本发明涉及生物医药领域，具体涉及一类芳香氮芥-度胺类缀合物及其药学上可接受的盐，它们的制备方法，含有这些衍生物的药用组合物以及它们的医药用途，特别是在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
来那度胺(lenalidomide)化学名为3-(4-氨基-1,3-二氢-1-氧代-2h-异吲哚-2-基)-2,6-哌啶二酮，是沙利度胺的一个重要衍生物，是美国新基(celgene)公司研发的第2代口服的免疫调节药物，具有抑制肿瘤坏死因子和抑制肿瘤血管生成的双重作用机制，一方面可以起到直接抗癌的作用，能有效抑制癌细胞发展并能诱导癌细胞死亡，另一方面，可以调节患者的机体免疫功能，促进多种抗癌细胞因子的合成。来那度胺邻苯二酰环上c4位的氨基使得其化学性质比沙利度胺更加稳定，具有更强的抑制血管生成和免疫调节作用；而且相比沙利度胺，其临床应用更安全，不良反应更小，几乎无神经毒性和致畸性，对多种血液病和实体恶性肿瘤都有作用。
美国食品和药物管理局(fda)于2005年12月批准其用于骨髓异常增生综合征(mds)的治疗，2006年6月批准其应用于多发性骨髓瘤(mm)的治疗，2013年3月批准其用于套细胞淋巴瘤(mcl)的治疗。来那度胺30％与血桨白蛋白结合，2/3原型经肾脏排出，清除半衰期为3h。临床表现出肝损伤、局部血栓等副作用。
泊马度胺(pomalidomide)化学名为3-氨基-n-(2,6-二氧代-3-哌啶基)-邻苯二甲酰亚胺，是由是由美国celgene公司开发继沙利度胺和来那度胺后的第三个上市的度胺类免疫调节剂，具有包括抗血管新生和抗骨髓瘤作用在内的多重活性。
作为第三代免疫调节剂，泊马度胺具有治疗效果好、不良反应少、有良好的耐受性等优点，其抗肿瘤作用在临床治疗中非常突出，尤其对多发性骨髓瘤有明显抗骨髓瘤效果。此外，泊马度胺能够治疗jak2v617f阳性mf贫血症，还能改善在罕见al淀粉样变患者脏器功能。泊马度胺常见的不良反应主要是骨髓抑制，乏力恶心，呼吸困难等。另外，该药还能引起血栓，也有可能导致胎儿出现严重的出生缺陷。
临床使用的芳香氮芥由于氮原子和苯环产生共轭，减弱了氮原子的碱性。与脂肪氮芥相比，芳香氮芥的氮原子碱性较弱，烷化能力较低，因此抗肿瘤活性较脂肪氮芥弱，毒性比脂肪氮芥低。在临床上长期使用的芳香氮芥药物也有多个，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，苯丙氨酸氮芥(melphalan，美法仑)，苯达莫司汀(bendamustine，treanda)，主要引起dna单链和双联通过烷化作用交联而影响dna的功能。苯达莫司汀与苯丁酸氮芥相比主要的优点是它的水溶性。美国fda于2008年3月21日批准cephalon公司的盐酸苯达莫司汀(bendamustine，treanda)用于慢性淋巴细胞性白血病。
基于以上研究，我们发现上述度胺类药物和芳香氮芥对多种肿瘤有着相同或相似的临床治疗应用，然而却属于不同类型的药物作用靶点，若将这两种类型药物组合起来形成前药，是否可达到协同抗肿瘤作用，提高抗肿瘤活性和耐受性，减少肿瘤对药物的耐药性。因此，本发明根据前药设计原理和拼合原理，利用芳香氮芥如苯丁酸氮芥、苯达莫司汀的羧基与来那度胺或泊马度胺中的苯环c4位氨基进行酰胺化，拟设计、合成芳香氮芥-度胺类缀合物，希望它们在体内通过各种酯酶或酰胺酶缓慢释放出来那度胺和芳香氮芥，发挥协同抗肿瘤作用，不仅可保留来那度胺所具有的抑制肿瘤坏死因子和抑制肿瘤血管生成作用，而且可产生芳香氮芥引起dna的烷化作用，影响dna的功能，实现多重作用的抗肿瘤效果，提高生物利用度，降低肿瘤细胞对这类药物的耐药性。本发明公开了一类具有药用价值的芳香氮芥-度胺类缀合物及其药学上可接受的盐，目前尚未见对此类化合物的任何报道。
技术实现要素：
本发明首次公开了一类芳香氮芥-度胺类缀合物及其药学上可接受的盐、其制备方法及其医药用途。本发明公开的化合物是通式i所示的芳香氮芥-度胺类及其药学上可接受的盐：
通式ⅰ中：
r代表
x代表
特征在于所述通式ⅰ的结构中的r、x选自如下组合：
或者
或者
或者
表1通式i化合物代号及其对应的结构
本发明的另一目的在于提供本发明通式ⅰ所述化合物的制备方法。通式ⅰ中化合物的合成路线如下所示：
其中：
r代表
x代表
步骤包括：
化合物(1)在多肽缩合剂edci和dmap，或者在hatu和dipea存在下，与化合物(2)反应得到化合物i。
本发明的再一目的是提供本发明通式i化合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
本发明的进一步目的在于提供一种含有效剂量的本发明通式i化合物或其医学上可接受的盐及药学上可接受的载体或辅料的药物组合物。
