本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种大豆耐盐相关转录因子myb及其编码基因与应用。
背景技术：
：大豆(glycinemaxl.)提供了植物蛋白和脂肪的，也能作为工业原料和畜牧饲料。一方面我国作为全球最大的大豆进口国，另一方面，包括病虫害、低温、干旱、土壤盐碱化在内的生物和非生物胁迫对国内大豆生产造成了严重的威胁。因此，增强逆境防御能力，培育出在农艺性状上具有更好抗逆性的种质资源迫在眉睫。传统的育种方法虽然取得大量成绩，但研究受育种周期长，抗逆机制的复杂和优异种质资源缺乏的限制。将现代分子生物学技术和传统育种方式结合起来，研究植物的抗逆机制，成为广大育种工作者的必然选择。植物的非生物胁迫应激网络极为复杂，含有大量基因水平的转录调控。植物通过对相关逆境应激基因的转录调控，达到调节生理发育的目的。离子胁迫、病原菌、水分、温度等影响植物信号传导的环境刺激因子，为了避免逆境胁迫的损伤，植物已具备一套自我调节机制来免于受到低温、干旱、高盐等不利的环境压力。myb基因是转录因子家族中重要的一员，参与植物生长代谢、环境因子的应答，并对植物多方面的生理生化机制建成具有重要的调节作用。植物中的myb类转录因子的氨基酸序列n端具备1-3个由51-53个氨基酸组成的呈螺旋-转折-螺旋构象序列(r1、r2和r3)，即myb结构域。疏水核心的作用主要来源于myb结合域中3个保守的色氨酸残基，对维持螺旋-转折-螺旋构象起主要作用。多数myb蛋白都是转录激活子，可激活目标基因的表达，也有少部分抑制目标基因的表达，起负调控作用。转录因子主要是通过与靶序列特异性结合，从而起到对下游基因的调控作用。romero和urao等研究表明myb转录因子同mybsi(保守序列为t/caacg/tga/c/ta/c/t)、mybsⅱ(保守序列为taactaac)、cngttr、gktwgttr、gktwggtr(n为a,g,c或t；k,g或t；r,a或g；w,a或t)、taactg等元件结合。真核生物的基因功能表达网络极为复杂，涉及多个修饰、翻译、转录过程，其中，转录水平上的调控尤为关键，对植物生长发育、逆境反应、信号传导和抗病性等都具有重要影响。单子叶植物和双子叶植物中均可能存在大量的myb转录因子，由于myb在植物在逆境中具有重要作用，因此，对大豆myb家族中其他的成员进行功能鉴定，可为采取植物基因育种手段增强大豆耐逆品质，创造优秀的抗逆材料提供有效的基因资源。技术实现要素：本发明提供一种大豆耐盐相关myb转录因子及其编码基因与应用。本发明所提供的大豆耐盐性相关myb转录因子来源于大豆品种吉林32(由吉林省农科院富健研究员馈赠)，命名为gmmyb68。所述大豆myb转录因子基因的碱基序列为seqidn0.1。所述大豆myb转录因子基因编码的蛋白质，其氨基酸序列为seqidn0.2。序列seqidn0.1由780个碱基组成；seqidn0.2由259个氨基酸残基组成，含两个sant结构域，即myb结构域：位于第4-53、56-104氨基酸，属于典型的r2r3-myb转录因子。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的gmmyb68的编码基因导入植物细胞，具有抗盐性的转基因植株。使用本发明的基因构建植物表达载体时，可在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(gus基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素、卡那霉素等)。携带有本发明gmmyb68的表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本发明克隆了一个与耐盐性相关的大豆gmmyb68转录因子基因，对该基因在野生型和转基因大豆中的表达模式及抗旱性进行了分析，对培育抗盐大豆品种具有重要意义。