本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种人pd-1蛋白胞外段亲和环肽c8及其应用。
背景技术：
肿瘤，尤其是恶性肿瘤是影响全球发病率和死亡率的主要原因之一，肿瘤的治疗方法有传统的手术切除、放射性治疗、化学药物治疗等，也有新兴的肿瘤免疫疗法。肿瘤免疫疗法是通过激发机体自身的免疫、改善自身免疫能力对肿瘤细胞进行杀伤，并且能够建立免疫记忆，阻止肿瘤的复发和转移，从而达到抗肿瘤效果。随着研究的深入，肿瘤免疫疗法获得越来越获多的关注，并于2013年被《科学》杂志评为十大科学突破之首。
在肿瘤免疫治疗中，cd8+t细胞是主要杀伤肿瘤的效应细胞，其激活过程需要通过mhc-i类分子介导的细胞免疫应答，激活过程中有两个信号，第一是识别信号，即肿瘤抗原等内源性抗原被树突状细胞（dc）等抗原递呈细胞（apc）加工处理以后以mhc/表位复合物的形式递呈至apc表面，该复合物被t细胞表面的t细胞受体（tcr）识别，进而激活t细胞识别抗原的第一信号；与此同时，apc表达的共刺激分子和t细胞表面的对应受体或配体相互作用，产生t细胞活化的第二信号。根据第二信号产生的效应不同，可将共刺激分子分为正性共刺激分子和负性共刺激分子，其中负性共刺激分子在肿瘤免疫治疗过程中能够引起cd8+t细胞等效应细胞耗竭或者失活，从而引起肿瘤的免疫耐受和逃逸，负性共刺激分子中研究较为深入的是细胞毒t淋巴细胞相关抗原4（ctla-4）和程序性细胞死亡蛋白1（pd-1）。
pd-1最早是在发生程序性死亡的细胞株中通过消减杂交的方法发现的，由288个氨基酸组成，相对分子质量是55,000da，是i型跨膜糖蛋白，其胞外区包含一个igv样结构域，有4个重要的n连接糖基化位点，并被重度糖基化。pd-1主要表达于活化的t细胞、b细胞和髓系细胞表面。其公认的配体有pd-l1和pd-l2，由于pd-l2配体可能不仅仅是pd-1，因此，在抗肿瘤研究中主要把pd-l1作为pd-1的配体。pd-1/pd-l1信号在肿瘤的发生过程中，可以产生抑制t淋巴细胞活性，发生免疫耐受、促进肿瘤免疫逃逸的作用。因此，通过阻断pd-1/pd-l1信号通路，可以有效激活机体t淋巴细胞活化，进而杀伤肿瘤细胞。
现有的研究已经表明pd-1/pd-l1信号通路是cd8+t细胞活化过程中非常重要的负性调控通路，可以引起肿瘤免疫耐受和逃逸，因此，研究通过阻断pd-1/pd-l1负性共刺激分子所介导的信号通路，打破肿瘤细胞的免疫耐受具有重要的理论意义和应用价值。
技术实现要素：
本发明提供了一种人pd-1蛋白胞外段的亲和环肽c8，并经过实验证明了该亲和环肽c8具有抗肿瘤活性。
本发明采取的详细技术方案如下：
一种人pd-1蛋白胞外段的亲和环肽c8，该亲和环肽包含9个氨基酸，其氨基酸序列如seqidno.1所示，具体为：cys-lys-trp-tyr-arg-pro-ser-glu-cys，即：c-k-w-y-r-p-s-e-c，其中氨基酸序列中首尾两端的两个半胱氨酸c之间形成一个二硫键（s-s），将肽首尾链接成为环状，该环肽分子量为1169.35，亲和环肽c8结构式如下图所示。
所述人pd-1蛋白胞外段的亲和环肽c8在抗肿瘤免疫治疗或者制备抗肿瘤相关药物中的应用。
所述应用中，肿瘤包括表达pd-l1蛋白的肿瘤。
进一步地，所述表达pd-l1蛋白的肿瘤包括结肠癌、黑色素瘤。
所述应用中，抗肿瘤相关药物包括亲和环肽c8、以亲和环肽c8为基础的改造肽及其类似物。
本发明有益效果：
本发明以rhpd-1-fc为靶分子，通过液相筛选法进行噬菌体展示环七肽库高通量技术筛选时获得了人pd-1蛋白胞外段亲和环肽c8。针对该环肽进一步的体外亲和力实验、阻断pd-1/pd-l1蛋白结合实验和小鼠荷瘤实验表明，亲和环肽c8作用目标明确，对表达pd-l1蛋白的肿瘤抑制效果明显，且无明显毒副作用，因而具有较好的医疗应用前景，为肿瘤免疫治疗提供了新的选择。
附图说明
图1为人pd-1蛋白胞外段亲和环肽c8的esi-ms质谱分析鉴定结果图；
