本发明涉及一种纯化方法，具体涉及一种hpph的制备色谱纯化方法。
背景技术：
hpph，全称2-((1′-正己氧基)乙基)-2-二乙烯基-焦脱镁叶绿酸(a)，英文名为2-((1’-n-hexyloxy)ethyl)-2-divinyl-pyropheophorbide-a)，是一种新型肿瘤光动力治疗(pdt)药物—光敏剂，由美国roswellpark肿瘤研究所研发，目前已经完成ⅱ期临床试验。hpph在407nm和665nm有很强的吸收，并且具有高的单重态氧量子产率，被认为是最高效且最具发展前途的光敏剂，其结构式如下：
在临床研究中，hpph是通过静脉注射进入人体，经过血液循环，逐渐到达人体的各个组织、器官和肿瘤细胞中的。因此，原料药中杂质含量的高低直接关系到光敏剂hpph的毒副作用的大小和安全窗口的大小。杂质含量越低，副作用越小、安全性越高。对于半合成产品来说，反应复杂，生成的副产物多，纯化困难；特别是通过半合成方法制备的光敏剂，反应生成的副产物和光降解的杂质就更复杂，经过硅胶柱层析和重结晶后，纯度很难达到99.5％，最大单个杂质含量也远远大于0.10％，而最大单个杂质含量的高低直接影响产品的质量、销售价格和产品竞争力。
通过专利us5198460a或专利us20040044198a1工艺路线制备，经过硅胶柱层析和结晶得到的hpph样品，我们检测其hplc纯度(归一化法)在93％-99％之间。
专利cn104193753a报道了一种由红豆杉枝叶提取物制备光敏剂hpph的方法。在该专利中，半合成工艺路线与专利us20040044198a1的工艺路线一致；纯化方法是通过硅胶柱层析(二氯甲烷→二氯甲烷-1.5％甲醇梯度洗脱)，得到纯度为97％的样品，再以甲醇为溶剂进行重结晶，得到纯度99％左右的样品。该专利纯化方法中存在一个很大缺陷：在硅胶柱层析纯化和结晶时，都使用了甲醇。hpph本身是酸，在柱层析和结晶时，不可避免地会与甲醇反应，生成hpph-甲酯(成品中的杂质)。
我们按专利cn104193753a的纯化方法，硅胶柱层析时，以洗脱剂(二氯甲烷→二氯甲烷-1.5％甲醇)进行梯度洗脱，仅得到了纯度为91.64％的样品，hpph-甲酯的含量为1.57％；接着以甲醇为结晶溶剂进行结晶，最后得到的样品的纯度为94.27％，hpph-甲酯的含量为0.59％，最大单杂含量为2.52％。同时，我们还考察了其他的结晶体系，结晶后的纯度都小于99％。
技术实现要素：
为了解决现有技术存在的问题，获得高质量的hpph样品(纯度大于99.5％，杂质总含量小于0.50％，单个杂质含量小于0.10％)，本发明采用制备色谱技术，从上样量、洗脱剂体系、洗脱条件和收集洗脱液范围等方面对hpph粗品(在本专利中，hpph粗品是指纯度在93％～99％之间的hpph样品)进行了纯化研究，该纯化方法可以获得纯度高达99.92％，杂质总含量远远小于0.50％，单个杂质含量小于0.10％的样品。
一种hpph的纯化方法，包括以下步骤：采用制备色谱法对hpph粗品(在本专利中，hpph粗品是指纯度在93％～99％之间的hpph样品)进行分离纯化，当主成份出峰的上升电信号值(单位：mv或mau)达到开始收集洗脱液的电信号值时，开始收集洗脱液，当主成份出峰的下降电信号值达到停止收集洗脱液的电信号值时，停止收集洗脱液；将收集到的洗脱液浓缩，得到浓缩液；浓缩液用萃取溶剂进行萃取，得到萃取液；将萃取液进行干燥、抽滤、浓缩，得到hpph纯品(在本专利中，hpph纯品是指纯度大于99.5％的hpph样品)。
作为优选，所述制备色谱法的色谱柱的类型为c18或c8反相硅胶填料色谱柱，优选为c18反相硅胶填料色谱柱。
作为优选，所述制备色谱法的色谱柱的直径为20毫米-300毫米，优选100毫米。
作为优选，所述制备色谱法分离纯化采用的流动相为无机盐、极性有机溶剂与水组成的三元流动相，按体积比计算，所述极性有机溶剂:水＝40:60～99:1，优选60:40～95:5。
作为进一步优选技术方案，所述极性有机溶剂为丙酮、乙腈和四氢呋喃中的一种，优选为乙腈和丙酮中的一种。