附图说明图1是gmmyb68基因的pcr扩增结果图，其中m：dnamarker(dl2000)；1,2,3,4：gmmyb68反转录扩增结果；图2是gmmyb68基因逆境诱导表达模式图；图3是gmmyb68基因组织表达模式图；图4是植物表达载体结构示意图；图5.1是gmmyb68基因在部分t2代转基因大豆的鉴定结果中的除草剂(草甘膦)涂抹筛选图，图中：箭头标识为涂抹除草剂位置，涂抹后野生型植株枯萎变黄，转基因植株无明显变化；图5.2是gmmyb68基因在部分t2代转基因大豆的鉴定结果中的bar基因检测图，图中：m：dnamarker(dl2000)；1-22：ptf101.1-gmmyb68转基因植株；+：重组质粒；-：阴性对照(模板为水)；图5.3是gmmyb68基因在部分t2代转基因大豆的鉴定结果中的southernblot杂交分析图，m：dnamarker；1,2,3,4：hindiii酶切的t2代转基因植株southernblot鉴定；+：重组质粒；-：阴性对照(野生型植株)；图6.1是gmmyb68转基因植株耐盐性鉴定图，是野生型大豆和t3代转基因大豆盐碱处理结果，其中wt为野生型大豆，oe为t3代转基因大豆；图6.2是gmmyb68转基因大豆萌发率测定图，其中wt为野生型大豆，oe为t3代转基因大豆，图7是gmmyb68转基因植株在盐碱胁迫下可溶性糖含量(a)和脯氨酸含量(b)的变化图，wild-type：野生型大豆；gmmyb68-oe：gmmyb68转基因株系，可溶性糖和脯氨酸的积累与植物中逆境反应相关，经过盐碱胁迫处理后，野生型与转基因植株的可溶性糖和脯氨酸含量均显著上升，其中gmmyb68转基因植株的上升幅度与野生型相比，上升显著；图8是t3代转基因大豆中gmmyb68抗逆相关基因荧光实时定量pcr结果图，其中：a：aba信号途径关键调控因子gmabi5；b：对植物高盐、干旱及低温胁迫的分子反应调控基因dreb2；c：na+/h转运蛋白基因gmnhx1；d：苯丙烷代谢途径的关键酶苯丙氨酸解氨酶；e：与植物病程反应相关的基因gmnpr1-1；f：与植物病程反应相关的基因gmnpr1-2，上述5个基因均是已在相关文献中证实的与植物抗逆相关的重要基因。具体实施方式实施例1：gmmyb68基因的克隆及序列分析大豆rna的提取及cdna的合成：参照全式金公司的plantrnakit说明书提取大豆吉林32叶片总rna，用first-strandcdnasynthesissupermix(购自全式金)进行反转录，合成cdna；利用大豆品种吉林32的未成熟胚表达谱测序所得序列(20d、30d、50d)，利用ncbi序列分析工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)分析获得两个与myb转录因子具有高度同源性的未知cdna序列，利用primer5软件设计引物，未成熟胚cdna为模板进行pcr扩增。反应体系如下：pcr程序为：pcr产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测，紫外凝胶成像仪拍摄保存；将上述扩增片段使用琼脂糖凝胶回收试剂盒quickgelextractionkit(全氏金)回收后与克隆载体pmd18-t(购自takara)进行连接，反应体系如下：t载体0.5ulpcr回收产物2ulsolutioni2.5ul16℃过夜连接后转化大肠杆菌感受态，并送华大基因测序，验证序列正确。经pcr扩增得到包含有gmmyb68基因开放阅读框的序列，编码了259个氨基酸。预测gmmyb68蛋白的分子量为145.636kda，等电点pi＝5.0。氨基酸结构预测该蛋白含有两个sant结构域,即myb结构域，位于第4-53、56-104氨基酸，属于典型的r2r3-myb转录因子。。