用于检测空间环境中的真菌的引物组合、试剂盒及方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及用于检测空间环境中的真菌的引物组合、试剂盒及方法。

背景技术：

虽然对空间设施中的微生物浓度有严格的规定，但在轨空间站例如和平号空间站和国际空间站的调查表明，微生物在这些设施中是普遍存在的。Aspergillus niger、Ulocladium botrytis和Cladosporium herbarum等真菌种属的孢子广泛存在于在轨和平号空间站。这些环境中的微生物对宇航员健康有潜在的影响。特别是，过量存在的真菌可能会导致过敏，霉菌毒素中毒症，或严重的真菌病。与此同时，研究表明造成航天器设备故障的主要微生物也是是真菌。

鉴于此，快速和高度敏感的真菌监测技术在评估太空设施和相关环境的污染方面是必不可少的。

目前，NASA制定的真菌检测方法是基于培养的方法。这种方法费时费力，且易造成二次生物污染。此外，大多数的气溶胶病原体是一种活的非可培养状态，不能用培养方法检测。而基于PCR的方法无需培养，因此可以用于替代基于培养的真菌检测方法。其中，qPCR(quantitative PCR)是一种非常有效的定量监测地球上真菌的方法，但将这种技术应用于空间环境，例如在轨空间站的检测需要进一步改进简单性、灵敏度、定量能力和成本效益。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种引物组合，其包括引物F3、B3、FIP和BIP，所述引物组合为与环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)配套使用的引物组合，能够通过LAMP技术、优选通过qLAMP技术，对空间环境中常见的多种真菌同时进行检测，具有检测范围广、特异性好、灵敏度高、检测周期短、不存在二次污染等优点，特别适合在太空中进行在轨检测。

本发明的第二目的在于提供一种试剂盒，将前述引物组合和辅助检测试剂集成于同一试剂盒，具有使用方便的优点。

本发明的第三目的在于提供一种检测空间环境中的真菌的方法，所述方法使用前述引物组合或前述试剂盒进行LAMP试验，能够对空间环境中常见的多种真菌同时进行检测，具有检测范围广、特异性好、灵敏度高、检测周期短、不存在二次污染等优点，特别适合在太空中进行在轨检测。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种引物组合，包括引物F3、B3、FIP和BIP，其中，引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

在付出大量创造性劳动后，本发明获得前述引物组合。本发明所述引物组合为特异性针对空间环境(如在轨空间站)中常见真菌的LAMP引物，其能够通过LAMP检测方法对空间环境中的多种真菌进行广谱、灵敏而特异的检测，为在空间环境下实地快速、准确地检测真菌提供可能。

具体而言，首先，前述引物组合为针对实施例1分离获得的34株真菌的保守区域专门设计的广谱性检测引物。实施例1所述34株真菌虽然都属于真菌，但涉及12个不同属，遗传性质差异大，基因组序列在整体上的保守性并不强，因此尽管是针对保守区域进行引物设计，但想要获得扩增效率好的光谱性检测引物仍然存在较高的设计难度。其次，考虑到所述引物组合的检测样本来自空间环境，所述引物组合还要求不会对空间环境中的常见的细菌和人体来源样本发生非特性扩增，进一步增加引物的设计难度。再者，本发明所述引物组合为LAMP引物，每个引物组合涉及4条引物并涉及环状结构的形成，比一般广谱性引物的设计难度更大。申请人根据自身经验，在从整体上对引物组合的广谱性、特异性和灵敏度进行综合考虑后，共设计6对在理论上可行的引物组合。但实际检测结果(参见实验例1～2)表明，仅其中引物组合1(即，本发明前述引物组合)符合前述要求，其对34株空间环境真菌的检测结果为阳性，对人血细胞和40株空间环境细菌的检测结果为阴性。而其余5对引物组合的扩增效率差，无法实现广谱性检测。

