本发明涉及一种扩增检测玉米dek33基因用分子标记的特异性引物组及其应用。
技术背景
玉米（zeamaysl)属于禾本科玉蜀黍属玉米种，为一年生草本植物，是世界三大粮食作物之一。据fao统计，从1998年开始，玉米的总产量已超过小麦和水稻成为全球第一大粮食作物,并且与其他两大主要的谷类作物产量差距逐年拉大。同时，随着世界经济的发展，玉米的需求量却在不断增加，预计到2017年，全球玉米和小麦的年产量需要再增加2亿吨才能满足全世界的需求。玉米是“饲料之王”，对畜牧业和养殖业的发展具有举足轻重的作用。我国目前的玉米消费量和产量均为世界第二，并且产量和需求一直在不断的增长中。因此，这对玉米产量和品质的改良与创新提出了更高的要求。
除了产量，玉米的主要生产性状还表现在营养价值这一方面。玉米籽粒包含三大有机营养成分：70-75%的淀粉，8-10%的蛋白和4-5%的油脂。淀粉产品是玉米的主要商业产品，蛋白质和油脂产品往往是淀粉产业的副产品。通常，玉米胚乳蛋白，以蛋白体的形式进行蛋白储藏，其中70%的成分是醇溶蛋白，也称作玉米蛋白(zein)。而油脂作为玉米籽粒的重要营养成分之一，主要储藏于胚和胚乳糊粉层中。然而，大多数玉米籽粒突变体表现为蛋白品质的改善。其中，以opaque2的突变尤为显著，赖氨酸含量增加接近2倍。研究表明得益于非醇溶蛋白对醇溶蛋白比例的增加。而针对油脂含量调控的玉米籽粒突变体尚发现较少。
dek33是一个调控油脂含量的籽粒突变体。对dek33突变体的遗传学分析表明：dek33是单基因控制的隐性突变，能够引起玉米籽粒的不透明（opaque）性状（参见图1）。对dek33突变体的生化分析显示与野生型籽粒相比，dek33突变体籽粒中油脂含量降低(参见图2)。dek33基因至今尚未通过杂交育种被很好地利用，主要是因为dek33由隐性基因突变引起，通过杂交选育需要较长的时间。dna分子标记辅助育种是一项新的育种技术，该技术是通过利用与目标性状基因紧密连锁的dna分子标记对控制目标性状的基因进行间接选择的现代育种技术。该技术对目标基因的转移，不仅可在早期进行准确、稳定的选择，而且可克服再度利用隐性基因识别难的问题，从而加速育种进程，提高育种效率。与常规育种相比，该技术可提高育种效率2-3倍。
dna分子标记辅助育种技术的关键是：（1）获得的分子标记应该是能够区分育种过程中杂交亲本（纯合dek33类型和纯合野生型类型）以及它们杂交子代（f1代）的共显性引物组；（2）获得的共显性分子标记（即引物组）与控制目标性状基因的连锁情况，连锁越紧密在其后代中错选的概率越低，如果该标记来源于控制目标性状基因，则利用该分子标记在其后代中错选的概率为零；（3）该标记可以区分突变体与国内所有主要育种亲本。以往研究中并没有获得位于dek33基因上并且与其完全连锁的共显性dna分子标记（即引物组），故无法对该基因所控制的目标性状进行dna分子标记辅助选择，同时，以往也未获得能够区分突变体与国内所有主要育种亲本的分析标记。所以，对于该种标记的获得和鉴定是对控制玉米籽粒高油脂含量农艺性状的dek33基因进行dna分子标记辅助育种的基础。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种扩增检测玉米dek33基因用分子标记的特异性引物组。
本发明的目的之二在于提供该特异性引物组在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本中的应用。
本发明的目的之三在于提供该特异性引物组在检测和区分野生型自交系w22、昌7-2、郑58、b73和mo17类型以及他们杂交子代类型中的应用。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种扩增检测玉米dek33基因用分子标记的特异性引物组，其特征在于该特异性引物组中扩增该dek33基因左侧dna片段的一对特异性引物的碱基序列为：
正向引物从5′端至3′端为：ctacaggaagagcacaagcg；
反向引物从5′端至3′端为：ggcagaagaacgacaaggaa；
扩增该dek33基因右侧dna片段的一对特异性引物的碱基序列为：
正向引物从5′端至3′端为：aaatcaacggggagagccg；
反向引物从5′端至3′端为：ggtcggacacacattggtta。
一种上述的扩增检测玉米dek33基因用分子标记的特异性引物组在在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本以及它们杂交子代类型中的应用。
一种上述的扩增检测玉米dek33基因用分子标记的特异性引物组在检测和区分野生型自交系w22、昌7-2、郑58、b73和mo17类型以及他们杂交子代类型中的应用。
本发明提供的2个位于dek33基因染色体物理位置两侧的与其紧密连锁的共显性dna特异性引物组，以及利用这两个共显性dna特异性引物组对dek33基因进行分子标记辅助选择的方法。利用这两个特异性引物组能对玉米任何时期和任何组织的dna进行基因型鉴定，检测杂交育种子代各单株中dek33基因的存在与否以及杂合或纯合状态。这种检测方法的准确性高，操作简单，为利用dek33基因的dna分子标记辅助育种提供重要的技术手段。
附图说明