实施例2：gmmyb68基因逆境诱导下的表达模式当植株长到四叶期时，将幼苗转移至hogland营养液中培养3d后进行如下处理：盐胁迫处理：将大豆幼苗置于含200mmnacl的hogland营养液中；低温处理：将大豆幼苗置于4℃的光照培养箱中；干旱处理：将大豆幼苗置于含有20％peg8000的hogland营养液中；机械伤害处理：用灭菌的解剖刀片对大豆幼苗叶片轻划3-5处伤口；aba处理：用含有200um的aba喷洒大豆幼苗；上述处理分别在处理后0h、1h、2h、5h、10h、24h取样，植物材料迅速置于液氮中，-80℃保存备用；总rna的提取和cdna的合成方法同实施例1，根据gmmyb68的cdna序列设计实时荧光定量pcr引物(f:5’-tcggtctgggaaatcgtg-3’；r:5’-ctcaccactcgcagcatct-3’)；以大豆组成型表达基因gmactii(genebank检索号：u60500)(f:5’-gagctatgaattgcctgatgg-3’；r:5’-cgtttcatgaattccagtagc-3’)为内部参照基因，利用abiprism7500实时定量pcr仪，大豆各组织部位及各胁迫处理取样点的cdna为模板进行荧光实时定量pcr；具体步骤参照tipgreenqpcrsupermix说明书进行操作；反应体系：pcr程序为：94℃30s55℃5s72℃34s40个循环，采用2-△△ct法分析数据,确定基因的相对表达量，每个取样点设3次技术重复,试验共设3次生物学重复。表1逆境处理下gmmyb68基因的相对表达量；结果表明gmmyb68基因在各种逆境处理下均存在上调表达趋势。其中在盐胁迫处理5h后，gmmyb68的表达量达到最高，且总体表达水平高于其他胁迫处理，因此，推断gmmyb68可以被多种逆境胁迫诱导表达，其中对盐胁迫的表达反应最明显。实施例3：gmmyb68基因在大豆组织中的表达模式分别提取大豆吉林32的根、茎、花、叶、子叶节、下胚轴和20天胚的总rna并反转录成cdna，方法同实施例1。以上述组织的cdna为模版进行实时荧光定量pcr，方法同实施例2。表2gmmyb68基因在大豆不同组织中的表达水平:茎叶花幼胚子叶节下胚轴1.4130271.51226524.984344.2434182.04993513.57257gmmyb68在大豆的各组织部位都有表达，其中，花、下胚轴和幼胚的表达量最高，其他部位虽然也有表达，但表达量较低；根中的表达量最低。实施例4：gmmyb68基因植物表达载体的构建及大豆子叶节的遗传转化参考全式金生物公司的质粒小提试剂盒说明书，取过夜培养菌液pmd18t-gmmyb68提取质粒作为模板，并在上下游引物中加入xbai和saci酶切位点，(f:5’-tgctctagacaaaggacatggatcggataaaagg-3’，r:5’-cgagctcttattcaaccctaccaattcccatcc-3’)进行pcr扩增，将扩增产物与植物表达载体ptf101.1-35s分别进行限制性内切酶酶切反应，反应体系参考neb公司试剂说明书进行：37℃酶切2h，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段。并采用t4连接酶将酶切后的pcr片段与载体进行连接，测序鉴定正确后，将测序正确的重组质粒命名为ptf101.1-gmmyb68，转化农杆菌eha101(购自biovector)，保存菌种备用。参照郭东全等的方法，农杆菌介导法转化大豆子叶节组织。取表皮光滑，无病斑、无霉菌、无裂纹的完整成熟的大豆种子，放入密闭容器中，用100mlnaclo和3.5ml浓盐酸产生的氯气熏蒸灭菌10-12h。将消毒后的大豆种子于超净工作台上吹散残余氯气后，种脐向下种于萌发培养基中过夜萌发约16h后，用无菌解剖刀将两片子叶沿中轴线切开，去除原始叶芽，并在子叶与下胚轴结合处制造长约3mm的划痕。将制备好的外植体放入装有工程菌侵染液的无菌皿中，大约每70ml菌液侵染80个外植体，侵染时可将无菌培养皿封好后置于摇床上，100rpm轻轻振荡20-30min，使外植体充分接触侵染液；在共培养培养基上铺一层无菌滤纸，将侵染后的子叶节近轴面向上置于滤纸上，每皿8个外植体左右，24±1℃，暗培养4d。