一种胞外AA9家族多糖单加氧酶AnLPMO15g及其应用的制作方法

本发明属于生物工程领域，尤其是涉及一种胞外aa9家族多糖单加氧酶anlpmo15g及其应用。

背景技术

木质纤维素是地球上含量最丰富的可再生生物质资源，是生物质能源研究的热点领域。木质纤维素生物质可以通过水解和发酵转化为生物乙醇等生物燃料以及其他生物基产品。木质纤维素生物质的微生物转化主要包括3个过程：预处理、酶解和发酵，其中酶解过程是决定木质纤维素生物质微生物转化成本的关键步骤。木质纤维素的酶解需要多种酶的共同作用，主要包括纤维素酶，半纤维素酶、木质素酶等。但是，木质纤维素复杂的网状结构构成了阻碍其被高效酶解的天然屏障，降低了纤维素酶和半纤维素酶的作用效率。

为了提高酶解效率，近年来，膨胀素、cbm模块、aa9家族裂解性多糖单加氧酶(lpmo)等辅助蛋白进入了人们的视野。其中，aa9家族lpmo是最具有应用潜力的一种辅助蛋白。aa9家族多糖单加氧酶主要来源于真菌，尤其是丝状真菌，可以借助金属离子和还原型电子供体氧化断裂纤维素底物的多糖链，为纤维素酶提供更多的结合位点，从而提高木质纤维素的降解效率。目前，已报道的aa9的来源仍然有限，开发新的来源的aa9家族多糖单加氧酶对aa9的研究以及提高木质纤维素的酶解效率有很重要的意义。黑曲霉作为一种应用广泛的糖苷水解酶分泌型真菌，含有多个编码aa9家族多糖单加氧酶的基因，但是目前尚未有相关研究报告，因此，黑曲霉aa9家族多糖单加氧酶具有重要研究价值。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明旨在提出一种胞外aa9家族多糖单加氧酶anlpmo15g及其应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种胞外aa9家族多糖单加氧酶anlpmo15g，所述胞外aa9家族多糖单加氧酶anlpmo15g的核苷酸序列如seqidno.1所示。

进一步的，所述胞外aa9家族多糖单加氧酶anlpmo15g来自于黑曲霉cbs513.88。

本发明还提供一种重组载体ppic9k-an15g04900，所述重组载体为表达上述胞外aa9家族多糖单加氧酶anlpmo15g所需的重组载体。

本发明还提供一种重组载体ppic9k-an15g04900的制备方法，包括如下步骤：

s1：以黑曲霉cbs513.88的基因组dna为模板，以上游引物和下游引物作为扩增引物，进行pcr扩增，得到胞外aa9家族多糖单加氧酶anlpmo15g基因片段；

s2：用ecorⅰ和notⅰ分别对ppic9k载体和胞外aa9家族多糖单加氧酶anlpmo15g基因片段进行双酶切，用t4dna连接酶将酶切后的ppic9k载体和胞外aa9家族多糖单加氧酶anlpmo15g基因片段连接，转化，提取质粒，得到重组载体。

步骤1中的上游引物和下游引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物：5’-gcgccgaattccacaccaccgtccaggccgtctggat-3’；下游引物：

5’-atatagcggccgcttagtgatggtgatggtgatgctgagacgcaacgcactggtagta-3’。

本发明还提供一种包含上述重组载体的重组毕赤酵母工程菌株gs115-anlpmo15g。

上述重组毕赤酵母工程菌株gs115-anlpmo15g的构建方法，包括如下步骤：

s1：用bglⅱ酶对重组载体ppic9k-an15g04900进行线性化得到线性酶切产物；

s2：以毕赤酵母为宿主菌，将步骤s1得到的线性酶切产物转入，经过抗性筛选阳性克隆子，获得重组毕赤酵母工程菌株gs115-anlpmo15g。

本发明还提供一种胞外aa9家族多糖单加氧酶anlpmo15g在与纤维素酶系协同降解微晶纤维素和/或木质纤维素中的应用。

相对于现有技术，本发明所述的一种胞外aa9家族多糖单加氧酶anlpmo15g及其应用具有以下优势：

anlpmo15g可与传统纤维素酶协同作用，提高微晶纤维素和木质纤维素底物的降解效果，分别可以将商品纤维素酶诺维信ctec2降解微晶纤维素和草粉的还原糖产量提高96.75％和131.55％，表明该酶在生物能源和生物基化学品工业中具有很大的应用潜力和经济效益。

附图说明

图1纯化后anlpmo15g蛋白的sds-page分析；

图2酶解产物的maldi-tof/tof分析；

图3本发明所述的多糖单加氧酶anlpmo15g水解微晶纤维素得到的还原糖产量分析；

图4本发明所述的多糖单加氧酶anlpmo15g水解草粉得到的还原糖产量分析。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例及附图来详细说明本发明。

