本发明属于生物技术领域，具体的说是一种利用多种植物激素诱导三角褐指藻大量积累油脂的方法。
背景技术：
全球化经济的快速发展，使得各国的能源消耗量急剧攀升。然而，地球上的化石能源储存是有限的，按照目前的消耗速度终有一天会被消耗殆尽。届时，人类社会的发展会受到严重限制。解决这一问题的关键在于寻找到新型可再生的清洁能源，这一压力已经迫在眉睫。生物柴油作为绿色可持续发展的新能源，受到越来越多的关注。我国传统的工业化生物柴油目前主要还是大豆、棕掘油等植物脂肪和某些动物脂肪或者废食用油作为原材料。原料虽然多样，但来源是非常有限的，因此寻找新一代的生物柴油原料已经迫在眉睫。而微藻因易于培养、具有单位面积产量大等优点，被视为新一代的、甚至是唯一能实现完全替代石化柴油的生物柴油原料。
微藻生物柴油生产的一大难题是传统油脂积累诱导方法复杂、困难、成本高昂。在众多诱导方式中，利用添加植物生长调节剂的手段进行人工诱导积累，较传统诱导调控方式具有简单、高效、直接、可控性高等特点。
三角褐指藻(phaeodactylumtricornutum)是硅藻门、羽文藻纲、褐指藻属的一种单细胞浮游藻种，脂质含量达细胞干重的20-30％，是微藻生物柴油开发的优良藻种。但是其脂质含量距离生产工艺开发尚有距离，选择一种诱导效率稳定高效的植物生长调节剂是当前一项重要的内容。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种操作简单、速度快、成本低、稳定高效的一种利用多种植物激素诱导三角褐指藻大量积累油脂的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种利用多种植物激素诱导三角褐指藻大量积累油脂的方法，向培养至对数生长期接近稳定期的三角褐指藻液中加入添加剂进行激素诱导，而后在23-25℃、光强30-35μmol·m-2·s-1、光暗比12h/12h条件下培养6天，即实现油脂的积累；其中，添加剂为茉莉酸甲酯、脱落酸和水杨酸中的一种或几种的组合，添加剂的添加量为每升藻液中13-15mg茉莉酸甲酯、5-7mg脱落酸和1-3mg水杨酸。
所述添加剂为每升藻液中14mg茉莉酸甲酯、6mg脱落酸和2mg水杨酸；获得油脂量为0.403119mg/10l。
所述培养至对数生长期接近稳定期的三角褐指藻液为将三角褐指藻在温度23-25℃、光强30-35μmol·m-2·s-1、光暗比12h/12h的条件下，培养至对数生长期接近稳定期(od730为0.2-0.25)。
本发明与现有技术相比，其优点是：
1.本发明方法简单易行、成本低、无污染、稳定高效。
2.采用本发明方法调控后获得的藻体油脂含量高，增加迅速，可以作为工业化生物产油原料。
3.采用本发明方法，添加混合植物激素茉莉酸甲酯、脱落酸和水杨酸能够诱导三角褐指藻大量积累甘油三酯，是单独添加植物激素诱导三角褐指藻积累甘油三酯含量的2倍。
附图说明
图1为本发明实施例提供的三角褐指藻生长曲线图。
图2为本发明实施例提供的三角褐指藻甘油三酯含量图。
具体实施方式
实施例1：
步骤1、制备藻液：在温度23-25℃、光强30-35μmol·m-2·s-1、光暗比12h/12h条件下，培养三角褐指藻到对数生长期接近稳定期(od730为0.2-0.25)，获得将进行激素诱导的藻液；
步骤2、激素诱导：分别将不同浓度的茉莉酸甲酯、脱落酸或水杨酸添加到步骤1得到的300ml藻液中，其中，不同浓度为1mg/l-30mg/l；并且以未加植物激素的空白对照组。
步骤3、三角褐指藻生长曲线：将步骤2获得的不同激素诱导后的藻液在温度23-25℃、光强30-35μmol·m-2·s-1、光暗比12h/12h条件下培养6天，每天测量藻液吸光度值od730。
测试数据：本发明步骤3得到的藻液吸光度od730绘制诱导后三角褐指藻生长曲线(图1)。由图1可见在三种植物激素诱导过程中，茉莉酸甲酯未对三角褐指藻生长产生明显的促进或抑制作用，高浓度的水杨酸对三角褐指藻生长有一定的抑制作用，低浓度的脱落酸则明显促进三角褐指藻生长。
实施例2：
步骤1、制备藻液：在温度23-25℃、光强30-35μmol·m-2·s-1、光暗比12h/12h条件下，培养三角褐指藻到对数生长期接近稳定期(od730为0.2-0.25)，获得将进行激素诱导的藻液；