共培养4d后，切去子叶节伸长的下胚轴，保留3mm左右，将子叶节外植体45°近轴面向上斜插于分化培养基中进行不定芽诱导。培养温度26℃左右，24h光照，每14天继代一次，更换新鲜培养基。继代期间切去多余幼芽，并在外植体与培养基接触面制造新伤口以促进不定芽诱导。不定芽诱导28d后，转入不定芽伸长培养基中，切除子叶，每14d继代一次，更换新鲜培养基，直到不定芽伸长到3-5cm。不定芽伸长到3-5cm时可将其切下，蘸取适量的1mg/l的iba后转入生根培养基，出根时间为20d左右，待长出健壮的根系时转入26℃人工气候室进行炼苗，移栽，收获t0代种子并对子代进一步分析。实施例5：gmmyb68转基因大豆的筛选与鉴定试纸条检测：取再生苗约0.2g嫩叶，置于干净离心管中，加入100ul无菌水研磨。将试纸条有箭头标志的一端浸入研磨液中数分钟，显色端呈两条红线即为阳性检测结果，显色端呈一条红线即为阴性检测结果。除草剂筛选：待温室中的t0代转基因苗第二对复叶完全展开时，选取三出复叶中间的小叶涂抹草甘膦(1‰m/v)溶液，并做好标记，涂抹3d后，观察并拍照记录。箭头标识为涂抹除草剂位置，涂抹后野生型植株枯萎变黄，转基因植株无明显变化。说明转基因植株携带植物表达载体上的筛选标记基因bar基因，含有除草剂抗性。southernblot杂交：选经试纸条检测和除草剂筛选阳性植株的后代，即t2代转基因植株的成熟叶片4-5片，提取总dna，以限制性内切酶hindiii进行dna消化，重组质粒ptf101.1-gmmyb68为阳性对照，野生型植株的dna单酶切产物作为阴性对照。转基因植株中含有1-2个目的基因拷贝条带，说明目的基因已经以单拷贝的形式整合到大豆基因组中。实施例6：t3代gmmyb68转基因大豆的盐碱耐性分析以200mm的nacl溶液和100mm的na2co3溶液分别作为盐胁迫处理液和碱胁迫处理液，取长势均匀的转基因大豆苗9盆分为三组，待刚进入四叶期时，对大豆进行盐碱处理，对照组只浇灌水，同时对同一生育期的野生型大豆进行相同处理，作为野生型对照组。总计处理20天。经过盐碱胁迫处理后，野生型植株和转基因植株的叶片均产生黄色斑点及卷曲现象。野生型植株呈现明显发育迟缓的现象，而转基因植株症状较轻，且转基因植株对na2co3的耐受性要优于nacl。另外，以上述浓度的nacl溶液和na2co3溶液浇灌t3代转基因种子和野生型大豆种子，每组100粒，处理4天，统计种子的萌发率。转基因大豆和野生型大豆种子在浇灌水的处理条件下，萌发率无明显差异，但在盐碱胁迫处理后，转基因植株的萌发率要优于野生型大豆，在萌发率试验中，转基因植株表现为对nacl较强的耐受性。实施例7：t3代转基因大豆盐碱处理后生理指标测定1)叶绿素含量测定取新鲜叶片0.2g，剪碎后置于干净的50ml离心管，加入10ml无水乙醇和80％丙酮的等体积混合液。黑暗处静置48h，直至叶绿素提取完全，使用紫外分光光度计测定od663和od645,以公式ct＝20.29od645+8.05od663计算叶绿素含量；2)可溶性糖含量测定称取新鲜叶片约1.0g，剪碎后置于大试管中，加入10mlh2o，沸水浴中煮沸20min，冷却至室温，过滤入容量瓶内，定容至100ml，取待测提取液1ml，加入5ml蒽酮试剂，快速混匀后，沸水浴中煮10min，取出冷却，测定620nm波长下的od值，参考标准曲线计算可溶性糖含量；3)脯氨酸含量测定称取0.05g样品放入离心管，加入10ml3％的磺基水杨酸，封口后沸水浴煮30min，冷却至室温后，3000rpm，离心10min，取上清液待测；取1ml提取液于试管中，加1ml冰醋，1ml3％磺基水杨酸，2ml2.5％酸性茚三酮，混匀后沸水浴显色反应60min，冷却后加入4ml甲苯，振荡萃取红色物质，静止后取上层液相，测定520nm波长下的od值，根据标准曲线，查出相应的脯氨酸浓度，参考公式进行计算：脯氨酸含量(ug·g-1·fw)＝c×v/2/w/115；其中c为由标准曲线查的脯氨酸含量(ug/ml)、v为提取液总体积(ml)、w为样品质量(g)、115为脯氨酸相对分子质量；4)光合测定采用li-6400型便携光合作用测定系统，采用固定红蓝光源，设置光照强度为1200umol·m-2·s-1。