另外，本发明所述引物组合为LAMP配套引物。通过LAMP技术，本发明所述引物可以在恒温条件下快速扩增获得大量的目标DNA产物，并可实现等量检测，比传统PCR检测方法更简单、快捷和高效，便于在空间环境下进行原地检测并实时获得检测结果，而不需要将收集的样品返回地球后再进行检测。根据本发明实验例3所述结果可知，本发明所述方法的检测限达到10¹copies/μl，远高于常规PCR检测方法的最低检测限10²-10⁹copies/μl。同时根据实验例4的检测结果可知，在洁净度高的空间环境中(EHa-4/17-4)，仅本发明所述方法能够获得检测结果。

在一些具体的实施方式中，所述引物F3、B3、FIP和BIP均为独立包装，或其中至少两种引物发生混合。

本发明还涉及一种试剂盒，所述试剂盒包括前述引物组合和辅助检测试剂。

在一些具体的实施方式中，所述辅助检测试剂包括dNTPs、PCR缓冲液、Bst DNA聚合酶和指示剂中的一种或多种。

在一些具体的实施方式中，所述PCR缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、甜菜碱和曲拉通；优选地，所述曲拉通为曲拉通X-100。

在一些具体的实施方式中，所述指示剂选自DNA指示剂或Mg²⁺指示剂；优选地，所述DNA指示剂为荧光指示剂，所述荧光指示剂包括SYBR Green I、Eva Green、PicoGreen、Peko Green、SYTO系列或碘化丙啶；优选地，所述Mg²⁺指示剂选自钙黄绿素、羟基萘酚蓝、甲酚红、酚红、间甲酚紫、溴甲酚紫、中性红、萘酚酞或百里酚蓝。

本发明还涉及一种检测空间环境中的真菌的方法，使用前述引物组合或前述试剂盒对待测样本进行环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)；优选地，所述环介导等温扩增的扩增温度为60～65℃，更优选为62～64℃，最优选为63℃；优选地，扩增时间为40～90min，更优选为50～70min，最优选为60min。

本发明所述方法为LAMP检测方法，所述方法能够在短时间内快速扩增获得大量目标DNA，检测样本中是否含有34株空间环境中常见的真菌菌株，比传统PCR检测方法更简单、快捷和高效。优选地，本发明所述方法还可以进行定量检测，不但可以获得实时检测结果，还可以避免二次污染，检测结果更准确。因此，本发明所述方法适合用于检测空间环境中的真菌，尤其适合在空间环境下进行原地实时检测，而不需要将收集的样品返回地球后再进行检测。

为获得活菌和总菌数量信息，在一些具体的实施方式中，所述待测样本被分为两份，加入或者不加入叠氮溴化丙啶后分别进行环介导等温扩增。

为增强检测准确性，促进真菌的破壁和DNA的释放，在一些具体的实施方式中，所述待测样本通过以下方式获取：使用凝胶膜从空间环境收集待测样本，之后将凝胶膜溶解在缓冲液中，离心，对离心所得沉淀进行速冻、研磨和超声破碎处理。

为避免检测产物与外界接触而被污染，在一些具体的实施方式中，所述方法为定量检测方法，优选地，所述定量检测方法在扩增过程中进行实时定量检测。

在一些具体的实施方式中，引物F3、B3、FIP和BIP的摩尔浓度比为0.2～0.3:02～0.3:0.8～1.2:0.8～1.2，优选为0.25:0.25:1:1。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明涉及的引物组合、试剂盒以及检测方法能够同时对空间环境中常见的多种真菌进行LAMP检测，具有检测范围广、特异性好、灵敏度高、检测周期短、不存在二次污染等优点，特别适合在空间中进行在轨实时检测。

(2)本发明所述方法还对样品处理方式进行改进，其中包括对样品进行多重破壁处理，从而促进真菌细胞壁的破裂和DNA的释放，其次，所述样品还可通过加入/不加入PMA的方式对样品中真菌总数和活菌数分别进行检测，从而获得有用的检测信息。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为从空间站组装环境中分离获得的34株真菌及其系统发育地位；

图2为使用实施例1所述引物组合进行LAMP反应获得检测结果，其中M代表DL2000marker，1代表引物组合2，2代表引物组合3，3代表引物组合4，4代表引物组合5，6代表引物组合1；