本发明的再一目的是提供本发明通式i化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是治疗肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌、急性白血病或多发性骨髓瘤等肿瘤药物中的应用。
本发明化合物可以单独或与一种或一种以上的药学上可接受的载体组合制成制剂以供给药。例如，溶剂、稀释剂等，可以用口服剂型给药，如片剂、胶囊、可分散粉末、颗粒剂等。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域中熟知的方法进行制备。这些药用制剂中可以含有与载体组合的例如0.05％～90％重量的活性成分，更常见约15％～60％之间重量的活性成分。本发明化合物剂量可以是0.005～5000mg/kg/天，也可根据疾病严重程度或剂型的不同使用剂量超出此剂量范围。
本发明化合物可以与其他抗肿瘤药物例如烷化剂(如环磷酰胺或顺铂)、抗代谢药(如5-氟尿嘧啶或羟基脲)、拓扑异构酶抑制剂(如喜树碱)、有丝分裂抑制剂(如紫杉醇或长春碱)、dna插入剂(如阿霉素)联合应用，另外还可以与放射治疗联合应用。这些其他抗肿瘤药物或放射治疗可以与本发明化合物同时或在不同时间给予。这些联合治疗可以产生协同作用从而有助于改善治疗效果。
本发明优点：
本发明根据前药设计原理和拼合原理，利用临床芳香氮芥药物苯丁酸氮芥、苯达莫司汀的羧基与度胺类药物的苯环上氨基进行酰胺化偶联，设计合成了新型芳香氮芥-度胺类缀合物。前期研究表明，免疫调节药物来那度胺或泊马度胺与芳香氮芥苯达莫司汀联合用药，可明显促进药物治疗耐受性，协同抑制恶性肿瘤的生长，延长癌症患者的生存期，并可提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，用于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤或晚期淋巴瘤(meleg,spinaa,guaragnag,etal.leuklymphoma.2014,55(5):1191-3；chesonbd,crawfordj.brjhaematol.2015,169(4):528-33；arcainil,lamyt,walewskij,etal.brjhaematol.2018,180(2):224-235)。本发明将两类不同类型靶点的药物结合在一起形成前药，实现多重作用的协同抗肿瘤效果，提高抗肿瘤活性和耐受性，减少肿瘤对药物的耐药性。同时利用酰胺键连接度胺类药物，还能够降低度胺类苯环上氨基被体内酶降解，改善其体内生物利用度。
本发明化合物的部分药理试验结果如下：
1、采用mtt法对本发明化合物的肿瘤细胞增殖抑制率测定研究
本发明通式ⅰ化合物在羧酸酯酶作用下，经过一系列肿瘤细胞抗增殖活性测试，药理实验结果表明(见表2)，本发明通式i化合物对人肿瘤细胞的增殖具有较强程度的抑制作用，均显著比对照药chlorambucil和bendamustine强2-3倍，比对照药lenalidomide和pomalidomide强1-2倍，值得进一步地深入研究。
表2本发明化合物对部分肿瘤细胞增殖的抑制率％(25μm)
2、采用流式细胞仪进行检测细胞凋亡率
选择本发明通式ⅰ化合物在羧酸酯酶存在下检测对诱导肿瘤细胞hepg2、hl60凋亡的影响，结果发现在10μm下能够显著促进hepg2、hl60细胞凋亡，其凋亡率为40.6～62.9％，均明显强于同浓度下lenalidomide和chlorambucil的促凋亡作用(10μm凋亡率分别为22.1、15.3％)。说明本发明通式ⅰ化合物能够明显诱导肿瘤细胞凋亡。
3、本发明化合物能够提高度胺类药物在血浆和肝微粒体中的稳定
选择本发明通式ⅰ化合物在大鼠血浆和肝微粒体进行稳定性测试，实验结果表明，随着时间延长，本发明化合物在大鼠血浆或肝微粒体中逐步降解，缓慢释放出原药芳香氮芥和度胺类药物，然而度胺类药物在血浆中保持有效浓度持续时间长达12～20小时，在肝微粒体中保持有效浓度持续8～15小时，显著高于度胺类药物本身在大鼠血浆或肝微粒体的持续时间4～8小时。
上述实验结果为本发明通式ⅰ化合物中优选化合物ⅰ1-ⅰ4药理实验结果，对本发明符合通式ⅰ结构的其他化合物的药理药效亦有指导意义，由于本发明通式ⅰ化合物具有来那度胺或泊马度胺或芳香氮芥相似的化学结构和空间结构，因而具有相同或相似的药理药效作用，经过上述优选化合物ⅰ1-ⅰ4药理实验的验证，说明通式ⅰ化合物均具有不同程度的抗肿瘤活性。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1：