图2为人pd-1蛋白胞外段亲和环肽c8与人pd-1蛋白的亲和力实验结果图；
图3为人pd-1蛋白胞外段亲和环肽c8阻断pd-1/pd-l1蛋白结合的实验结果图；
图4为表达pd-l1蛋白的肿瘤细胞结果图；
图5为接种ct26的babl/c小鼠肿瘤中表达pd-1+cd8+t细胞的实验结果图；
图6为人pd-1蛋白胞外段亲和环肽c8对接种ct26的babl/c小鼠体重变化的影响结果图；
图7为人pd-1蛋白胞外段亲和环肽c8对接种ct26的babl/c小鼠移植瘤体积变化的影响结果图；
图8为人pd-1蛋白胞外段亲和环肽c8对接种ct26的babl/c小鼠的移植瘤瘤重的影响图；
图9为人pd-1蛋白胞外段亲和环肽c8对接种b16的c57bl/6j小鼠体重变化的影响结果图；
图10为人pd-1蛋白胞外段亲和环肽c8对接种b16的c57bl/6j小鼠移植瘤体积变化的影响结果图；
图11为人pd-1蛋白胞外段亲和环肽c8对接种b16的c57bl/6j小鼠的移植瘤瘤重的影响图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是下列实施例仅用于说明本发明，而不应该为限制本发明的范围。
主要试剂：
牛血清白蛋白（bsa），索莱宝生物科技有限公司；
胎牛血清（fbs），以色列bi公司；
dmso为普通市售产品；
常用培养基和溶液：
主要有lb培养基、上层琼脂、lb/iptg/x-gal平板、proteina/gmixmagneticbeads、tbs缓冲液（50mmtris-hcl（ph7.5），含有150mmnacl）、tris-hcl（ph9.1）中和液、peg-8000/nacl沉淀液、tris-t缓冲液、洗脱液（0.2mglycine-hcl[ph2.2]，1mg/mlbsa）、中和液（1mtris-hcl[ph9.1]）、蛋白标记试剂盒monolithnt™proteinlabelingkitred-nhs、pbs7.2、bsa、tween-20、tbst洗涤液缓冲液均按照现有技术制备即可，不再详细描述；
主要仪器：
mst仪器，德国nanotemper技术有限公司；
流式检测仪，美国bd公司；
生物材料：
er2738菌，美国newenglandbiolabs,inc.公司；
anti-humanigg1-fcpe抗体，ebioscience公司；
higg1-fc蛋白，acrobiosystems公司；
ct26细胞、mc38细胞、b16细胞、b16-f10细胞、4t-1细胞、lewis细胞、cho-k1-hpd-l1细胞，来源于atcc细胞库；
接种结肠癌ct26的babl/c小鼠，接种黑色素瘤b16的c57bl/6j小鼠，小鼠购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。
实施例1
为便于本领域技术人员具体实施本发明，发明人对pd-1蛋白胞外段的亲和环肽c8的筛选过程简要说明如下：
利用噬菌体展示环七肽库筛选人pd-1的亲和环肽。
简要步骤如下：
（1）采用液相筛选法进行噬菌体展示环七肽库的筛选工作；
（2）经过5轮的筛选后，与靶蛋白人pd-1胞外段有亲和力的噬菌体单克隆逐轮得到富集；
（3）然后从第5轮中挑选阳性克隆进行测序，共得到多个插入环七肽序列，即亲和环七肽序列，其中4个具有重复克隆，亲和环肽c8为其中之一。
具体过程如下：
（1）测定噬菌体滴度
接种er2738单菌落于10mllb培养基中，摇床培养至对数期（od600值约为0.5)。用lb培养基将噬菌体进行10倍系列稀释。稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108~1012；未扩增的淘选洗脱物：101~105。将已达到对数期的菌体每200μl装入一微量离心管中，然后每管加入10μl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温孵育5min。将感染菌体加入45℃预温的上层琼脂培养管中，快速混匀，立即倾注于37℃预温的lb/iptg/xgal平板上，使其均匀铺开。待平板冷却15min后，倒置于37℃培养过夜。第二天检查平板，计数有~102个噬菌体的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10μl噬菌体的空斑形成单位（pfu）滴度。
