本发明属于细胞分离纯化技术领域，具体涉及一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法。
背景技术：
近年来，随着免疫活性细胞分离方法的进步，肠道黏膜免疫得到越来越多的免疫科学工作者的重视，肠道黏膜免疫的研究已成为免疫学研究热点之一。肠道黏膜免疫系统是潜在病原体、食品以及共生菌的共同入口。肠道黏膜免疫系统长期暴露于复杂的环境中，因此能够对食品和共生菌的刺激产生耐受，同时对病原体的刺激产生免疫反应。肠黏膜主要由上皮层、固有层及浆膜层构成，含有种类丰富、数目繁多的免疫细胞，是哺乳动物识别、捕获经消化道进入体内的外界病原微生物的重要场所，其功能与感染、肿瘤等多种疾病密切相关。固有淋巴细胞（ilc，innatelymphoidcell）是新近发现的一类新型非t非b淋巴细胞。ilc具备固有免疫细胞（又称先天性免疫细胞）的基本特征，却同时能够分泌细胞因子参与获得性免疫应答（又称后天性免疫应答）。近年针对ilc的研究逐渐兴起，有助于提升抗感染、抗肿瘤等临床诊疗水平。对肠黏膜中原代ilc进行分离纯化是开展此类研究的关键前提条件。
目前多从肺、脾等实质脏器或外周血中提取ilc，尚缺少自小肠、结肠等空腔脏器中提取ilc的方法。肠黏膜中存在种类繁多的细胞类型（如上皮细胞、t/b淋巴细胞、单核/树突状细胞、成纤维细胞、中性粒细胞等），分离提取过程中其他细胞导致的背景干扰较大；另外，ilc数目较少、比例较低（<1%），造成从肠黏膜中提取ilc比从实质脏器或血液中提取ilc更难，且当前从实质脏器或血液中提取ilc的方法无法用于肠。
因此，需要提供一种能简化、高效、稳定的肠道分离ilc的方法，为其相关研究奠定基础。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法，该方法简单、高效、稳定，分离的ilc的纯度高，适用于后续研究。
为解决上述问题，本发明提供一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法，具体过程如下：
1）获取动物小肠，经清洗、剪碎后置于离心管中，加入上皮剥离液搅拌剥离；
2）移除上清液，加入中和液1，搅拌；
3）移除上清液，加入中和液2，静置分离；
4）移除上清液，加入消化酶混合液，搅拌消化；
5）加入hbss离心，移除上清后，用hbss重悬后过滤；
6）步骤5）所得滤液离心后用第一percoll液重悬后移至底部铺有第二percoll液的离心管；
7）离心，取中间层细胞收集，再次离心，收集沉淀；
8）用稀释后抗体混悬步骤7）所得的细胞团，离心，收集沉淀；
9）用流式缓冲液重悬沉淀，上机流式细胞仪得到ilc。
进一步地，步骤1）获取动物小肠后放入hbss液中，移除肠系膜及其脂肪、peyer氏结；纵行剖开肠壁，用pbs液清洗，将肠管剪碎后置于4℃pbs液中暂存。
更进一步地，所述加入上皮剥离液搅拌剥离的具体过程如下：加入37℃的上皮剥离液、磁力搅拌珠，将离心管倒置于磁力搅拌仪表面，在37℃5%co2培养箱内，以400rpm磁力搅拌30分钟。
更进一步地，所述上皮剥离液为hbss+edta+dtt+hepes+fbs的混合溶液，其中edta终浓度5mm、dtt终浓度1mm、hepes终浓度25mm、fbs终浓度5%。
进一步地，所述中和液1为rpmi+edta+fbs的混合溶液，其中edta终浓度1mm、fbs终浓度10%。
更进一步地，所述步骤2）中搅拌的具体过程为：将步骤2）的离心管倒置放于磁力搅拌仪表面，于37℃5%co2培养箱内，以200rpm磁力搅拌15分钟。
进一步地，所述中和液2为rpmi+hepes+fbs的混合溶液，其中hepes终浓度25mm、fbs终浓度10%。
更进一步地，所述步骤3）中静置分离的时间为10分钟。
进一步地，所述消化酶混合液为：hbss+liberasetl+dnasei+胶原酶iv+fbs的混合溶液，其中liberasetl终浓度0.167mg/ml、dnasei终浓度200u/ml、胶原酶iv终浓度100u/ml、fbs终浓度5%。
更进一步地，所述步骤4）中搅拌消化的具体过程为：将步骤3）的离心管倒置放于磁力搅拌仪表面，置于37℃5%co2培养箱内，以200rpm磁力搅拌45分钟。
进一步地，所述步骤5）中过滤是指用100um滤网过滤。
进一步地，所述步骤5）中离心是指500g离心5分钟。