步骤2、激素诱导：分别将不同浓度的茉莉酸甲酯、脱落酸或水杨酸添加到步骤1得到的1l藻液中，其中，不同浓度为1mg/l-30mg/l；并且以未加植物激素的空白对照组。
步骤3、获取高油脂含量藻体：将步骤2获得的不同激素诱导后的藻液在温度23-25℃、光强30-35μmol·m-2·s-1、光暗比12h/12h条件下培养6天后，离心收集即得油脂含量高的藻体。
步骤4、甘油三酯含量：将步骤3获得的藻体冻干，称取0.2g，加入1ml4mol/l盐酸振荡混匀，静置1小时，然后100℃恒温水浴10min。将水浴后的样品置于-20℃冰箱冷却30min。处理后的样品加入7ml氯仿：甲醇(v/v＝1：2)，振荡混匀，6000rpm离心15min，分离上清液。沉淀重复上述操作3次，收集上清液。将溶液转移至分液漏斗中，加入2.5ml氯仿，3ml1％nacl溶液，混匀静置5min，收集下相。将上相重复萃取4次。合并下相，于45℃减压真空干燥，即得诱导三角褐指藻总脂。将总脂溶于正己烷中，使用薄层层析分离甘油三酯，展开剂为正己烷：乙醚：乙酸(70：30：1，v/v/v)。分离的甘油三酯加入正己烷，离心收集上清，重复3次。将上清于45℃减压真空干燥，称量即得诱导三角褐指藻甘油三酯含量。
测试数据：将上述获得的甘油三酯含量绘图(图2)，与对照组相比，14mg/l茉莉酸甲酯能明显提高三角褐指藻甘油三酯含量，低浓度的脱落酸和水杨酸也能够明显高三角褐指藻甘油三酯含量。
实施例3
步骤1、制备藻液：在温度23-25℃、光强30-35μmol·m-2·s-1、光暗比12h/12h条件下，培养三角褐指藻到对数生长期接近稳定期(od730为0.2-0.25)，获得将进行激素诱导的藻液；
步骤2、激素诱导：分别将不同浓度的茉莉酸甲酯、脱落酸或水杨酸添加到步骤1得到的1l藻液中，其中，不同浓度为1mg/l-30mg/l；并且以未加植物激素的空白对照组。
步骤3、获取藻体：将步骤2获得的不同激素诱导后的藻液在温度23-25℃、光强30-35μmol·m-2·s-1、光暗比12h/12h条件下培养14天，每天离心收集藻体，测定油脂含量(参见图1)。
测试数据：用过上述实验，所有实验组和对照组油脂含量均在第6天左右不再明显增加，因此植物激素诱导时间为6天。
实施例4
步骤1、制备藻液：在温度23-25℃、光强30-35μmol·m-2·s-1、光暗比12h/12h条件下，培养三角褐指藻到对数生长期接近稳定期(od730为0.2-0.25)，获得将进行激素诱导的藻液；
步骤2、激素诱导：将不同浓度的茉莉甲酯、脱落酸、水杨酸混合植物激素添加到步骤1得到的1l藻液中；
步骤3、获取高油脂含量藻体：将步骤2获得的不同激素诱导后的藻液在温度23-25℃、光强30-35μmol·m-2·s-1、光暗比12h/12h条件下培养6天后，离心收集即得油脂含量高的藻体。
步骤4、甘油三酯含量：将步骤3获得的藻体冻干，称取0.2g，加入1ml4mol/l盐酸振荡混匀，静置1小时，然后100℃恒温水浴10min。将水浴后的样品置于-20℃冰箱冷却30min。处理后的样品加入7ml氯仿：甲醇(v/v＝1：2)，振荡混匀，6000rpm离心15min，分离上清液。沉淀重复上述操作3次，收集上清液。将溶液转移至分液漏斗中，加入2.5ml氯仿，3ml1％nacl溶液，混匀静置5min，收集下相。将上相重复萃取4次。合并下相，于45℃减压真空干燥，即得诱导三角褐指藻总脂。将总脂溶于正己烷中，使用薄层层析分离甘油三酯，展开剂为正己烷：乙醚：乙酸(70：30：1，v/v/v)。分离的甘油三酯加入正己烷，离心收集上清，重复3次。将上清于45℃减压真空干燥，称量即得诱导三角褐指藻甘油三酯含量。
步骤5、最佳反应条件、实验设计和结果：结合单因素试验结果，选取脱落酸和水杨酸浓度分别为2-6mg/l，茉莉酸甲酯浓度为10-14mg/l，boc-behnken实验设计，甘油三酯含量为响应值，找出最佳反应条件、实验设计和结果。
测试数据：本发明步骤4获得的甘油三酯含量表(表1)。通过boc-behnken实验设计，获得公式：
表1
由上述数据模型分析可见，添加激素的最佳条件为茉莉酸甲酯(14mg/l)、脱落酸6(mg/l)、水杨酸2(mg/l),甘油三酯含量0.403119g/10l。