4-(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯基)-n-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)丁酰胺(i1)的制备
将来那度胺(1a，259mg，1.0mmol)溶于10ml无水ch2cl2中，然后依次加入苯丁酸氮芥(2a，333mg，1.1mmol)、edci(384mg，2.0mmol)和dmap(25.9mg，10％)，待其全部溶解后加热至40℃回流反应。经tlc检测反应结束后，减压蒸出溶剂，粗品通过柱层析纯化(流动相乙酸乙酯：石油醚＝2:1-4:1)得到白色固体338mg，收率62％.esi-ms(m/z):545[m+h]+.1hnmr(dmso-d6,400mhz):δ11.04(s,1h,nh),9.79(s,1h,nh),7.81(d,1h,j＝8.0hz,ar-h),7.52(d,1h,j＝8.0hz,ar-h),7.49(m,1h,ar-h),7.06(d,2h,j＝8.0hz,ar-h),6.68(d,2h,j＝8.0hz,ar-h),5.15(m,1h,ch),4.37(m,2h,ch2),3.70(m,8h,ch2),2.59(m,2h,ch2),2.51(m,2h,ch2),2.36(m,2h,ch2),2.03(m,2h,ch2),1.87(m,2h,ch2).
实施例2：
4-(5-(双(2-氯乙基)氨基)-1-甲基-1h-苯并[d]咪唑-2-基)-n-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)丁酰胺(i2)的制备
将来那度胺(1a，259mg，1.0mmol)溶于10ml无水ch2cl2中，然后依次加入盐酸苯达莫司汀水合物(2b，454mg，1.1mmol)、hatu(2.0mmol)、dmap(130mg，50％)和三乙胺(404mg，4.0mmol)，待其全部溶解后加热至40℃回流反应。经tlc检测反应结束后，减压蒸出溶剂，粗品通过柱层析纯化(流动相甲醇：二氯甲烷＝1:30-1:15)得到淡黄色固体305mg，收率51％.esi-ms(m/z):599[m+h]+.1hnmr(dmso-d6,400mhz):δ11.03(s,1h,nh),9.87(s,1h,nh),7.81(m,1h,ar-h),7.50(m,1h,ar-h),7.34(d,1h,j＝8.0hz,ar-h),6.93(m,1h,ar-h),6.79(m,1h,ar-h),5.15(m,1h,ch),4.37(m,2h,ch2),3.71(s,8h,ch2),3.69(s,3h,ch3),2.89(t,2h,j＝8.0hz,ch2),2.57(m,2h,ch2),2.51(m,2h,ch2),2.10(m,2h,ch2),2.02(m,2h,ch2)。
实施例3：
4-(4-(双(2-氯乙基)氨基)苯基)-n-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)丁酰胺(i3)的制备
参照实施例1中化合物(i1)的制备方法，将泊马度胺(1b，273mg，1.0mmol)代替来那度胺与苯丁酸氮芥反应得到淡黄色固体301mg，收率54％，esi-ms(m/z):559[m+h]+.1hnmr(dmso-d6,400mhz):δ11.15(s,1h,nh),9.69(s,1h,nh),8.45(d,1h,j＝8.0hz,ar-h),7.82(t,1h,j＝8.0hz,ar-h),7.61(d,1h,j＝8.0hz,ar-h),7.05(d,2h,j＝8.0hz,ar-h),6.67(d,2h,j＝8.0hz,ar-h),5.15(m,1h,ch),3.69(s,8h,ch2),2.90(m,2h,ch2),2.62(m,2h,ch2),2.46(t,2h,j＝8.0hz,ch2),2.05(m,2h,ch2),1.89(m,2h,ch2)。
实施例4：
4-(5-(双(2-氯乙基)氨基)-1-甲基-1h-苯并[d]咪唑-2-基)-n-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)丁酰胺(i4)的制备
参照实施例2中化合物(i2)的制备方法，将泊马度胺(1b，273mg，1.0mmol)代替来那度胺与盐酸苯达莫司汀反应得到淡黄色固体292，收率48％，esi-ms(m/z):613[m+h]+.1hnmr(dmso-d6,400mhz):δ11.09(s,1h,nh),9.82(s,1h,nh),7.81(m,1h,ar-h),7.50(m,1h,ar-h),7.33(d,1h,j＝8.0hz,ar-h),6.91(m,1h,ar-h),6.78(m,1h,ar-h),5.15(m,1h,ch),3.71(m,8h,ch2),3.69(s,3h,ch3),2.88(m,2h,ch2),2.52-2.57(m,4h,ch2),2.11(m,2h,ch2),2.03(m,2h,ch2)。