（2）淘选过程
①第1轮淘选
预处理：将proteina/gmixmagneticbeads悬液混匀后取5μl于无菌1.5ml离心管，tbs洗涤2次；
封闭：加入1ml封闭液（tbs+1%bsa）4℃封闭磁珠1h；
蛋白和噬菌体结合：封闭期间，取另一只无菌1.5ml离心管，加rhpd-1-fc蛋白2.5μg（10μltbs溶解）+180μltbs+10μl环七肽库（2×1011个噬菌体），室温结合20min；
洗涤：含磁珠的离心管置于磁力架上，吸弃封闭液，加入0.1%tbst（tbs+0.1%tween-20）洗涤4次；
蛋白和磁珠结合：将结合后的蛋白和噬菌体混合液转移至磁珠中，室温结合20min；
洗涤：含磁珠的离心管置于磁力架上，吸弃液体，加入0.1%tbst洗涤5次；
洗脱：加入1ml洗脱液（0.2mglycine-hcl[ph2.2]，1mg/mlbsa），室温洗脱10min；
中和：加入150μl中和液（1mtris-hcl[ph9.1]）中和上述洗脱液；
滴度测定：测定洗脱液中噬菌体滴度；
扩增：将er2738过夜培养菌以1:100的体积比稀释于20mllb培养基中，加入未扩增洗脱物。37℃剧烈摇动培养4.5小时；
沉淀：将培养物转入无菌离心管中，4℃10000rpm离心10min，上清液转入另一无菌离心管中再离心。将上清的上部80%转入一新鲜管，加入1/6体积的peg-8000/nacl。让噬菌体4℃沉淀过夜。4℃10000rpm离心peg沉淀15min。倒掉上清，再短暂离心，吸去残留上清液。沉淀物重悬于1mltbs中，悬液转入微量离心管中，加入1/6体积的peg-8000/nacl再沉淀。冰上孵育15~60min，4℃10000rpm离心10min，弃上清。沉淀物重悬于200μltbs中，离心1min，沉淀任何残余的不溶物，上清转入新鲜管中，此即为扩增后的洗脱物，并测定其滴度。
②第2轮淘选
预处理：将proteina/gmixmagneticbeads悬液混匀以后取5μl于无菌1.5ml离心管中，加入tbs洗涤2次；第2轮到第5轮淘选该步骤制备两支；
封闭：加入1ml封闭液4℃封闭磁珠1h；
噬菌体结合fc蛋白：在封闭50min时，取另一支无菌1.5ml离心管，加入2.5μghigg1-fc蛋白和全部第1轮淘选扩增后的洗脱物（约200μl），室温结合20min；
洗涤：取一支封闭过的含磁珠离心管置于磁力架上，吸弃封闭液，加入0.1%tbst洗涤4次；
差向fc蛋白：将“噬菌体结合fc蛋白”步骤的混合液加入磁珠中，结合20min；此步骤后，结合fc蛋白的噬菌体被固定在磁珠上除去，经磁珠分离以后获得上清液备用；
结合：取另一只无菌1.5ml离心管，加入上步获得的上清液，再加入rhpd-1-fc蛋白1.5μg（10μltbs溶解），室温结合20min；
洗涤：取另一支封闭过的含磁珠离心管置于磁力架上，吸弃封闭液，加入0.1%tbst洗涤4次；
蛋白和磁珠结合：将结合后的蛋白和噬菌体混合液转移至磁珠中，室温结合20min；
洗涤：含磁珠的离心管置于磁力架上，吸弃液体，加入0.2%tbst洗涤10次；
洗脱：加入1ml洗脱液，室温洗脱10min；
中和：加入150μl中和液中和上述洗脱液；
滴度测定：测定洗脱液中噬菌体滴度；
扩增：同第1轮；
沉淀：同第1轮。
③第3-5轮淘选
与第2轮淘选步骤类似，在淘选过程中，第3-5轮rhpd-1-fc蛋白使用量逐步减少；最后一次tbst洗涤磁珠时所用tween-20浓度逐步增加。
（3）噬菌体扩增
将er2738过夜培养的菌液以1:100的比例接种于lb液体培养基，2ml/管分装到无菌试管中；挑取最后一轮淘选产物滴度平板的单一蓝色噬菌体到上述培养基中，37℃摇床剧烈振荡培养5h；培养结束后4℃、13000rpm离心10min，上清转入新的无菌1.5ml离心管中保存，即为扩增的噬菌体储存液。
