本发明属于生物领域，涉及mir-29a抑制剂及骨髓间充质干细胞凋亡抑制剂。
背景技术：
：骨髓中除含有能分化发育成各种血细胞的造血干细胞之外，还含有产生非造血组织的间充质干细胞(mscs)，因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此有的文献也把mscs称做贴壁细胞或者成纤维细胞集落形成单位。由于它们来自骨髓的支持结构，并且可以作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞(bmscs)。鉴于bmscs的以下特点而日益引起人们的兴趣：1、在不同的理化环境和细胞因子的诱导下，bmscs具有可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞甚至神经元样细胞等多系分化潜能；2、bmscs是造血支持细胞，作为滋养层支持造血干细胞的生长。由于具有易分离、扩增以及体外操作简便等特点，骨髓间充质干细胞在组织工程、细胞移植等领域应用前景十分广阔。基础和临床前研究显示，心肌梗死动物或患者骨髓间充质干细胞移植能够增加缺血心脏血流量，增加毛细血管密度，降低梗死面积，降低瘢痕面积，改善心功能，是一个很有潜力的治疗方法。但是干细胞移植治疗心肌梗死的疗法用于临床，仍有一些问题亟待解决。如移植细胞在梗死后的心肌微环境下发生凋亡是影响治疗效果的重要原因之一。寻找保护bmsc在缺血缺氧环境中免于凋亡、延长移植干细胞存活时间、稳定干细胞生物学特性，在缺血、梗死心肌局部创造有利于干细胞定居、生存的微环境，是干细胞修复心血管损伤用于临床的重要基础研究课题。有研究表明，mir-29a与骨髓间充质干细胞凋亡相关，mir-29a的高表达会诱导骨髓间充质干细胞凋亡(参考文献：mir-29a高表达促进大鼠骨髓间充质干细胞凋亡，河南职工医学院学报，2012年24卷3期)。二萜类化合物根据化学结构母核的差异分为西松烷型二萜、松香烷型二萜、阿替斯烷型二萜、贝壳杉烷型二萜等。不同类型的二萜、相同类型不同化学结构的二萜由于化学结构中母核、取代基的差异，药理活性多种多样，成为药物开发的宝贵资源库。技术实现要素：本发明目的在于提供mir-29a抑制剂，该mir-29a抑制剂可以作为抑制骨髓间充质干细胞凋亡抑制剂，用于抑制骨髓间充质干细胞凋亡，延长骨髓间充质干细胞寿命。上述目的通过如下技术方案实现：泽漆内酯c和e、月腺大戟d和e、euphorangina和b、wallichanola和b均为二萜化合物，但是母核和取代基不同，其化学信息如下表所示。泽漆内酯c和e用作mir-29a抑制剂及骨髓间充质干细胞凋亡抑制剂泽漆内酯c或e用于制备mir-29a抑制剂的用途。一种抑制mir-29a表达的药物制剂，含有泽漆内酯c或e，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。进一步地，所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等。进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、散剂、糖浆剂、膏剂。泽漆内酯c和e用于制备骨髓间充质干细胞凋亡抑制剂的用途。一种抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物制剂，含有泽漆内酯c或e，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。进一步地，所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等。进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。月腺大戟d和e用作mir-29a抑制剂及骨髓间充质干细胞凋亡抑制剂月腺大戟d或e用于制备mir-29a抑制剂的用途。一种抑制mir-29a表达的药物制剂，含有月腺大戟d或e，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。进一步地，所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等。进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、散剂、糖浆剂、膏剂。月腺大戟d和e用于制备骨髓间充质干细胞凋亡抑制剂的用途。一种抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物制剂，含有月腺大戟d或e，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。进一步地，所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等。进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。euphorangina和b用作mir-29a抑制剂及骨髓间充质干细胞凋亡抑制剂euphorangina或b用于制备mir-29a抑制剂的用途。一种抑制mir-29a表达的药物制剂，含有euphorangina或b，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。进一步地，所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等。进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、散剂、糖浆剂、膏剂。euphorangina或b用于制备骨髓间充质干细胞凋亡抑制剂的用途。一种抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物制剂，含有euphorangina或b，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。进一步地，所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等。进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。wallichanola和b用作mir-29a抑制剂及骨髓间充质干细胞凋亡抑制剂wallichanola或b用于制备mir-29a抑制剂的用途。一种抑制mir-29a表达的药物制剂，含有wallichanola或b，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。进一步地，所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等。进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、散剂、糖浆剂、膏剂。wallichanola或b用于制备骨髓间充质干细胞凋亡抑制剂的用途。一种抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物制剂，含有wallichanola或b，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。进一步地，所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等。进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。