中草药的水性萃出物及其组合物与用途的制作方法

本发明涉及中草药的水性萃出物的新用途，特别是单一种中草药的水性萃出物，或是数种中草药的水性萃出物组合，在细胞培养上的新组合物和新用途，以及在对抗皮肤皱纹和皮肤老化上的新组合物和新用途。

背景技术：

纤维母细胞存在于动物体内的许多组织中，用于合成胞外基质和胶原蛋白，有维持结缔组织的基本构造的功用，并且在伤口愈合上扮演重要角色。纤维母细胞也会因为受到自己或周围细胞所分泌的细胞激素的作用，而有迁徙及增生的反应。

培养的纤维母细胞有促进组织修补的效果，可应用的范围相当广泛，包括急性及慢性伤口，到美容及重建手术，皆有良好的临床效果。对于伤口的修补来说，纤维母细胞可培养于生物可分解性材质所制成的支架，做成皮肤替代物产品。目前市场上已有许多皮肤替代物，但其安全性及质量极需要被严格规划及管理。例如，细胞来源是否为人体，产品是否无菌，是否有污染，经冷冻后是否仍有活性，如果为非自体来源，是否有排斥或病毒感染的可能等，都是需严格管理的部分。此外，如何将成本缩减至最小，及产品运用性提升至最大，也是相关技术领域人员急切希望解决的课题。

目前医学美容的治疗中，也会以注射的方式将自体的纤维母细胞做为组织填充物，取代传统注射牛胶原蛋白可能有排斥或受感染的风险。注射玻尿酸也有可能会产生皮下过度免疫反应，造成红肿的现象。因此，注射自体纤维母细胞已为目前医学美容界值得发展的治疗方法。注射自体纤维母细胞可改善脸部皱纹及疤痕，并且不需考虑会有排斥等不良反应的风险，且注射活细胞可使治疗效果延长，减少治疗的次数(weiss,r.a.etal.,dermatol.surg.33(3):263-268)。

因应纤维母细胞在自体注射上的应用，在有效培养人体纤维母细胞的前提下降低胎牛血清(fetalbovineserum，简称fbs)的用量有其必要性。目前，纤维母细胞主要是以含有10％fbs的达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem)为培养液，其中胎牛血清用于提供纤维母细胞成长所需要的养分及生长因子。但是，当使用纤维母细胞制剂时，无论是以注射方式或是以中胚层疗法(mesotherapy)方式进行，都需要使其进入病人体内，而胎牛血清中的成分可能在培养的过程中进入细胞内，安全性难以估测，可能有造成排斥、过敏、甚至疾病感染的风险。况且，胎牛血清单价甚高。因此，在纤维母细胞的培养过程中减少胎牛血清的用量，为目前相当重要的议题。目前有些研究是以自体抽血所分离出的血清做为培养纤维母细胞培养液的营养来源。虽然这个方法较为安全，但培养纤维母细胞需要大量的培养血清。如果想要治疗的病人有贫血现象，就无法取得大量血分离出足够血清。何况在临床上，纤维母细胞可能需要多次继代，此时血清的需求量更高。在上述情况下，病人可能无法顺利进行治疗。因此，业界对于能够促进纤维母细胞生长的胎牛血清替代品，或是能够减少胎牛血清用量的细胞培养补充剂，存在有殷切的需求。

非动物来源的细胞培养补充剂具有疾病传染风险低、成本低廉、来源丰富的优势。法瑞汉蒂等人提出可以使用大豆和米的植物蛋白水解产物做为人类皮肤纤维母细胞的培养补充剂(farizhandi,a.a.k.etal.,adv.environ.biol.8(3spec.issue),838-843)。wo2004/083400a2公开了一种用于培养动物细胞的培养基补充剂，它是由落花生、榛果、杏仁等植物种子萃取而得，可以供用做为胎牛血清的替代品或补充品。日本专利申请第2-49579号提议使用面筋的水解产物和酵母菌萃出物搭配基础培养基，用于培养动物细胞。

