本发明涉及一种虾青素的分离鉴定方法。
背景技术
虾青素（3,3'-二羟基-β,β'-胡萝卜素-4,4'-二酮）是一种含氧类胡萝卜素，主要存在于海洋生物中。由于其优越的抗氧化功能，除被用于食品着色外，虾青素还具有多种生理功效，如在抗氧化性、抗肿瘤、预防癌症、增强免疫力、改善视力等方面都有一定的效果，同时还被证明对癌症等疾病具有有效的防治作用。虾青素的生产具有人工合成和生物获取两种方式。人工合成虾青素不仅价格昂贵，而且同天然虾青素在结构、功能、应用及安全性等方面差别显著。因此，大多数研究依然倾向于从天然产物中提取。田螺泛指田螺科的软体动物，属于软体动物门腹足纲前鳃亚纲田螺科，产量巨大，价格便宜，是提取虾青素的绝佳选择。
技术实现要素：
要解决的技术问题：本发明的目的是提供一种虾青素的分离鉴定方法，分离效率高，萃取率高，鉴定方法简单快捷准确。
技术方案：一种虾青素的分离鉴定方法，成分按重量份计，包括以下步骤：
（1）将80-100份田螺，粉碎后进行冷冻干燥；
（2）取出后研磨粉碎至颗粒大小为0.15-0.3mm；
（3）采用超临界co2方法进行萃取，取10份粉末均匀填置于50ml萃取釜内，以无水乙醇为夹带剂，萃取温度为50-65℃、萃取压力位20-40mpa、萃取时间为3-4h；
（4）将萃取到的物质进行薄层层析，以虾青素标样为基准，刮下硅胶板上与虾青素标样平行的点，重复10-15次；
（5）将刮取物溶于20ml甲醇中，取5ml甲醇活化固相萃取柱，取2ml甲醇刮取物溶液至c18柱中，用10ml甲醇洗脱，分4次添加到柱中，调节流速，使其以3ml/min的流速流出，收集全部洗脱液，60℃减压蒸干，加5ml甲醇复溶，过0.22μm有机滤膜得处理后的样品；
（6）采用高效液相色谱法对样品进行鉴定：色谱条件：色谱柱采用gracesmartrp-185u；柱温：30℃；流动相：甲醇:乙腈体积比为3:1，流速：1ml/min；检测波长：476nm；进样量：20μl。
进一步优选的，所述步骤（1）中冷冻干燥至水分为2-3.5g/100g。
进一步优选的，所述步骤（2）中夹带剂用量为0.3-1ml/g样品。
进一步优选的，所述步骤（4）中薄层色谱展开剂：二硫化碳与乙酸乙酯体积比为9:1。
进一步优选的，所述步骤（5）中固相萃取柱为cnwc18固相萃取柱。
进一步优选的，所述步骤（6）中色谱柱为250mm×4.6mm，5μm。
有益效果：
1.田螺数量大，成本低，从中提取虾青素能够大大增加其价值。
2.本发明方法采用超临界co2法，分离效率高，萃取率高达87.4%，获得最佳的萃取条件。
3.建立了从田螺中提取的虾青素的简单快捷准确的鉴定方法。
附图说明：
图1为实施例4薄层层析色谱图。
图2为标准品虾青素色谱峰。
图3为实施例4样品色谱峰。
具体实施方式
实施例1
一种虾青素的分离鉴定方法，成分按重量份计，包括以下步骤：
（1）将80份田螺，粉碎后进行冷冻干燥；
（2）取出后研磨粉碎至颗粒大小为0.15-0.3mm；
（3）采用超临界co2方法进行萃取，取10份粉末均匀填置于50ml萃取釜内，以无水乙醇为夹带剂，夹带剂用量为0.3ml/g样品、萃取温度为50℃、萃取压力位20mpa、萃取时间为3h；
（4）将萃取到的物质进行薄层层析，以虾青素标样为基准，刮下硅胶板上与虾青素标样平行的点，重复10次；
（5）将刮取物溶于20ml甲醇中，取5ml甲醇活化固相萃取柱，取2ml甲醇刮取物溶液至c18柱中，用10ml甲醇洗脱，分4次添加到柱中，调节流速，使其以3ml/min的流速流出，收集全部洗脱液，60℃减压蒸干，加5ml甲醇复溶，过0.22μm有机滤膜得处理后的样品；
（6）采用高效液相色谱法对样品进行鉴定：色谱条件：色谱柱采用gracesmartrp-185u；柱温：30℃；流动相：甲醇:乙腈体积比为3:1，流速：1ml/min；检测波长：476nm；进样量：20μl。
