本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种河豚毒素提取纯化方法。
背景技术：
河豚毒素虽然是高毒性化学物质，但是在微克级别计量时，是具有良好的镇痛、镇静和戒毒效果。目前市场对河豚毒素的需求供不应求，要想满足河豚毒素药物研发的市场需求，必须研发更加高效的提取工艺。现在主要有三种方法获取河豚毒素。一个是化学合成法，然而文献中报道的最有效率的ttx的全合成路线为32步，直线合成，总收率为1.1％，路线多，收率低，成本大。二是微生物发酵法，由于菌株遗传特性不稳定，产生ttx的水平仍然很低，大多数从发酵产物中分离得到是ttx类似物，不是真正的河豚毒素。第三是从河豚鱼中提取出来，这是主要获取ttx的方法，大家做了各种尝试，20世纪主要研究都是日本人做的，平田-后藤法是最经典的方法，原液提取，树脂交换，活性炭吸附，结晶。后面的研究都是在此基础上做的创新。现在为止中国也做了很多这方面的探索。用普通浸提法，耗时长，得到浸提液腐败发臭。活性炭吸附会导致死吸附，造成得率低。也有用高效液相色谱法来纯化ttx的，这只适合后面极小量的精制，放大生产是不行的。另外单纯用多步的膜过滤法得到的产物是一类分子大小接近的物质，纯度不高，得率也低。
因此，现有技术还有待进一步发展。
技术实现要素：
针对上述技术问题，本发明实施例提供了一种河豚毒素提取纯化方法，以解决河豚毒素提取工艺复杂、成本高、得率低的问题。
一种河豚毒素提取纯化方法，其中，包括以下步骤：
取月腹刺豚的卵巢和肝脏，绞碎后加入适量溶液混匀，采用超声波提取得到提取液；
将提取液在50℃真空条件下浓缩得到浓缩液；
浓缩液中加入氨水混合后过固相萃取柱，经水淋洗后，利用2％乙酸-甲醇和水所配溶液分两次洗脱，收集一次洗脱液；
将一次洗脱液进行聚酰胺柱层析，利用水-乙醇洗脱剂进行洗脱，收集二次洗脱液；
将二次洗脱液干燥后重结晶。
所述的河豚毒素提取纯化方法，其中，固定超声波提取过程中液料体积质量比为3:1。
所述的河豚毒素提取纯化方法，其中，所述超声波提取工作参数为：超声温度40℃，超声功率60w，超声时间30min。
所述的河豚毒素提取纯化方法，其中，超声提取2次，分别以0.1％乙酸水溶液为提取溶剂。
所述的河豚毒素提取纯化方法，其中，超声提取液冷却后以4000r/min离心10min，上清液通过快速定性滤纸过滤，滤液以乙醚脱脂，4℃下保存备用。
所述的河豚毒素提取纯化方法，其中，所用固相萃取柱为pka为4.9的弱阳离子交换柱，固相萃取柱使用前使用10％氨甲醇溶液进行活化。
所述的河豚毒素提取纯化方法，其中，所述2％乙酸-甲醇和水按照体积比80:20配置溶液。
所述的河豚毒素提取纯化方法，其中，利用不同配比的水-乙醇作为洗脱剂洗脱聚酰胺柱，分别收集二次洗脱液，测试各二次洗脱液的毒性，将低于预定毒性标准的二次洗脱液合并再进行浓缩纯化。
所述的河豚毒素提取纯化方法，其中，将二次洗脱液先经过旋转蒸发仪蒸发掉部分液体，再放进冷冻干燥机进行冻干得到河豚毒素冻干粉末。
所述的河豚毒素提取纯化方法，其中，用适量1％乙酸水溶液溶解河豚毒素冻干粉末，于冰箱或通风橱中静置待重新结晶，分离固液，液体通过聚酰胺柱层析进行纯化，固体再冻干保存。
本发明实施例提供的河豚毒素提取纯化方法，其采用超声提取法，结合固相萃取初步纯化技术可提取高纯度河豚毒素，本发明提纯工艺简单，提取效率高，适合放大生产，同时其对河豚毒素活性造成的损失小，得率和纯度明显高于传统提纯方法。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
河豚毒素提取纯化工艺：
一、取月腹刺豚的卵巢和肝脏1kg，用匀浆器绞碎后，加入适量的溶液混匀，采用超声波提取，固定液料体积质量比(ml/g，下同，下称“液料比”)3∶1，超声温度40℃，超声功率60w，超声时间30min，提取2次，分别以0.1％乙酸水溶液为提取溶剂，冷却后以4000r/min离心10min，上清液通过快速定性滤纸过滤，滤液以乙醚脱脂，4℃下保存备用。
二、浓缩提取液：在旋转蒸发仪50℃抽真空条件下浓缩，浓缩到原体积快干了，约得100ml浓缩液，备用。
三、初步纯化：固相萃取柱选用弱阳离子柱wcx，其键和了中等极性的羧酸基团，pka为4.9，因此作为弱阳离子交换柱，无需碱性很强的条件来洗脱分析物。采用30ml10％氨甲醇溶液活化；10ml样品液加10ml0.5％氨水,混合后立即过柱；50ml水淋洗；50ml2％乙酸-甲醇:水(80︰20)溶液分两次洗脱。收集洗脱液，浓缩到50ml，备用。