作为进一步优选技术方案，所述无机盐是指磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、乙酸铵和甲酸铵中的一种，优选为磷酸氢二钾、甲酸铵和乙酸铵中的一种；所述无机盐在流动相中的浓度是1～50mmol/l，优选为5～20mmol/l。
作为优选，所述制备色谱法分离纯化采用的流动相为酸、极性有机溶剂与水组成的三元流动相，按体积比计算，极性有机溶剂:水＝40:60～99:1，优选60:40～95:5。
作为进一步优选技术方案，所述极性有机溶剂为丙酮、乙腈和四氢呋喃中的一种，优选为乙腈和丙酮中的一种。
作为进一步优选技术方案，所述酸是指磷酸、甲酸、三氟乙酸和乙酸中的一种，优选为磷酸、甲酸和三氟乙酸中的一种；所述酸在流动相中的体积百分比为0.01～1％，更优选为0.1％～0.5％。
作为优选，所述hpph粗品(在本专利中，hpph粗品是指纯度在93％～99％之间的hpph样品)，上样前，先加入极性有机溶剂溶解，然后再加入水，摇匀得到上柱液；所述hpph粗品与极性有机溶剂的重量体积比为0.0125g/ml～0.05g/ml；所述hpph粗品与水的重量体积比为0.1g/ml～1g/ml。
作为进一步优选技术方案，所述极性有机溶剂为丙酮、乙腈和四氢呋喃中的一种，优选为乙腈和丙酮中的一种。
作为优选，所述hpph粗品的纯度(归一化法)在93％～99％之间，用量为0.1～2.5克/次/100毫米柱子，优选为1.2～2.0克/次/100毫米柱子，这里的克/次/100毫米柱子是指一次色谱柱(直径为100毫米的柱子)分离的量；其它直径的柱子每次分离的量按此比例放大或缩小。
作为优选，所述制备色谱法分离纯化的检测波长为410nm，所述制备色谱法分离纯化的进样流速为20～200ml/min，优选为100～150ml/min；所述制备色谱法分离纯化的洗脱流速为200～350/min，优选为250～300/min。
作为优选，所述制备色谱法分离纯化的开始收集洗脱液的电信号值是指开始收集洗脱液时的主成份出峰的上升电信号值，为500mv～1600mv，优选上升电信号值为600mv～1500mv；所述停止收集洗脱液的电信号值是指停止收集洗脱液时的主成份出峰的下降电信号值，为1600mv～500mv，优选下降电信号值为1200mv～600mv。
作为优选，所述洗脱液的浓缩及萃取液的浓缩均为减压浓缩，所述减压浓缩的温度为0℃～40℃，优选10℃～30℃；所述减压浓缩的真空度为-0.095mpa～-0.06mpa，优选为-0.095mpa～-0.085mpa。
作为优选，所述的萃取溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿中的一种，优选为乙酸乙酯或二氯甲烷中的一种；所述萃取溶剂的体积用量是浓缩液的1～10倍，优选为2～5倍。
hpph是通过从植物(比如：红豆杉枝叶)或藻类(比如：蓝藻或螺旋藻)中提取，得到叶绿素(a)，然后经过半合成工艺路线制备得到的。这使得杂质结构与hpph的结构极其相似，导致它们在各种溶剂中的溶解度相近，很难通过硅胶柱层析和结晶方法来除掉杂质。比如，纯度为97.0％的hpph样品，通过结晶后，最高只能获得97.6％的纯度(表1所示)；按照专利cn104193753a的方法纯化，最后也只能得到纯度为94.28％的样品。本发明的制备色谱法纯化方法通过：1)制备色谱法分离纯化时，使用不含醇类试剂的洗脱剂(比如，丙酮-水-醋酸铵体系)；2)浓缩洗脱液和萃取液时，温度都低于50℃，很好地规避了hpph与醇类试剂反应生成酯的风险，减小了降解杂质产生的可能性。本发明通过制备色谱法纯化后，hpph样品纯度都可以提高到99.5％以上，最高可以达到99.92％，杂质总含量小于0.50％，所有单个杂质含量都小于0.10％。
附图说明
图1为对比例5中根据专利cn104193753a方法硅胶柱层析纯化后所得样品的hplc纯度检测图。
图2为对比例5中根据专利cn104193753a方法结晶后所得样品的hplc纯度检测图。
图3为实施例1中制备色谱法纯化后所得样品的hplc检测图(丙酮-水-乙酸铵体系)。