本实施例虾青素的萃取率为56.3%。
实施例2
一种虾青素的分离鉴定方法，成分按重量份计，包括以下步骤：
（1）将85份田螺，粉碎后进行冷冻干燥；
（2）取出后研磨粉碎至颗粒大小为0.15-0.3mm；
（3）采用超临界co2方法进行萃取，取10份粉末均匀填置于50ml萃取釜内，以无水乙醇为夹带剂，夹带剂用量为0.5ml/g样品、萃取温度为55℃、萃取压力位30mpa、萃取时间为3.5h；
（4）将萃取到的物质进行薄层层析，以虾青素标样为基准，刮下硅胶板上与虾青素标样平行的点，重复13次；
（5）将刮取物溶于20ml甲醇中，取5ml甲醇活化固相萃取柱，取2ml甲醇刮取物溶液至c18柱中，用10ml甲醇洗脱，分4次添加到柱中，调节流速，使其以3ml/min的流速流出，收集全部洗脱液，60℃减压蒸干，加5ml甲醇复溶，过0.22μm有机滤膜得处理后的样品；
（6）采用高效液相色谱法对样品进行鉴定：色谱条件：色谱柱采用gracesmartrp-185u；柱温：30℃；流动相：甲醇:乙腈体积比为3:1，流速：1ml/min；检测波长：476nm；进样量：20μl。
本实施例虾青素的萃取率为64.6%。
实施例3
一种虾青素的分离鉴定方法，成分按重量份计，包括以下步骤：
（1）将90份田螺，粉碎后进行冷冻干燥；
（2）取出后研磨粉碎至颗粒大小为0.15-0.3mm；
（3）采用超临界co2方法进行萃取，取10份粉末均匀填置于50ml萃取釜内，以无水乙醇为夹带剂，夹带剂用量为0.8ml/g样品、萃取温度为60℃、萃取压力位30mpa、萃取时间为3.5h；
（4）将萃取到的物质进行薄层层析，以虾青素标样为基准，刮下硅胶板上与虾青素标样平行的点，重复15次；
（5）将刮取物溶于20ml甲醇中，取5ml甲醇活化固相萃取柱，取2ml甲醇刮取物溶液至c18柱中，用10ml甲醇洗脱，分4次添加到柱中，调节流速，使其以3ml/min的流速流出，收集全部洗脱液，60℃减压蒸干，加5ml甲醇复溶，过0.22μm有机滤膜得处理后的样品；
（6）采用高效液相色谱法对样品进行鉴定：色谱条件：色谱柱采用gracesmartrp-185u；柱温：30℃；流动相：甲醇:乙腈体积比为3:1，流速：1ml/min；检测波长：476nm；进样量：20μl。
本实施例虾青素的萃取率为78.3%。
实施例4
一种虾青素的分离鉴定方法，成分按重量份计，包括以下步骤：
（1）将100份田螺，粉碎后进行冷冻干燥；
（2）取出后研磨粉碎至颗粒大小为0.15-0.3mm；
（3）采用超临界co2方法进行萃取，取10份粉末均匀填置于50ml萃取釜内，以无水乙醇为夹带剂，夹带剂用量为1ml/g样品、萃取温度为65℃、萃取压力位40mpa、萃取时间为4h；
（4）将萃取到的物质进行薄层层析，以虾青素标样为基准，刮下硅胶板上与虾青素标样平行的点，重复15次；
（5）将刮取物溶于20ml甲醇中，取5ml甲醇活化固相萃取柱，取2ml甲醇刮取物溶液至c18柱中，用10ml甲醇洗脱，分4次添加到柱中，调节流速，使其以3ml/min的流速流出，收集全部洗脱液，60℃减压蒸干，加5ml甲醇复溶，过0.22μm有机滤膜得处理后的样品；
（6）采用高效液相色谱法对样品进行鉴定：色谱条件：色谱柱采用gracesmartrp-185u；柱温：30℃；流动相：甲醇:乙腈体积比为3:1，流速：1ml/min；检测波长：476nm；进样量：20μl。
本实施例虾青素的萃取率为87.4%。图2中虾青素标准品保留时间t=3.781，而样品中相应峰（t=3.773）与虾青素标准品保留时间极为接近，并通过二极管阵列检测器在210-800nm紫外扫描表明，二者紫外吸收图谱极为相似，均在480nm处有最大吸收，同时结合图1，判断样品在保留时间为3.773min峰为虾青素。