实施例1：多糖单加氧酶anlpmo15g目的基因的克隆

(1)采用平板划线法将甘油管保存的黑曲霉cbs513.88孢子接种到pda平板上进行活化，封口，在28℃培养箱里倒置培养4-5天至平板上生长的菌体变为褐色，用灭菌的去离子水冲洗表面的孢子，吸取孢子悬液加入装有50ml麦芽汁培养基的摇瓶中，28℃，200rpm培养2-3天。

(2)将培养后的培养基过滤获得菌丝体，用滤纸尽量吸干菌丝上的残留液体并放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨菌丝体至粉状。将研磨好的菌丝粉保存于-80℃备用。用天根公司的植物总rna提取试剂盒提取黑曲霉的总rna，并用索莱宝的反转录试剂盒将总rna反转录成cdna。

(3)通过pcr方法扩增出去除信号肽的目的基因。所用到的引物如下：上游引物5’-gcgccgaattccacaccaccgtccaggccgtctggat-3’；下游引物5’

-atatagcggccgcttagtgatggtgatggtgatgctgagacgcaacgcactggtagta-3’。

pcr的体系为1μlcdna，上游引物和下游引物各0.5μl，2×pyrobestmix10μl，补加去离子水至20μl。程序为94℃，10min；94℃，5min，55℃，30秒，72℃，1分10秒，30个循环；72℃，7min，4℃保存，琼脂糖电泳验证条带正确，用索莱宝的胶回收试剂盒对正确条带进行回收。

实施例2：包含an15g04900基因的重组ppic9k载体ppic9k-an15g04900的构建

(1)用ecorⅰ和notⅰ分别对ppic9k载体和扩增得到的目的基因进行双酶切，酶切体系为20μl基因/质粒，ecorⅰ和notⅰ各2.5μl，5μlbuffer，补加去离子水至总体积为50μl。37℃孵育2.5h，用索莱宝纯化试剂盒对酶切产物进行回收。

(2)用t4dna连接酶将酶切后的载体和基因片段连接在一起，连接体系如下：5.5μl基因，2.5μl载体，1μlbuffer，1μlt4dna连接酶。在4℃过夜连接。

(3)用连接后的质粒转化大肠杆菌感受态。取10μl上一步的连接产物加入到100μl的大肠杆菌dh5α感受态中，轻柔混匀后置于冰上静置30min。将上一步的混合物在42℃水浴锅中热击90秒，立即置于冰上放置3-5min。向离心管中加入1ml不含氨苄的lb培养基。在37℃恒温摇床中120rpm震荡培养1h，取100μl涂布到含有氨苄(1％)的lb平板上，在37℃培养箱中倒置培养过夜，挑取阳性克隆用通用引物aox1进行pcr验证，将验证正确的新鲜菌液送去金唯智公司进行测序，测序结果正确，即成功构建了质粒。用索莱宝质粒小提试剂盒提取质粒。

实施例3：包含重组质粒的ppic9k-an15g04900的重组毕赤酵母gs115-anlpmo15g的构建及诱导表达。

(1)用bglⅱ酶对重组质粒ppic9k-an15g04900进行线性化，线性化酶切体系为20μl基因，4μlbufferl，2μlt4bglⅱ酶，补加去离子水至终体积为40μl。37℃反应3h，用索莱宝纯化试剂盒回收酶切产物。

(2)转化毕赤酵母感受态。取10μl上一步获得的线性质粒加入80μl感受态，混匀后转入提前预冷的0.2cm的电转杯中，将电转杯置于冰上静置5min。将电转仪设置为电压1500v，电阻200ω，电容20μf，电击时间4.8-5.5毫秒。电击后立即向杯中加入1ml预冷的山梨醇，混匀后将菌液转移至灭菌的1.5ml离心管中，封口后于30℃培养箱中静置培养1-2h。将沉淀的菌体重悬后取200μl涂布在md平板上，30℃恒温培养箱中倒置2-3天至克隆产生。挑取阳性克隆至加入不同浓度g418的ypd平板上，培养2-3天，挑取生长较大的菌落进行菌落pcr验证，保存验证正确的菌株。