进一步地，所述步骤6）中第一percoll液为44%的percoll液，所述第二percoll液为67%的percoll液。
进一步地，所述步骤6）中离心是指500g离心5分钟。
进一步地，所述步骤7)中离心是指20℃600g离心20分钟；所述再次离心是指500g室温离心5分钟。
进一步地，所述稀释后抗体是指含990ul流式缓冲液与10ul抗体原液，二者稀释比为1:100。
进一步地，所述抗体为dapi、lin、cd3、cd45、cd90.2或其组合；所述lin为cd11c、cd19、cd45r/b220、ly6g/ly6c、cd11b、fcεriα、nk1.1或其组合。
进一步地，所述步骤8）中离心是指在室温下离心3000rpm、3分钟。
进一步地，所述流式缓冲液为pbs+fbs的混合溶液，其中fbs终浓度5%。
进一步地，所述流式细胞仪设置为dapi-lin-cd3-cd45+cd90.2+。
本发明构建了新型“上皮剥离液”：hbss+edta+dtt+hepes+fbs，其中dtt（二硫苏糖醇）通过还原反应解离肠黏液层中dna及蛋白质聚合；edta（乙二胺四乙酸）通过螯合原理解离肠上皮细胞；hepes能够增强edta的螯合效应；hbss与fbs（小牛血清）能够维持细胞活性。通过此“上皮剥离液”能够有效移除肠黏液层与上皮层，暴露固有层，有助于后续ilc的消化分离。
本发明采用了新型“消化酶混合液”：hbss+liberasetl+胶原酶iv+dnasei+fbs，其中liberasetl为高纯度胶原酶i/ii搭载低浓度中性蛋白酶的混合型消化酶，并剔除了对细胞活性有负面效应的内毒素以及梭菌蛋白酶与胰蛋白酶等杂酶，有助于提升细胞产率、活性及功能性；胶原酶iv包含至少7种蛋白酶成分，对哺乳动物组织具有广谱消化作用，在本发明中与富含胶原酶i/ii的liberasetl发挥协同作用，增强细胞消化效果；dnasei为一种能够消化单链或双链dna的核酸内切酶，在本发明中用于消化受损细胞释放出的染色质，抑制细胞间“胶冻结构”的形成，为进一步获取ilc提供有利条件。
本发明引入了“磁力搅拌法”，匀速、充分的解离肠黏膜细胞。传统上，多采用手摇或高速震荡方法解离肠黏膜细胞。但手摇法存在频率、力度不稳定等弊端，高速震荡法存在力度过大（过分消化）等弊端，本发明采用corning磁力搅拌仪，并通过前期实验探索出适用于肠黏膜细胞解离的搅拌速率，从而达到匀速、充分解离肠黏膜细胞的目的。
本发明的有益效果：
本发明提供一种从小鼠肠粘膜中分离纯化固有淋巴细胞的方法，运用上皮剥离液剥离后，经两次中和、消化、重悬过滤、离心、分选、多次抗体筛选、离心、重悬后上机流式细胞仪得到ilc。通过不同浓度的percoll液来分层分离细胞，通过新配的上皮剥离液能够有效移除肠黏液层与上皮层，暴露固有层，有助于后续ilc的消化分离；通过消化酶混合液用于消化受损细胞释放出的染色质，抑制细胞间“胶冻结构”的形成，为进一步获取ilc提供有利条件；本发明中采用磁力搅拌可实现匀速、充分的解离肠粘膜细胞。该方法经过实践证明能从小鼠肠粘膜中分离并纯化出高纯度、高活性的固有淋巴细胞；本发明的提取步骤简单、高效、稳定，获取ilc细胞数量多、活率高、纯度高，为肠道黏膜免疫的研究提供可靠的方法，奠定研究基础。
附图说明
图1~4本发明优选实施例ilc流式分选图。
具体实施方式
试剂来源：
·dtt：sigma#000000010197777001
·edta：bostonbioproducts,#bm-150
·liberasetl：sigma#000000005401020001
·dnasei：roche#104159
·胶原酶iv：sigma#c5138
·fbs：hyclone#sh30396
·hepes：gibco#15630-080
·hbss：gibco#14025-092
·rpmi：gibco#11875-093
·percoll原液：ge#17-0891-01
·hcl：sigma#h9892
·pbs：lonza#17-513f
主要试剂及器材：
1）上皮剥离液：hbss+edta+dtt+hepes+fbs
以hbss为母液，向hbss中分别加入的edta、dtt、hepes、fbs，分别达到相应的终浓度其中上皮剥离液中：edta终浓度5mm、dtt终浓度1mm、hepes终浓度25mm、fbs终浓度5%