（4）噬菌体dna序列测定及多肽序列同源性分析
取上步噬菌体储存液进行噬菌体克隆dna测序；根据dna序列推导其所编码的氨基酸序列，并利用dnaman软件对获得的氨基酸序列进行同源性分析。结果表明，在第5轮阳性克隆中共得到多个插入环七肽序列，即特异性结合人pd-1蛋白的环七肽序列，其中4个具有重复克隆，亲和环肽c8为其中之一，该亲和环肽c8的氨基酸序列如seqidno.1所示，具体为：cys-lys-trp-tyr-arg-pro-ser-glu-cys，即：c-k-w-y-r-p-s-e-c，其中氨基酸序列中首尾两端的半胱氨酸c之间形成一个二硫键s-s，将肽首尾链接成为环状。
对人pd-1蛋白胞外段亲和肽环c8进行esi-ms质谱分析，esi-ms质谱分析鉴定结果如图1所述。
实施例2
本实施例主要以人pd-1蛋白胞外段亲和环肽c8与人pd-1的亲和效果进行了体外mst实验（分子间相互作用分析技术）检测，相关实验情况介绍如下。
（1）人pd-1蛋白标记
用蛋白标记试剂盒中的标记缓冲液调整蛋白浓度至2-20μm，取100μl备用；向蛋白标记试剂盒中的荧光染料中加入30μl100%dmso，涡旋得到混合染料；使用标记缓冲液将混合染料的浓度调节至蛋白质浓度的2-3倍；以体积比为1:1的比例混合蛋白质和混合染料，室温避光孵育30min。
（2）标记人pd-1蛋白的纯化
取出纯化柱顶盖，倒出其中存储溶液，取下底盖并放入15ml试管，加入3ml的10%tween-20tris-t缓冲液平衡和洗涤纯化柱，共3次；向纯化柱中加入上步标记的蛋白，让样品完全进入柱床并丢弃流穿溶液；置于新的15ml试管中，加入600μl10%tween-20tris-t缓冲液并收集洗脱液；检测标记效率后，分装标记蛋白并于-80°c保存。
（3）mst检测
准备16个200μlep管，标记为1-16，向第1个ep管中加入20μl500μm的亲和环肽c8溶液，然后将管1中的亲和环肽c8溶液用10%tween-20tris-t缓冲液倍比稀释至2-16管中；向1-16管中加入10μl标记的人pd-1蛋白，混匀；室温孵育5min后，用毛细管吸取1-16管中的混合溶液，按照从高浓度到低浓度从上至下依次排列于毛细管板条上，并开始mst仪器检测。
mst检测亲和环肽c8与人pd-1蛋白亲和力实验结果图如图2所示。结果显示，亲和环肽c8和pd-1蛋白的结合kd值为13.5μm，表明亲和环肽c8可以与人pd-1蛋白有效结合。
实施例3
本实施例主要以人pd-1蛋白胞外段亲和环肽c8与pd-1的亲和效果进行了体外阻断实验，相关实验情况介绍如下。
（1）分别将5×105个cho-k1-hpd-l1细胞与不同浓度的pd-1-fc融合蛋白在冰上孵育30min，然后加anti-humanigg1-fcpe抗体在冰上孵育30min，pbs7.2洗涤一次后经流式检测，发现pd-1-fc融合蛋白在25ng时即可使cho-k1-hpd-l1细胞发生明显的位置偏移；
（2）用pbs7.2缓冲液配置亲和环肽c8，配置浓度分别为0.1μm、1μm、10μm、100μm，然后与25ng的pd-1-fc融合蛋白在冰上孵育30min；
（3）把孵育后的上述包含亲和环肽c8和pd-1-fc融合蛋白的混合液与5×105个cho-k1-hpd-l1细胞在冰上共同孵育30min，同时5×105个cho-k1-hpd-l1细胞加25ngpd-1-fc融合蛋白在冰上共同孵育30min作为阳性对照；
（4）上述细胞加入anti-humanigg1-fcpe抗体在冰上孵育30min，pbs7.2洗一次后经流式检测。
不同浓度亲和环肽c8的实验结果如图3所示。从图3可以得知，与阳性对照（不加亲和环肽c8）组相比，亲和环肽c8在所有浓度均对峰图偏移产生了影响，其中在10μm和100μm时，对应的峰图偏移程度较大，表明亲和环肽c8具有较好的阻断pd-1/pd-l1结合的效果。其中横坐标fl2-h：pe表示平均荧光强度。结果表明亲和环肽c8可以阻断pd-1/pd-l1的结合。