图1是dek33纯合突变体（dek33/dek33）和野生型(dek33/＋或＋/＋)籽粒宏观表型；
图2是dek33纯合突变体籽粒与野生型相比油脂含量的变化图；
图3是用于dek33基因克隆的f2群体构建路线；
图4是标记ac208.4在w64a背景f2群体中的分离情况，dek33/dek33为纯合突变体；dek33/＋是杂合体；＋/＋为纯合野生型；
图5是标记ac211.14在w64a背景f2群体中的分离情况，dek33/dek33为纯合突变体；dek33/＋是杂合体；＋/＋为纯合野生型；
图6是本发明中分子标记在玉米5号染色体短臂上的示意位置，其中cen5代表5号染色体着丝粒，tel代表端粒；
图7是标记ac208.4在不同自交系间的多态情况；
图8是标记ac211.14在不同自交系间的多态情况。
具体实施方式
下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆（molecularcloning:alaboratorymanual,3rded.）或植物分子生物学－实验手册（plantmolecularbiology-alaboratorymanual,melodys.clark编，springer-verlagberlinheidelberg,1997）中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一：两个共显性分子标记的获得
本发明通过经典的遗传定位获知dek33基因定位在玉米第2号染色体的长臂上。通过在dek33位点附近为纯合突变体和纯合野生型的植株构建的f2群体（参见图3），提取纯合突变体、野生型以及f2群体各单株的基因组dna。通过筛选已有的ssr分子标记，获取有多态性的ssr类型分子标记（ac218.6与ac210.12），将dek33基因定位于分子标记ac218.6与ac210.12之间。然而这两个标记和dek33的连锁性并不十分紧密，在实际使用上仍有一定的问题。因此根据ac218.6与ac210.12之间已知的b73基因组序列（http://www.genome.arizona.edu/fpc/maize），设计引物。通过测序以及序列比对，获得纯合突变体与纯合野生型亲本间的序列差异，并通过所测序列开发标记，获得能够区分育种过程中杂交亲本（纯合dek33类型和纯合野生型类型）以及它们杂交子代（f1代）的共显性分子标记ac208.4与ac211.14。
扩增dna片断ac208.4的特异性引物及碱基序列为：
正向引物从5′端至3′端为：ctacaggaagagcacaagcg；
反向引物从5′端至3′端为：ggcagaagaacgacaaggaa；
扩增dna片断ac211.14的特异性引物及碱基序列为：
正向引物从5′端至3′端为：aaatcaacggggagagccg；
反向引物从5′端至3′端为：ggtcggacacacattggtta。
反应体系如下：
pcr反应条件为：
t=94℃for5'00"
t=94℃for0'30"
t=60℃for0'30"
t=72℃for0'30"
（35cycles）
t=4℃forever
实施例二：分子标记ac208.4与ac211.14与dek33连锁关系的确定
分别抽提dek33/dek33与w64a背景杂交后获得的f2群体中的籽粒的dna用于分子标记ac208.4与ac211.14与dek33连锁关系的分析，野生型表型的基因型包括(+/+和dek33/+)，dek33纯合突变体的基因型为dek33/dek33。以这些样本来分析分子标记ac208.4与ac211.14与dek33基因的遗传连锁关系，参见图4和5。分析结果表明，这两个标记与dek33基因连锁，大群体分析表明，在w64a背景的分离群体中，标记ac208.4的交换率为2.7×10-3，标记ac211.14的交换率为2.8×10-3。分子标记ac208.4与ac211.14与dek33基因在染色体上的物理位置关系，参见图6。
实施例三：分子标记在不同亲本间的多态性鉴定
提取dek33和5种育种中广泛使用的自交系w22、w64a、郑58、b73和mo17的基因组dna，通过pcr反应分析在不同品种间的多态性。结果表明，使用本发明中的分子标记ac208.4可以区别dek33与w64a、郑58、b73和mo17自交系，分子标记ac211.14可以区别dek33与w64a、郑58和mo17自交系（参见图7和图8）。此结果证明，分子标记ac208.4和分子标记ac211.14能够在w64a等背景群体中准确检测到dek33基因的存在，辅助选择时的错选率为7.1×10-6，可以满足选择要求。
序列表
<110>上海大学
<120>扩增检测玉米dek10基因用分子标记的特异性引物组及其应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>单链dna
<213>人工序列()
<400>1
<210>2
<211>20
<212>单链dna
<213>人工序列()
<400>2
<210>3
<211>18
<212>单链dna
<213>人工序列()
<400>3
<210>4
<211>20
<212>单链dna
<213>人工序列()
<400>4