2）消化酶混合液：hbss+liberasetl+dnasei+胶原酶iv+fbs
以hbss为母液，向hbss中分别加入相应剂量的liberasetl、dnasei、胶原酶iv、fbs，分别达到相应的终浓度，其中消化酶混合液中：liberasetl终浓度0.167mg/ml、dnasei终浓度200u/ml、胶原酶iv终浓度100u/ml、fbs终浓度5%
3）磁力搅拌珠：采用corning磁力搅拌仪（产品编号：cls440826）
4）中和液1：rpmi+edta+fbs
以rpmi为母液，向rpmi中分别加入相应剂量的edta、fbs，分别达到相应的终浓度。中和液1中：edta终浓度1mm、fbs终浓度10%
5）中和液2：rpmi+hepes+fbs
以rpmi为母液，向rpmi中分别加入相应剂量的hepes、fbs，分别达到相应的终浓度。中和液2中：hepes终浓度25mm、fbs终浓度10%
6）100%percoll混合液：percoll原液+hbss+hepes+hcl
以percoll原液为母液，向percoll原液中分别加入相应剂量的hbss、hepes、hcl，分别达到相应的终浓度。percoll原液占比90%、hbss占比9%、hepes终浓度10mm、hcl终浓度217.4mn
7）44%percoll液：将8.8ml100%percoll混合液与11.2mlhbss混合即可
8）67%percoll液：将6.6ml100%percoll混合液与3.4mlhbss混合即可
9）流式缓冲液：以pbs为母液，加入相应剂量的fbs，使fbs终浓度达到5%
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
1.将小鼠常规co2处死后，剪刀纵行剖开腹壁及腹膜，暴露腹腔脏器，剪刀截取自十二指肠至回盲部的全部小肠（或截取自回盲部至直肠上段的全部结肠），放入hbss液中，仔细移除肠系膜及其脂肪、peyer氏结（peyer’spatch）；
2.纵行剖开肠壁，与pbs液中摇晃移除粪渣等杂质，将肠管剪为1-2cm小段后，放入4℃pbs液中暂存；
3.将肠管移至50mlfalcon离心管中，加入预热为37℃的“上皮剥离液”（约15-20ml/小鼠），加入2枚corning磁力搅拌珠，倒置放于corning磁力搅拌仪表面，置于37℃5%co2培养箱内，以400rpm磁力搅拌30分钟；
4.移除上清液后，加入中和液1（约15-20ml/小鼠），倒置放于corning磁力搅拌仪表面，置于37℃5%co2培养箱内，以200rpm磁力搅拌15分钟；
5.移除上清液后，加入中和液2（约10ml/小鼠），室温静置10分钟；
6.移除上清液后，加入15ml消化酶混合液，倒置放于corning磁力搅拌仪表面，置于37℃5%co2培养箱内，以200rpm磁力搅拌45分钟；
7.加入30mlhbss，500g离心5分钟；移除上清液后，用25mlhbss重悬细胞团，经100um滤网过滤后收集至新50mlfalcon离心管中；
8.以500g离心5分钟后，用4.5ml44%percoll液重悬细胞团后移至15mlfalcon离心管中，将2.3ml67%percoll液铺于混有细胞团的44%percoll液下层；
9.以20℃600g离心20分钟后，将中间层细胞（介于44%与67%percoll液之间）小心收集至无菌eppendorf管中，500g室温离心5分钟后，弃上清、收集沉淀；
10.抗体筛选：用1ml稀释后抗体（含990ul流式缓冲液与10ul抗体原液（抗体原液中抗体可以是dapi、lin（包括cd11c、cd19、cd45r/b220、ly6g/ly6c、cd11b、fcεriα、nk1.1）、cd3、cd45、cd90.2；）稀释比1：100）混悬第9步所得细胞团，室温下离心3000rpm、3分钟，收集沉淀；
11.用300ul流式缓冲液重悬沉淀，上机流式细胞仪，设置dapi-lin-cd3-cd45+cd90.2+即可得到ilc（过程如附图1~4）。经多次抗体筛选后，最终所得ilc比例约为13.1%，绝对细胞数约为“100,000个ilc/只小鼠”。因在筛选过程中已限定为dapi-，（活细胞呈dapi-、死细胞呈dapi+），故最终分选所得ilc均为活细胞，无需进一步活性检测。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。