图3为使用引物组合1对不同样品进行LAMP反应的检测结果，其中M代表DL2000marker，1代表Penicillium sp.Strain TJ-2-1(阳性对照)，2代表人血基因组样品，3代表拟南芥基因组样品，4代表大肠杆菌基因组样品，5代表金黄色葡萄球菌基因组样品，6代表芽孢杆菌基因组样品；

图4为LAMP(引物组合1)的灵敏度检测结果；

图5为PCR的灵敏度检测结果；

图6为qLAMP(引物组合1)和qPCR的灵敏度检测结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。

实施例1

从空间站组装环境中分离获得34株真菌，涉及曲霉属、青霉属、拟青霉属、组织胞浆菌属、发癣菌属、帚霉属、镰孢霉属、毛壳属、外瓶霉属、念珠菌属、马拉色氏霉菌属和红酵母属等共11个不同的真菌属(参见图1)。

从空间站组装环境中分离获得40株空间环境细菌(共包含12个属：Bacillus、Paenibacillus、Staphylococcus、Lactococcus、Sphingomonas、Pseudomonas、Cronobacter、Janthinobacterium、Streptomyces、Parapusillimonas、Acinetobacter、Arcobacter和Enterococcus)。

针对所述34株真菌的保守序列28S rRNA，设计能够同时检测分离所得多种真菌的LAMP引物组合，共获得引物组合1～6并合成，所述引物组合1～6的具体序列如表1所示。

表1 LAMP引物组合

实施例2

建立一种检测空间站组装环境的空气中真菌的LAMP方法，具体操作如下：

1、微生物采集

利用Sartorius MD8空气微生物采样器，用75％酒精对采样头进行杀菌处理后安装凝胶膜，以50L/min的流速进行共2000L气体的采集。

2、样品处理及基因组DNA提取方法

采集完成后从撑网上取下凝胶膜将其完全溶于30ml无菌PBS溶液中。将30ml PBS溶液等分为2份，每份共15ml。其中一份加入200μM终浓度的叠氮溴化丙锭(PMA)进行处理。

将两份PBS溶液进行三步预处理：第一步，12000rpm转速下离心10min后弃上清，将沉淀在液氮中进行速冻；第二步，而后立刻用球磨仪进行充分研磨；第三步，最后在65℃水浴中进行30min超声破碎。预处理结束后利用E.Z.N.A.Soil DNA kit试剂盒遵照说明书进行基因组DNA的提取，得到的DNA等待LAMP的后续分析。

3、LAMP实验条件

qLAMP使用的引物：实施例1设计合成的引物组合1～6。

qLAMP的反应体系(25μl)，如下所示：

qLAMP的反应条件：在63℃进行1h。

检测方式：常规检测方式——扩增反应结束后，通过凝胶电泳的方式对检测结果进行检测；定量检测方式——在扩增过程中，实时检测扩增产物，根据Ct值对检测结果进行定量分析。

对比例1

1、微生物采集

利用Sartorius MD8空气微生物采样器，用75％酒精对采样头进行杀菌处理后安装凝胶膜，以50L/min的流速进行共2000L气体的采集。

2、样品处理及基因组DNA提取方法

采集完成后从撑网上取下凝胶膜将其完全溶于30ml无菌PBS溶液中。将30ml PBS溶液等分为2份15ml。其中一份以200μM终浓度的叠氮溴化丙锭(PMA)进行处理。

将两份PBS溶液进行三步预处理：第一步，12000rpm转速下离心10min后弃上清，将沉淀在液氮中进行速冻；第二步，而后立刻用球磨仪进行充分研磨；第三步，最后在65℃水浴中进行30min超声破碎。预处理结束后利用E.Z.N.A.Soil DNA kit试剂盒遵照说明书进行基因组DNA的提取，所得DNA用于后续qPCR反应。

3、PCR实验条件

引物序列：上游引物：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′(SEQ ID NO：25)；下游引物5，-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′(SEQ ID NO：26)。