(3)挑取菌落验证正确的阳性克隆接种至5ml的bmgy液体培养基中，30℃，200rpm，震荡培养过夜。取过夜培养物以1％的接种量接种至25mlbmgy培养基中，30℃，200rpm震荡培养至od600为2-6(对数期，大约12-16h)。将培养物转移至50ml离心管中，5000rpm离心5min，弃上清，用50mlbmmy液体培养基重悬细胞至od600为1.0，加入甲醇至浓度为0.5％。将菌液转移到250ml摇瓶中，30℃，250rpm震荡培养。每24h取样，测od600，12000rpm离心1min收集上清。每24h补加甲醇至终浓度为0.5％，达到最佳诱导时间后，将培养物7500rpm离心10min，收集上清。对上清液进行ni柱纯化并用ph5.0，50mm的醋酸钠做透析液透析并回收蛋白，对回收的蛋白进行sds-page分析，验证结果正确，如图1所示。

实施例4：anlpmo15g水解微晶纤维素产物的maldi-tof/tof分析。

(1)酶反应：1％的微晶纤维素底物，加入适量的纯化后蛋白，加入抗坏血酸使其终浓度达到10mm，用50mm，ph5.0做醋酸钠缓冲溶液，用封口膜封口，50℃，200rpm反应48h后，沸水浴加热5min终止反应，12000rpm离心1min收集上清液。

(2)maldi-tof/tof分析：样品先用酚氯仿沉淀去除蛋白，再用amberliteir-120强酸型阳离子交换树脂进行脱盐处理。用2,5-二羟基苯甲酸(dhb)做基质，本实验中用到的dhb基质溶液是将20mg/ml的dhb溶于ta30(0.1％的三氟醋酸(tfa)乙腈溶液与水以3:7的体积比混合配制而成)配制而成，靶板使用mtp384剖光精钢靶板，ultraflextrememaldi-tof/tof(基体辅助激光解吸电离飞行时间)光谱仪上进行检测，这个系统通过(brukerdaltonics,germany)flexcontrol3.0软件进行控制。对于maldi-tof/tof分析，仪器在正反射模式下进行并且收集500-2600m/z范围内的波谱。每个样品收集多个平行波谱，数据用flexanalysis3.0软件进行分析。分析结果如图2所示。分析结果显示，anlpmo15g水解微晶纤维素底物产生纤维寡糖，对应的1,5-δ-内酯以及醛糖酸，该酶可以作用于纤维素糖苷链的c1位。

实施例5：anlpmo15g与纤维素酶协同水解微晶纤维素和草粉。

酶解混合液含有1％的底物，0.9fpu/ml商品纤维素酶(诺维信，ctec2)，加/不加0.9mg/ganlpmo15g蛋白,10mm的抗坏血酸，并用50mm，ph5.0的醋酸钠缓冲溶液做缓冲溶液，50℃，200rpm条件下反应48h，沸水浴加热5min终止反应，12000rpm离心1min，取上清，用dns法测定还原糖产量。结果如图3和图4所示，可见，anlpmo15g的加入，可以将商品纤维素酶水解微晶纤维素和稻草粉的还原糖产量分别提高96.75％和131.55％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>天津科技大学

<120>一种胞外aa9家族多糖单加氧酶anlpmo15g及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1098

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgaagactaccacctacagtttgctcgctctggcagcggcttccaagctggcttccgcc60

cacaccaccgtccaggccgtctggatcaacggcgaggaccagggtctcggtaactccgcc120

gatggctacatccgcagtccccccagcaacagccccgtcaccgacgtcacgtccaccgac180

atgacctgcaacgtcaacggtgaccaggccgcctctaagaccctctccgtcaaagccggt240

gacgttgtcaccttcgagtggcaccacagcgaccgctccgactccgacgacatcatcgcc300

tcctcccacaagggtcccgtccaggtctacatggccccgacggccaagggctccaacggc360

aacaactgggtcaagatcgccgaggacggataccacaagagctccgacgagtgggccacc420

gacatcctgatcgccaacaagggcaagcacaacatcactgttcccgacgttcccgccggt480

aactacctcttccgccctgagatcattgccctccacgagggtaaccgcgagggtggtgcc540

cagttctacatggagtgtgtccagttcaaggtcacctccgacggctccagcgagcttccc600

tccggtgtctccatccccggcgtctacaccgccactgaccccggtatcctcttcgatatc660

tacaactccttcgacagctaccccatccccggcccggatgtctgggatggctccagctcc720

ggctccagctccggatcttcctccgctgctgctgctgctaccacctccgctgctcaggcc780

acctccgctgtcaccagccaggcccaggcccccaccaccttcgccacctcttctaagtcc840

tccaagactgcctgcaagaacaagaccaagtccaagtccaaggttgctgcttccagcact900

gaggccgtcgttgcccccgcccctacttccagcgtcgtccctgctgtcagtgccagcgct960

agcgcttccgctggcggtgttgctaagatgtacgagcgctgcggtggtatcaaccacact1020

ggccctactacgtgcgagagcggctccgtttgcaagaagtggaacccttactactaccag1080

tgcgttgcgtctcagtaa1098