实施例5：
四甲基氮唑蓝比色法(mtt)体外抗肿瘤试验
按常规采用mtt评价了本发明化合物对6种人癌细胞株的抗增殖活性。mtt法已广泛用于大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感测定等。选择chlorambucil、bendamustine、lenalidomide和pomalidomide为阳性对照药
人癌细胞株：宫颈癌细胞hela、胃癌细胞hgc27、肝癌细胞hepg2、肺癌细胞a549、急性白血病细胞hl60、多发性骨髓瘤细胞h929。
实验方法如下：取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25％胰蛋白酶消化，使贴壁细胞脱落，制成每毫升含2×104～4×104个细胞的悬液。取细胞悬液接种于96孔板上，每孔180μl，置恒温co2培养箱中培养24小时。换液，加入羧酸酯酶和受试化合物i1-i4(化合物用dmso溶解后用pbs稀释，受试化合物浓度分别为5×10-6，2.5×10-5mol/l)，每孔20μl，培养72小时。将mtt加入96孔板中，每孔20μl，培养箱中反应4小时。吸去上清液，加入dmso，每孔150μl，平板摇床上振摇5分钟。用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸收度，计算细胞抑制率。实验结果如表2所示。
细胞抑制率＝(阴性对照组od值-受试物组od值)/阴性对照组od值×100％。
实施例6：
流式细胞仪检测细胞凋亡率
选择肿瘤细胞hepg2、hl60，并且处于对数生长期状态，加入消化液(0.125％胰蛋白酶+0.01％edta)消化，计数2～2.5×105个/ml，制成细胞悬液，接种于培养板，置恒温co2培养箱中培养24小时。换用2％血清的dmem培养基培养，加入羧酸酯酶和不同浓度受试药物化合物，继续培养72小时。收集细胞，贴壁细胞用不含edta的胰酶消化收集，1000r/min离心5min，用冷的pbs洗涤细胞二次(1000rpm离心5min)，计数后，加约1×105个细胞于试管中离心，去上清。悬浮细胞于500μl的bindingbuffer。加入5μlannexinv-fitc混匀后，加入5μlpropidiumiodide，混匀,避光反应5～15min。在1小时内，进行流式细胞仪的观察和检测。激发波长ex＝488nm；发射波长em＝530nm。每组3管。未经药物处理的细胞为阴性对照。凋亡细胞为annexinv+和annexinv+pi+，而pi+的细胞为坏死细胞,非染细胞为未损伤细胞。计算200细胞中的凋亡细胞为测试指标。实际凋亡率＝药物凋亡率/阴性对照组的凋亡率。
实施例7：
血浆和肝微粒体的稳定性测定
高效液相色谱测定条件：色谱柱：diamonsil-c18(150×4.6mm,5μm)；流动相：甲醇：10mnkh2po4溶液＝100：0～10:90；柱温：25℃；检测波长：200～500nm；流速：1.0ml/min；进样量10μl。
样品处理：取适量本发明化合物、芳香氮芥或度胺类药物标准溶液，于氮气流下吹干，加入适量大鼠血浆和pbs混合溶液(1:1)，并加入0.5％dmso助溶，然后加入适量冷乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡2min后，于0℃下，12000rpm/min离心5min，取上清液，制备含本发明化合物、芳香氮芥或度胺类药物混合的血浆。以同样的方法制备含本发明化合物、芳香氮芥或度胺类药物混合的肝匀浆。按上述液相条件进样，记录hplc图谱。
体外代谢稳定性：取适量上述标准溶液，于氮气流下吹干，加入适量大鼠血浆和pbs混合溶液(2:1～1:2)，并加入0.5％dmso助溶，涡旋震荡混匀后，放入37℃恒温震荡箱中，于0h、0.25h、0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、8.0h、12.0h和24.0h取样，加入适量冷乙腈，涡旋震荡2min后，于0℃下，12000rpm/min离心5min，取上清液，按液相条件进样，记录hplc图谱数据。同法得到孵育了不同时间长度的含药肝匀浆，并按相似液相条件进样，记录hplc图谱数据。考察本发明化合物及代谢的原药在大鼠血浆和肝匀浆中的代谢稳定性。