反应体系(25μl)：Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI,CA,USA)：12.5μl；上游引物：0.5μl；下游引物：0.5μl；水：11.5μl。

反应条件：变性95℃(15min)；95℃(15sec)解离，60℃(1min)退火延伸(解离和退火延伸共45个循环)。

检测方式：常规检测方式——扩增反应结束后，通过凝胶电泳的方式对检测结果进行检测；定量检测方式——在扩增过程中，实时检测扩增产物，根据Ct值对检测结果进行定量分析。

对比例2

参照对比例1所述方法进行PCR反应，区别仅在于，步骤2如下所示：采集完成后从撑网上取下凝胶膜将其完全溶于30ml无菌PBS溶液中，之后利用E.Z.N.A.Soil DNA kit试剂盒遵照说明书对PBS溶液进行基因组DNA的提取，所得DNA用于后续qPCR反应(样品未经过离心、速冻、研磨和超声破碎的前处理，样品中也未加入PMA)。

实验例1

以包括Penicillium sp.的28S rRNA基因的质粒为模板、引物组合1～6为扩增引物，参照实施例2所述实验条件进行LAMP试验，检测结果如图2所示。根据图2所示结果可知，仅引物组合1扩增得到目的片段，检测结果表现为阳性，与实际情况一致，而引物组合2～5均未扩增获得目的片段，检测结果表现为假阴性。

实验例2

分别以实施例1分离所得34株真菌、人血细胞、拟南芥植物以及空间站组装环境中分离获得的40株细菌为检测对象，以引物组合1为扩增引物，参照实施例2所述实验条件进行LAMP试验，其中，对34株真菌的检测结果均为阳性，对人血细胞、拟南芥植物以及40株细菌的检测结果均为阴性。部分检测结果如图3所示。

实验例3

以包括Penicillium sp.的28S rRNA基因且已知拷贝数的质粒为模板、引物组合1为扩增引物，参照实施例2所述实验条件进行LAMP试验；同时以包括Penicillium sp.的ITS1基因且已知拷贝数的的质粒为模板进行PCR反应，以比较两种方法的灵敏度。其中，LAMP的试验结果如图4所示，PCR的结果如图5所示。根据图4～5的试验结果可知，本发明所述LAMP试验最低检测限能达到10¹copies/μl，在10²-10⁹copies/μl范围内，标准曲线R²值为0.998，而传统qPCR的检测限最低为10³copies/μl。

实验例4

应用Sartorius MD8空气微生物采样器对空间站组装过程中的组装大厅(EHa-4/17-2)和(EHa-5/17-2)、工作人员更衣间(EHa-4/17-4)、空间站舱内部空气(CIa-5/17-2)进行采样，每个采样40min，并做3个重复。参照实施例2、对比例1～2所述反应条件对前述采集的样本进行qLAMP试验和qPCR试验。具体检测结果如图6所示。

根据图6所示结果，比较对比例1(经样品前处理但未加PMA)和对比例2(未经前处理且未加PMA的样品)的实验结果可知，样品前处理步骤对于真菌的破壁和基因组DNA的释放具有显著作用，可以明显提高真菌数量的检测率。比较实施例2(经样品前处理但未加PMA(检测总菌数)、经样品前处理且加PMA(检测活菌数))和对比例2(经样品前处理但未加PMA(检测总菌数)、经样品前处理且加PMA(检测活菌数))可知，对于洁净度高的更衣间空气样品(EHa-4/17-4)，其中，空气中真菌浓度为9.59×10²copy numbers/m³，只有依赖qLAMP才可以得到实验结果。对于其他洁净度在10⁴-10⁵copy numbers/m³样品，传统qPCR所得结果和qLAMP所得结果基本一致。

综上所述，本发明实验例1～4的结果表明，本发明中的LAMP、例如qLAMP检测方法和配套采样及样品处理方法可以有效的替代传统PCR，例如qPCR的方法，用于监测空间站组装超净环境空气中真菌的数量。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京理工大学

<120> 用于检测空间环境中的真菌的引物组合、试剂盒及方法

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