图4为实施例2中制备色谱法纯化后所得样品的hplc检测图(乙腈-水-磷酸体系)。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述制备方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
本发明实施例中的hpph粗品是指根据专利us5198460a中的合成工艺路线制备，纯度在93％～99％之间的hpph样品(不同批次，由于硅胶柱层析纯化的差异，导致hpph样品纯度稍有差异)；hpph纯品是指纯度在99.5％以上的hpph样品。
本发明实施例中的hpph样品纯度的检测方法如下：
色谱柱：kromasil100-5c18，250×4.6mm，e35202；
流动相：95％a+5％b+0.1％c；
溶液a：甲醇；b：去离子水；c：磷酸；
流速：1.5ml/min；
进样体积：10μl；
柱温：25℃；
检测波长：410nm；
运行时间：40分钟。
对比例1重结晶纯化(丙酮-正庚烷体系)
在一个250毫升圆底烧瓶中，加入2.45克hpph粗品(按照专利us5198460a中工艺路线制备，纯度96.1％)，加入15毫升丙酮，搅拌使其溶解，然后在5℃下，加入120毫升正庚烷，析出固体；继续搅拌30分钟，过滤，滤饼于50℃，-0.092mpa下，真空干燥2小时，得到2.1克样品(收率：89.2％；纯度：97.8％)。
对比例2重结晶纯化(乙酸乙酯-正己烷体系)
在一个250毫升圆底烧瓶中，加入0.5克hpph粗品(按照专利us5198460a中工艺路线制备，纯度97.0％)，加入2.5毫升乙酸乙酯，搅拌使其溶解，-10℃下，加入15毫升正庚烷，析出固体；继续搅拌30分钟，过滤，滤饼于50℃，-0.092mpa下，真空干燥2小时，得到0.4克样品(收率：82.5％；纯度：97.6％)。
对比例3重结晶纯化(乙醇-正己烷体系)
在一个250毫升圆底烧瓶中，加入1.15克hpph粗品(按照专利us5198460a中工艺路线制备，纯度93.5％)，加入2毫升乙醇，搅拌使其溶解，然后在5℃下，加入20毫升正庚烷，析出固体；继续搅拌30分钟，过滤，滤饼于50℃，-0.092mpa下，真空干燥2小时，得到0.85克样品(收率：79.1％；纯度：95.7％)。
对比例4采用不同溶剂体系对hpph样品进行重结晶纯化，hpph粗品(按照专利us5198460a中工艺路线制备，不同批次，稍有差异)，其结晶效果见表1。
表1不同溶剂体系对hpph结晶的影响
对比例5采用专利cn104193753a报道的纯化方法纯化
在氮气保护下，将3.8克hpph-甲酯(2-((1′-正己氧基)乙基)-2-二乙烯基-焦脱镁叶绿酸(a)-正己酯)加入200毫升thf中，搅拌溶解，加入事先配好的1.3％的氢氧化钠/甲醇/水(200ml)混合溶液，保持室温进行反应，tlc监控反应进程(展开剂为13:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂)，反应完毕后，加入200毫升的0-5℃的水，用2％的乙酸水溶液调节ph为6.0，然后加入100毫升thf，用二氯甲烷萃取反应液至水相无色。有机相加入无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干。将残物溶解于二氯甲烷中，硅胶柱层析，以二氯甲烷→1.5％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，得到纯度91.64％的产品，其hplc纯度检测图谱数据见表2；其hplc纯度检测图谱见图1；再以甲醇重结晶(其中，g/ml为1/25)，得到1.5克纯度为94.28％的产品，其hplc纯度检测图谱数据见表3；其hplc纯度检测图谱见图2。
表2专利cn104193753a方法硅胶柱层析纯化后所得样品的hplc纯度检测的谱图数据
表3专利cn104193753a方法结晶后所得样品的hplc纯度检测的谱图数据