四、精制：聚酰胺分子中含有丰富的酰胺基团,可与酚类、醌类、硝基化合物等形成氢键而被吸附,与不能形成氢键的化合物分离。利用聚酰胺作为层析柱填料,可使一定极性范围的某类物质得以分离精制。
层析柱的制备：100g聚酰胺粉加入到200ml水中，洗干净，再倒掉水；加150ml干净的水，混匀，加到直径3cm的玻璃层析柱中，用水洗，直到流出液澄清为止。静置备用。
上样：取浓缩得到河豚毒素提取液加进柱子里，直到看到液体留到柱子底部为止。
洗脱：聚酰胺层析的洗脱剂常采用水-乙醇(10％、30％、50％、70％、)，分别收集洗脱液。利用小鼠生物实验测试得到液体的毒性，把毒性高的合并浓缩，备用。毒性低的合并再进行浓缩纯化。
五、干燥：收集的大量洗脱液先经过旋转蒸发仪蒸掉部分液体，再放进冷冻干燥机进行冻干，避免高温有氧情况下造成河豚毒素变异。河豚毒素粉末收集密封冷藏。
六、重结晶：为了得到纯度更高的河豚毒素，用适量1％乙酸水溶液溶解河豚毒素粉末，放到冰箱里静置待重新结晶，如果没有结晶，可以放通风橱适当挥去部分液体直至结晶出来，小心分离固液，液体需要留着再回上一步进行纯化。固体再冻干保存，得20.1mg粉末。
得到河豚毒素取1mg逐步稀释到1l，经过河豚毒素酶联免疫试剂盒测定，稀释后的浓度为952ug/l(ppb)，算得固体粉末中河豚毒素纯度为95.2％。
实施例2
放大原料的量进行工艺验证
一、取月腹刺豚的卵巢和肝脏10kg，用匀浆器绞碎后，加入适量的溶液混匀，采用超声波提取，固定液料体积质量比(ml/g，下同，下称“液料比”)3∶1，超声温度40℃，超声功率60w，超声时间30min，提取2次，分别以0.1％乙酸水溶液为提取溶剂，冷却后以4000r/min离心10min，上清液通过快速定性滤纸过滤，滤液以乙醚脱脂，4℃下保存备用，。
二、浓缩提取液：在旋转蒸发仪50℃抽真空条件下浓缩，浓缩到原体积快干了，约得1l浓缩液，备用。
三、初步纯化：固相萃取柱选用弱阳离子柱wcx，人工装填更大的柱，200g填料装到直径5cm的玻璃层析柱中。360ml10％氨甲醇溶液活化；100ml样品液加100ml0.5％氨水,混合后立即过柱；400ml水淋洗；400ml2％乙酸-甲醇:水(80︰20)溶液分两次洗脱。收集洗脱液，浓缩到500ml，备用。
四、精制：聚酰胺分子中含有丰富的酰胺基团,可与酚类、醌类、硝基化合物等形成氢键而被吸附,与不能形成氢键的化合物分离。利用聚酰胺作为层析柱填料,可使一定极性范围的某类物质得以分离精制。
层析柱的制备：200g聚酰胺粉加入到400ml水中，洗干净，再倒掉水；加400ml干净的水，混匀，加到直径5cm的玻璃层析柱中，用水洗，直到流出液澄清为止。静置备用。
上样：取浓缩得到河豚毒素提取液加进柱子里，直到看到液体留到柱子底部为止。
洗脱：聚酰胺层析的洗脱剂常采用水－乙醇(10％、30％、50％、70％、)，分别收集洗脱液。利用小鼠生物实验测试得到液体的毒性，把毒性高的合并浓缩，备用。毒性低的合并再进行浓缩纯化。
干燥。收集的大量的洗脱液先经过旋转蒸发仪蒸掉部分液体，再放进冷冻干燥机进行冻干，避免高温有氧情况下造成河豚毒素变异。河豚毒素粉末收集密封冷藏。
重结晶。为了得到纯度更高的河豚毒素，用适量1％乙酸水溶液溶解河豚毒素粉末，放到冰箱里静置待重新结晶，如果没有结晶，可以放通风橱适当挥去部分液体直至结晶出来，小心分离固液，液体需要留着再回上一步进行纯化。固体再冻干保存，得185mg粉末。得到河豚毒素取1mg逐步稀释到1l，经过河豚毒素酶联免疫试剂盒测定，稀释后的浓度为947ug/l(ppb)，算得固体粉末94.7％。
河豚养殖规模越来越大的形势下，很多河豚鱼废料还没得到很好的处理，用来提取河豚毒素是很好利用资源的方式。本提取纯化河豚毒素的工艺，能从1kg河豚卵巢和肝脏中得到河豚毒素约20mg，纯度达到95％，得率和纯度都很高。此工艺操作简单，不需要用到精密仪器；也适合放大，可以利用多台超声仪同时操作，用大玻璃柱过滤能处理更多提取液。效率高，超声提取时间短，一周时间能处理一批原料，如果利用加压装置，可以提高过柱的速度，时间能更短。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。