的能谱图，从图3可知，c、n、o、s元素均存在于样品中，这说明s、n元素成功的掺杂进有序介孔碳结构当中。

图4为本实施例氮硫共掺杂有序介孔碳的透射电镜图，从图4可知，该材料内部孔径均匀有序，孔径直径约为8nm。

实施例3

一种本发明的用于检测汞的生物传感器在检测汞中的应用，该生物传感器具体为实施例1的生物传感器，也是实施例2制备得到的生物传感器。应用包括以下步骤：

(1)以生物传感器的玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，将三个电极与电化学工作站连接，建立三电极系统。

(2)将复合膜修饰的玻碳电极浸泡在hg²⁺浓度分别为0m、0.001nm、0.01nm、0.1nm、1nm、10nm、100nm、1000nm和10000nm的hg²⁺的pbs缓冲溶液中1h，取出用pbs溶液冲洗、干燥后，置于10mm的pbs溶液中以相同的方式测试差分脉冲伏安曲线。

(3)根据汞离子浓度与电流差的变化构建线性回归方程。

图5是hg²⁺溶液浓度与差分脉冲伏安曲线的电流差的线性回归曲线图，从图5中可知，汞离子浓度与电流差的变化的线性回归方程为：

y＝(-0.43393±0.01518)x+(5.85393±0.13994)(1)

式(1)中，y为汞离子检测时不同浓度的hg²⁺和空白样之间的电流峰值差值，即δi，单位为μa；x为待测溶液中汞离子浓度值的对数负值，即-lg[hg²⁺]，单位为m；式(1)的相关系数r²＝0.9927，汞离子检测线性范围为0.001nm～1000nm，检出限为0.45pm(检出限按照3倍空白样的标准偏差计算)。

实施例4

对用于检测汞的生物传感器的再现性进行检查。

为了验证实施例1的生物传感器及其检测方法的检测效果，按照实施例2的制备方法制备5个生物传感器，将5个生物传感器用于检测同一浓度的汞离子(汞离子浓度为1nm)，检测结果参见图6。从图6中可知，5个生物传感器检测同一浓度的汞离子，相对标准偏差为1.9％，表明按照实施例2的制备方法制备的生物传感器有较好的再现性。

实施例5

对用于检测汞的生物传感器的选择性进行检查。

为了进一步验证实施例1的生物传感器的高选择性，现将1nm的hg²⁺以及20nm的k⁺、pb²⁺、cu²⁺、cd²⁺、mg²⁺、fe³⁺、zn²⁺、ca²⁺和al³⁺溶液用实施例1的生物传感器进行测定(测定方法参照实施例3)，测定结果如图7所示，图7中的mix指的是包括hg²⁺在内的所有干扰离子的混合溶液。

从图7中可知，实施例1的生物传感器对hg²⁺选择性高，不受k⁺、pb²⁺、cu²⁺、cd²⁺、mg²⁺、fe³⁺、zn²⁺、ca²⁺和al³⁺等其他污染物的干扰。

实施例6

用于检测汞的生物传感器的实样检测。

取当地湘江水和自来水分别配制3组不同汞离子浓度的待测溶液，分别用原子荧光光谱法和实施例1的生物传感器进行实样测定(测定方法参照实施例3)。

具体的实验步骤：取长沙当地湘江水以及自来水，经过过滤等一系列预操作后，将河水和自来水平均分为三份，配制成浓度分别为1nm、10nm和50nm的待测溶液。分别用原子荧光光谱法和实施例1的生物传感器检测待测溶液中的汞离子浓度，结果列于表1中。

表1由该生物传感器和原子荧光光谱法对实际环境样品中hg²⁺的检测结果

从表1中可以直观的看出，两种检测方法的检测结果基本相似。说明本发明制备用于检测汞的的生物传感器具有很大的应用潜力。此外，与原子荧光光谱法相比，本发明的生物传感器还具有一些突出的优点：操作简单、仪器可便携以及不需要专业的技术操作等。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

序列表

<110>湖南大学

<120>一种用于检测汞的生物传感器及其制备方法和应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(无)

<400>1

ggcgacgttttgtcgcc17

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<211>14

<212>dna

<213>人工序列(无)

<400>2

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