泽漆内酯c和e、月腺大戟d和e、euphorangina和b、wallichanola和b可以显著抑制骨髓间充质干细胞中mir-29a的表达，进而抑制骨髓间充质干细胞凋亡。附图说明图1为泽漆内酯c和e对骨髓间充质干细胞凋亡和mir-29a相对表达量的影响；图2为月腺大戟d和e对骨髓间充质干细胞凋亡和mir-29a相对表达量的影响；图3为euphorangina和b对骨髓间充质干细胞凋亡和mir-29a相对表达量的影响；图4为wallichanola和b对骨髓间充质干细胞凋亡和mir-29a相对表达量的影响。具体实施方式下面结合具体实施例介绍本发明的技术方案。下述实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，无特别要求，都是本领域技术人员容易获得的常规材料。实施例1：一、实验材料泽漆内酯c和e、月腺大戟d和e、euphorangina和b、wallichanola和b购买或自制，纯度均在95％以上。spf级sd大鼠，雌雄不拘，购于南京市江宁区青龙山动物繁殖场。lg-dmem购自gibco公司。胎牛血清购自hyclone公司。3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)购自sigmaaldrich公司；annexinv-fitc/pi凋亡检测试剂盒购自德国merck公司；primescriprtmastermix(反转录试剂盒)、sybrpremixextaq(荧光定量pcr试剂盒)均购自大连宝生物公司。β-actin、mir-29a引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列如下所示。二、实验方法1、大鼠bmscs的分离与培养无菌条件下取sd大鼠股骨、胫骨及肱骨骨髓液，吹打使骨髓分散，离心洗涤一次，加lg-dmem重悬细胞；将细胞悬液按1:2比例缓慢加在淋巴细胞分离液(密度＝1.077g/ml)上层，2000r/min离心20min；离心管中液体分为三层，吸取中间白膜层单核细胞入另一离心管，lg-dmem离心洗涤一次，加含15％胎牛血清的lg-dmem培养基悬浮细胞，接种于塑料培养瓶中，37℃、5％co2的培养箱内培养。48h首次换液，以后每隔2～3d换液。待细胞生长到90％融合(约5～7d)时按1:2传代，用差速贴壁法纯化细胞。2、实验分组及处理方法收集3～4代传代bmscs细胞，培养至对数期后，制成5×104个/ml的细胞悬液接种在96孔板，每孔100μl。细胞接种24h后，按如下方法分组、处理：对照组：37℃、5％co2的培养箱内正常培养24h；模型组：使用低氧、无血清制造高凋亡模型，将培养基换成无血清培养液，置1％o2、5％co2、37℃三气培养箱中培养24h；给药组：在模型组基础上，无血清培养液中分别加入低浓度(8μm)、高浓度(24μm)泽漆内酯c或e，或月腺大戟d或e，或euphorangina或b，或wallichanola或b。3、annexinv-fitc/pi染色检测细胞凋亡率细胞按实验分组处理后用胰酶+edta混合液消化细胞，制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×106/ml，按试剂盒操作说明书操作，将0.5ml的细胞悬液转移到干净的离心管内，加入10μl培养基结合试剂，加入1.25μlannexinv-fitc室温避光反应15min。1000r/min，离心5min，弃上清，用0.5ml结合缓冲液重悬细胞，加入10μlpi试剂，立即用流式细胞仪检测分析。计算fitc单染(q3)与fitc-pi双染(q2)的阳性细胞百分数之和为该样品细胞凋亡百分数。4、rt-qpcr法检测mir-29a的相对表达量细胞按实验分组处理后加入trizol提取细胞总rna，测定浓度后，用primescriprtmastermix(反转录试剂盒)，按照500ng/10μl的体系反转录成50μl的cdna，用sybrpremixextaq(荧光定量pcr试剂盒)以20μl体系在abi7500实时荧光定量pcr仪上检测mir-29a相对表达量。用β-actin基因表达水平作为内参，计算mir-29a/β-actin基因的比值代表mir-29a的相对表达水平，基因表达相对定量计算采用仪器自带软件。5、统计学分析数据处理采用spss19.0软件进行单因素方差分析，组间比较用lsd法，结果以均数±标准差表示，p＜0.05认为有统计学差异。三、实验结果1、泽漆内酯c和e、月腺大戟d和e、euphorangina和b、wallichanola和b对骨髓间充质干细胞凋亡的影响与对照组相比，模型组骨髓间充质干细胞的凋亡率显著升高(p＜0.05)；与模型组相比，各给药组骨髓间充质干细胞的凋亡率显著降低(p＜0.05)，且呈剂量依赖性。结果如表1和图1-4所示。表1各组骨髓间充质干细胞凋亡率(n＝3)组别凋亡率(％)组别凋亡率(％)对照组6.92±2.75月腺大戟e-高浓度11.48±2.90模型组28.84±3.71euphorangina-低浓度15.18±3.33泽漆内酯c-低浓度17.35±2.96euphorangina-高浓度7.64±2.98泽漆内酯c-高浓度9.62±3.18euphoranginb-低浓度16.29±2.75泽漆内酯e-低浓度16.83±3.09euphoranginb-高浓度7.55±3.04泽漆内酯e-高浓度8.95±2.95wallichanola-低浓度18.31±2.96月腺大戟d-低浓度20.12±3.21wallichanola-高浓度9.57±3.32月腺大戟d-高浓度11.29±3.34wallichanolb-低浓度19.05±3.17月腺大戟e-低浓度21.05±2.79wallichanolb-高浓度9.14±3.082、泽漆内酯c和e、月腺大戟d和e、euphorangina和b、wallichanola和b对骨髓间充质干细胞中mir-29a相对表达量的影响与对照组相比，模型组骨髓间充质干细胞中mir-29a相对表达量显著升高(p＜0.05)；与模型组相比，各给药组骨髓间充质干细胞中mir-29a相对表达量显著降低(p＜0.05)，且呈剂量依赖性。结果如表2和图1-4所示。表2各组骨髓间充质干细胞中mir-29a相对表达量(n＝3)上述结果表明，泽漆内酯c和e、月腺大戟d和e、euphorangina和b、wallichanola和b可以显著抑制骨髓间充质干细胞中mir-29a的表达，进而抑制骨髓间充质干细胞凋亡。泽漆内酯c和e、月腺大戟d和e、euphorangina和b、wallichanola和b可以制备成mir-29a抑制剂和骨髓间充质干细胞凋亡抑制剂。抑制mir-29a表达或抑制骨髓间充质干细胞凋亡的药物制剂可以含有泽漆内酯c或e，或月腺大戟d或e，或euphorangina或b，或wallichanola或b，或其药用盐，及药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型；所述药用盐对应的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、酒石酸、甲磺酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、苹果酸或马来酸等；所述药学上可以接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料；所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。上述具体实施例仅用于解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。当前第1页12