从对比例5可以看出，我们按照该专利cn104193753a的纯化方法，硅胶柱层析时，以洗脱剂(二氯甲烷→二氯甲烷-1.5％甲醇)进行梯度洗脱，仅得到了纯度为91.64％的样品，hpph-甲酯的含量为1.57％；接着以甲醇为结晶溶剂进行结晶，最后得到的样品的纯度为94.27％，hpph-甲酯的含量为0.59％，单个杂质含量最高为2.52％。同时，我们还考察了其他的结晶体系(见对比例1-4)，结晶后的纯度都小于98％。
实施例1制备色谱法纯化hpph(丙酮-水-乙酸铵体系)
分离条件：
色谱工作站：cxth-3000
制备柱直径：100毫米
填料：c18反相硅胶
流速：280ml/min
检测波长：410nm
流动相：丙酮:水＝80:20(体积比)；乙酸铵浓度为5mmol/l；
1)上柱液的配制
在一个250毫升锥形瓶中，加入2.0ghpph粗品(纯度94.9％)，加入40ml丙酮，震荡使其溶解，最后再加入2ml去离子水，摇匀，得到上柱液。
2)流动相(丙酮:水＝80:20(体积比)；乙酸铵：5mmol/l)的配制
在50l的配制桶中，加入31.52kg丙酮(密度为0.788)和10.0kg去离子水，搅拌下，再加入19.27克乙酸铵，搅拌均匀，得到50l流动相。
3)上样、洗脱
打开色谱工作站，设定检测波长为410nm、进样流速为100ml/min及洗脱速度为280ml/min。手动上样后，再用50ml流动相洗涤。最后，点击数据采集，开始洗脱纯化程序。
4)收集
当主成份出峰的上升电信号值升至1500mv时，开始收集，当主成份出峰的下降电信号值下降到1200mv时，停止收集。收集得到约4升洗脱液。
5)洗脱液的浓缩、萃取、再浓缩
分次将收集得到的洗脱液(每次1升)抽入旋转蒸发仪(型号：büch200)中，控制温度30℃，真空度-0.085mpa下，减压浓缩至无液体蒸出，将浓缩液转入一个1升烧杯中，得到600毫升浓缩液。
在5升玻璃分液漏斗中，加入乙酸乙酯(3升)，再加入600毫升浓缩液，萃取；萃取液用去离子水洗涤3次(每次1l)后，合并有机相；有机相用无水硫酸钠(50克)干燥，抽滤，滤液在10℃，真空度-0.095mpa下，减压浓缩，得到1.63克hpph纯品(收率：85.8％；hplc归一化纯度：99.88％，单个杂质最高含量为0.067％)。
制备色谱法纯化后的所得样品的hplc纯度检测的谱图如图3所示；制备色谱法纯化后所得样品的hplc纯度检测的谱图数据见表4所示。
表4制备色谱法纯化后所得样品的hplc检测的谱图数据(丙酮-水-乙酸铵体系)
实施例2制备色谱法纯化hpph(乙腈-水-磷酸体系)
分离条件：
色谱工作站：cxth-3000
制备柱直径：100毫米
填料：c18反相硅胶
流速：250ml/min
检测波长：410nm
流动相：乙腈:水:磷酸＝95:5:0.1(体积比)；
1)上柱液的配制
在一个250毫升锥形瓶中，加入1.2ghpph粗品(纯度94.9％)，加入96ml乙腈，震荡使其溶解，再加入12ml去离子水，摇匀，得到上柱液。
2)流动相(乙腈:水:磷酸＝95:5:0.1(体积比))的配制
在50l的配制桶中，加入46.64kg乙腈(密度为0.982克/毫升)和2.5kg去离子水，搅拌下，加入50毫升磷酸，搅拌均匀，得到50l流动相。
3)上样、洗脱
打开色谱工作站，设定检测波长为410nm、进样流速为100ml/min及洗脱速度为250ml/min。手动上样后，再用100ml流动相洗涤。最后，点击数据采集，开始洗脱纯化程序。
4)收集
当主成份出峰的上升电信号值升至600mv时，开始收集；当主成份出峰的下降电信号值下降到600mv时，停止收集。收集得到约6升洗脱液。
5)洗脱液的浓缩、萃取、再浓缩
分次将收集液(每次1升)抽入旋转蒸发仪(型号：büch200)中，控制温度20℃，真空度-0.090mpa下，减压浓缩至无液体蒸出，将浓缩液转入一个1升烧杯中，得到400毫升浓缩液。
在5升玻璃分液漏斗中，加入二氯甲烷(2升)，再加入400毫升浓缩液，萃取；萃取液用去离子水洗涤3次(每次1l)后，合并有机相；有机相用无水硫酸钠(50克)干燥，抽滤，滤液在30℃，真空度-0.085mpa下，减压浓缩，得到0.95克hpph纯品(收率：83.4％；hplc归一化纯度：99.92％，单个杂质最高含量为0.034％)。