于处理第10天的上午10:00至12:00进行测定，测定部位为植株上数第2组三出复叶中间小叶。叶片净光合速率(pn)、气孔导度(gs)、胞间二氧化碳浓度(ci)及蒸腾速率(tr)由仪器上直接读取；数据处理及方差分析采用统计学程序spss21.0完成。文中数据均设三次重复的平均值±标准误差。生理指标的分析比较采用lsd多重比较；结果显示，经过盐碱处理后，野生型植株和转基因植株的叶绿素含量较正常生长条件有所下降，且不同胁迫处理下降幅度不同。经过nacl和na2co3处理后，野生型植株叶绿素含量分别下降了32.9％和22.5％，转基因植株叶绿素含量分别下降了36.1％和0.11％；在正常生长状态下，野生型与转基因植株的光合生理指标并无明显差异，盐碱胁迫后，叶片净光合速率(pn)均呈下降趋势，野生型的净光合速率分别下降了30.2％和42.1％，转基因植株则分别下降了27％和21.8％。在碱胁迫水平上，转基因植株的净光合速率与野生型相比存在显著差异。另外，气孔导度(gs)、蒸腾速率(tr)与净光合速率下降趋势一致，而胞间二氧化碳浓度(ci)则相反，胁迫处理后有增加趋势，说明野生型与转基因植株在盐碱胁迫下导致光合速率降低的主要原因不是气孔的非限制性作用，推测是叶肉细胞光合活性降低引起的碳氮代谢失调。与对照相比，盐胁迫与碱胁迫对植株的生理指标有着截然不同的影响。已有相关文献证明，在受到逆境胁迫时，抗逆性较强的植株光合作用能力受到影响较小，本试验证明，gmmyb68基因的转化，有利于缓解盐碱胁迫对植株叶绿素含量和光合作用的影响。表3gmmyb68对盐碱胁迫下光合生理指标的影响：注：*标注为显著性差异p＜0.05，**标注为显著差异p＜0.01已有大量相关文献证实，可溶性糖和脯氨酸的积累，有利于植株在逆境条件下维持细胞结构和生活力，提高植株的耐逆性。经过盐碱处理后，野生型与gmmyb68植株中的可溶性糖和脯氨酸大量积累。正常生长条件下，野生型与转基因植株中二者含量无显著差异，经碱胁迫处理后，转基因植株中可溶性糖含量和脯氨酸含量分别增加了76.54％和50.91％，该增长幅度显著高于同等胁迫处理下野生型植株(分别为62.38％和43％)。另外，gmmyb68转基因植株在nacl处理后，脯氨酸的增加幅度显著高于同处理下的野生型。综上结果说明在盐碱条件下，gmmyb68在大豆中的过量表达有利于可溶性糖和脯氨酸的合成和积累。表4盐、碱胁迫对gmmyb68转基因植株叶片渗透调节物质的影响：实施例8：gmmyb68转基因植株农艺性状的调查经过nacl和na2co3处理后，植株的发育受到显著影响，具体表现为侧根减少，根系伸长受限，木质化加速。对转基因植株进行农艺性状调查，主要指标包括株高、分枝数、单株荚数、单株粒数、百粒重五个方面，数据结果采用lsd法进行统计分析。结果如表所示，各指标在经过盐、碱胁迫处理后虽存在下降，但转基因植株与野生型植株之间并无显著差异，表明gmmyb68的插入在增强大豆品种盐碱耐性的同时并未影响该品种的农艺性状。表5gmmyb68转基因植株和野生型植株中的农艺性状调查：实施例9：gmmyb68转基因植株中抗逆相关基因的表达利用荧光实时定量pcr对转基因植株及野生型植株中抗逆相关基因的表达水平进行检测，相对表达量通过比较转基因植株和同一处理条件下的野生型植株获得。其中：gmabi5为aba信号途径关键调控因子；dreb2为对植物高盐、干旱及低温胁迫的分子反应调控基因；gmnhx1为na+/h转运蛋白基因；pal为苯丙烷代谢途径的关键酶苯丙氨酸解氨酶；gmnpr1-1和gmnpr1-2与植物病程反应相关的基因，上述5个基因已经文献证实与植物在逆境胁迫下的应激反应具有重要关系。