实施例4
本实施例主要检测ct26、mc38、b16、b16-f10、4t-1和lewis等实体瘤细胞的pd-l1表达情况，相关实验情况介绍如下。
（1）分别将5×105个ct26、mc38、b16、b16-f10、4t-1和lewis肿瘤细胞与pd-l1流式抗体及相对应的对照流式抗体冰上孵育30min；
（2）pbs7.2洗涤一次后经流式检测。
流式检测结果如图4所示，孵育pd-l1流式抗体的峰图（虚线图）较孵育对照流式抗体的峰图（阴影图）发生了明显的位置偏移，表明以上ct26、mc38、b16、b16-f10、4t-1和lewis等实体瘤细胞均不同程度表达pd-l1蛋白。
实施例5
本实施例主要检测接种结肠癌ct26的babl/c小鼠肿瘤中表达pd-1的cd8+t细胞占总cd8+t的比例，相关实验情况介绍如下：
（1）于小鼠右侧背部接种1×105个瘤细胞，小鼠自由饮食；
（2）待小鼠肿瘤生长22天后处死小鼠，取出小鼠肿瘤剪碎研磨，滤网过滤形成单细胞悬液后细胞计数，取1×107个细胞与cd45、cd3、cd8/cd4和pd-1流式抗体及相对应的对照流式抗体冰上孵育30min；
（3）pbs7.2洗涤一次后流式检测。
本实施例中流式检测结果如图5所示，分析肿瘤部位浸润的cd8+t细胞表达pd-1的情况。结果显示，在肿瘤部位，pd-1+cd8+t细胞数量占到表达cd3+细胞总数的9.99%，表明在肿瘤部位cd8+t细胞高表达pd-1。
实施例6
为进一步检验亲和环肽c8的抗肿瘤活性，发明人以亲和环肽c8进一步做了抗肿瘤相关实验具体实验情况如下：
实验过程如下：
（1）于每只小鼠的右侧背部接种1×105个瘤细胞，待小鼠的瘤体积达到50~80mm3时按瘤体积大小s型分组，分为2组，分别为亲和环肽c8组和生理盐水组（阴性对照组），每组6只。
亲和环肽c8直接溶于生理盐水配成0.20mg/ml的溶液，具体制备时，将pd-1亲和环肽c8直接溶于生理盐水后，过滤除菌，分装，保存于-20℃备用。
（2）瘤旁皮下给药的方式注射，亲和环肽c8组按照2mg/kg/d，共给药14天，生理盐水组（阴性对照组）同样采用瘤旁皮下注射的给药方式，注射量为0.2ml。实验期间小鼠自由进食和饮水。
（3）隔日测量小鼠体重并记录，绘制曲线，以检验亲和环肽c8毒副作用，结果如图6（ct26）、图9（b16）所示；隔日测量肿瘤的长（a）短（b）径及高（c），并按公式计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线，结果如图7（ct26）、图10（b16）所示，计算公示为：v=1/2×a×b×c。
给药结束的第二天将小鼠脱颈处死取出肿瘤并称重，称量结果如图8（ct26）、图11（b16）所示。
从图6和图9结果显示，亲和环肽c8给药组小鼠的体重变化与对照组小鼠的体重变化相比较没有明显差异，均在正常值范围内，表明亲和环肽c8没有对小鼠的体重造成明显影响，无明显的毒副作用。
从图7、图10结果显示，在小鼠肿瘤生长至50~80mm3时，亲和环肽c8给药组的小鼠瘤体积与对照组小鼠的瘤体积相比无明显差异，在给药14天后，亲和环肽c8给药组的小鼠瘤体积要明显小于对照组小鼠的瘤体积，具有统计学差异；从图8、图11结果显示，在给药14天后的第二天取两组小鼠的肿瘤并称重，发现亲和环肽c8给药组的小鼠瘤重要明显小于对照组小鼠的瘤重，具有统计学差异。从瘤体积和瘤重两方面均表明亲和环肽c8有较好的抗肿瘤活性。
尽管以用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其他的更改和修改，因此，这意味着在所述权利要求中包括本发明范围的所有变化和修改均属于本发明保护范围。
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<110>郑州大学
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