制备色谱法纯化后的样品的hplc纯度检测图谱如图4、hplc纯度检测的谱图数据见表5所示。
表5制备色谱法纯化后所得样品的hplc纯度检测的谱图数据(乙腈-水-磷酸体系)
实施例3制备色谱法纯化hpph(丙酮-水-磷酸氢二钾体系)
分离条件：
色谱工作站：cxth-3000
制备柱直径：100毫米
填料：c18反相硅胶
流速：300ml/min
检测波长：410nm
流动相：丙酮:水＝60:40(体积比)；磷酸氢二钾浓度为20mmol/l；
1)上柱液的配制
在一个250毫升锥形瓶中，加入1.5ghpph粗品(纯度94.9％)，加入60ml丙酮，震荡使其溶解，最后再加入15ml去离子水，摇匀，得到上柱液。
2)流动相(丙酮:水＝60:40(体积比)；磷酸氢二钾：20mmol/l)的配制
在50l的配制桶中，加入23.64kg丙酮(密度为0.788)和20.0kg去离子水，搅拌下，再加入174.18克磷酸氢二钾，搅拌均匀，得到50l流动相。
3)上样、洗脱
打开色谱工作站，设定检测波长为410nm、进样流速为150ml/min及洗脱速度为300ml/min。手动上样后，再用50ml流动相洗涤。最后，点击数据采集，开始洗脱纯化程序。
4)收集
当主成份出峰的上升电信号值升至600mv时，开始收集；当主成份出峰的下降电信号值下降到1000mv时，停止收集。收集得到约5升洗脱液。
5)洗脱液的浓缩、萃取、再浓缩
分次将收集得到的洗脱液(每次1升)抽入旋转蒸发仪(型号：büch200)中，控制温度10℃，真空度-0.090mpa下，减压浓缩至无液体蒸出，将浓缩液转入一个1升烧杯中，得到850毫升浓缩液。
在5升玻璃分液漏斗中，加入二氯甲烷(1.7升)，再加入850毫升浓缩液，萃取；萃取液用去离子水洗涤3次(每次0.8l)后，合并有机相；有机相用无水硫酸钠(50克)干燥，抽滤，滤液在40℃，真空度-0.095mpa下，减压浓缩，得到1.18克hpph纯品(收率：82.9％；hplc归一化纯度：99.76％，单个杂质最高含量为0.056％)。
实施例4制备色谱法纯化hpph(乙腈-水-甲酸体系)
分离条件：
色谱工作站：cxth-3000
制备柱直径：100毫米
填料：c18反相硅胶
流速：270ml/min
检测波长：410nm
流动相：乙腈:水:甲酸＝85:15:0.5(体积比)；
1)上柱液的配制
在一个250毫升锥形瓶中，加入1.4ghpph粗品(纯度94.9％)，加入112ml乙腈，震荡使其溶解，再加入10ml去离子水，摇匀，得到上柱液。
2)流动相(乙腈:水:甲酸＝85:15:0.5(体积比))的配制
在50l的配制桶中，加入41.73kg乙腈(密度为0.982克/毫升)和7.5kg去离子水，搅拌下，加入250毫升甲酸，搅拌均匀，得到50l流动相。
3)上样、洗脱
打开色谱工作站，设定检测波长为410nm、进样流速为100ml/min及洗脱速度为250ml/min。手动上样后，再用100ml流动相洗涤。最后，点击数据采集，开始洗脱纯化程序。
4)收集
当主成份出峰的上升电信号值升至900mv时，开始收集；当主成份出峰的下降电信号值下降到800mv时，停止收集。收集得到约6升洗脱液。
5)洗脱液的浓缩、萃取、再浓缩
分次将收集液(每次1升)抽入旋转蒸发仪(型号：büch200)中，控制温度20℃，真空度-0.085mpa下，减压浓缩至无液体蒸出，将浓缩液转入一个1升烧杯中，得到800毫升浓缩液。
在5升玻璃分液漏斗中，加入二氯甲烷(3升)，再加入800毫升浓缩液，萃取；萃取液用去离子水洗涤3次(每次1l)后，合并有机相；有机相用无水硫酸钠(50克)干燥，抽滤，滤液在25℃，真空度-0.090mpa下，减压浓缩，得到1.08克hpph纯品(收率：81.3％；hplc归一化纯度：99.82％，单个杂质最高含量为0.057％)。
从实施例1-4可以看出，经过本发明纯化后的样品，样品纯度都大于99.5％，单个杂质含量小于0.07％，总杂含量都小于0.20％，这样高质量的样品都是其他现有纯化方法(硅胶柱层析和重结晶)无法达到的。