表6试验中使用的引物：所有的抗逆相关基因对盐和碱胁迫均有不同程度的响应，在gmmyb68转基因植株中，抗逆相关基因积累了较高的表达量，说明这些基因的转录水平受到gmmyb68过量表达的影响，并且参与到由gmmyb68调控的盐碱胁迫响应机制中。其中，与野生型相比，gmabi5和dreb2在转基因植株中涨幅明显。另外，我们还发现了两个在广谱抗病功能上发挥作用的转录因子，gmnpr1-1和gmnpr1-2在转基因植株中也有着显著的高转录水平(p＜0.01)，表明gmmyb68在生物胁迫方面也起到一定的作用。序列表<110>吉林大学<120>一种大豆耐盐相关myb转录因子及其编码基因与应用<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>780<212>dna<213>人工合成(人工序列)<400>1atggatcggataaaagggccatggagtcctgaagaggacgaagcgttacggaggttggtt60cagacttacggccctaggaactggtccgttataagcaaatccattccgggtcggtctggg120aaatcgtgccgcttgcggtggtgcaaccagctgtctccggaggtggagcgccggcctttc180acggcggaggaagacgaggcgatcctgaaggctcacgccaggttcgggaacaagtgggcc240accatcgcgcgcttcctcaatggccgcaccgacaacgccatcaagaaccattggaattcc300accctcaagaggaagtgctccgagcctctctccgagcctcggcctctgaagagatccgcc360accgtttcgggtagtcaatccggatccgatttgagcgattcgggtttacccattattctt420gcaagaagcgtgagcgtgacggtagctccctctaaccaccttgcggaaaccgcgtcttct480tcagtaactgatcctgccacgttattgagtttgtctctaccgggattcgattcgtgcgat540ggggctaataatgggcctgggccgaatcaggggcccagttgcggcccgttccaggagata600ccgatgcttggttcccaaaagcagttgttcagccaagagtttatgaaggtgatgcaagag660atgatacgagtggaagtgagaaattacatgtctgtactggaacgtaatggtgtgtgtatg720caaaccgatgccattaggaactcggtgttggagaggatgggaattggtagggttgaataa780<210>2<211>259<212>prt<213>人工合成(人工序列)<400>2metaspargilelysglyprotrpserproglugluaspglualaleu151015argargleuvalglnthrtyrglyproargasntrpservalileser202530lysserileproglyargserglylyssercysargleuargtrpcys354045asnglnleuserprogluvalgluargargprophethralagluglu505560aspglualaileleulysalahisalaargpheglyasnlystrpala65707580thrilealaargpheleuasnglyargthraspasnalailelysasn859095histrpasnserthrleulysarglyscyssergluproleuserglu100105110proargproleulysargserala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