技术实现要素：

真皮纤维母细胞专职制造胶原蛋白、弹力蛋白等胞外基质，以维持皮肤的弹性及密度。真皮层具有数量充足的纤维母细胞分泌出足够多的胶原蛋白，才能抚平皮肤的皱纹并且保持皮肤的弹性。因此，真皮纤维母细胞的数量和活力，与皮肤的健康和丰润紧致程度息息相关。本申请的发明人通过人类初代真皮纤维母细胞培养物(primaryhumandermalfibroblastcellculture)建立起一个活体外细胞模型，用于筛选出能够增进纤维母细胞的存活率，及/或促使其分泌胶原蛋白，及/或促进其分泌生长因子，及/或增强其抗氧化能力的医药成份，应用于保养品中，以期达到皮肤抗皱和抗老化的功效。

中草药是中华文化悠久历史的瑰宝，蕴藏着数千年来对于医药用动植物的知识累积。运用上述活体外细胞模型来检验多种中草药萃出物单方或复方组合，本申请的发明人发现，多序岩黄耆(hedysarumpolybotryshand.-mazz.)、泽泻(alismaplantago-aquatica(sam.)juzep)、苦瓜(momordicacharantial.)和地龙(eiseniafoetida)等传统中草药的水性萃出物，无论是单独或组合使用，都可以在仅含有低量胎牛血清的活体外培养条件下促进人类或动物细胞的生长，尤其是可以促进纤维母细胞的生长，例如促进人类真皮纤维母细胞的生长。据此，上述中草药的水性萃出物可供用于降低胎牛血清在细胞培养基中的使用量，由此降低动物细胞的生产成本。特别是，当依据本申请所生产出来的纤维母细胞导入人体时，可以显著地降低因胎牛血清进入人体所产生的潜在健康风险。

因此，依据本发明的第一方面，其提供一种细胞培养基补充剂，其特征在于：所述补充剂包含来自于一或多个生物物种的水性萃出物，所述生物物种选自多序岩黄耆(hedysarumpolybotryshand.-mazz.)、泽泻(alismaplantago-aquatica(sam.)juzep)、苦瓜(momordicacharantial.)和地龙(eiseniafoetida)。

在一优选具体实施方案中，所述水性萃出物选自多序岩黄耆和地龙水性萃出物的组合、多序岩黄耆和泽泻和苦瓜水性萃出物的组合、泽泻和苦瓜和地龙水性萃出物的组合、多序岩黄耆和苦瓜和地龙水性萃出物的组合、以及多序岩黄耆和泽泻和苦瓜和地龙水性萃出物的组合。在一更优选具体实施方案中，所述水性萃出物选自多序岩黄耆和地龙水性萃出物的组合。

根据本发明的第二方面，其提供一种细胞培养基，其特征在于：所述培养基包含前述细胞培养基补充剂；以及一基础培养基，其补充有依据所述细胞培养基的总体积为基准实质上低于10体积％的动物血清，优选为实质上低于5体积％的动物血清，更优选为实质上低于1体积％的动物血清，例如约0.5体积％的动物血清。

根据本发明的第三方面，其提供一种用于培养细胞的方法，其特征在于：

所述方法包含下列步骤：

(a)使所述细胞与前述培养基相接触；以及

(b)在适于支持所述细胞进行活体外培养的条件下，培养所述细胞。

在一优选具体实施方案中，所述细胞是人类或动物细胞。在一更优选具体实施方案中，所述细胞是纤维母细胞。在一更优选具体实施方案中，所述细胞是人类真皮纤维母细胞。

本申请的发明人进一步发现，黄耆和地龙水性萃出物的组合，不但可促进纤维母细胞增殖，也可促进纤维母细胞分泌胶原蛋白，更可以增加以h2o2处理过后的细胞存活率。这个中草药组合对于保持真皮纤维母细胞的数量和活力以对抗皱纹发生，非常具有潜力。

因此，依据本发明的第四方面，其提供一种抗皱纹化妆品调配物，其特征在于所述化妆品调配物包含：多序岩黄耆(hedysarumpolybotryshand.-mazz.)的水性萃出物、地龙(eiseniafoetida)的水性萃出物，以及一化妆品可接受性载剂。

依据本发明的第五方面，其又提供一种预防或改善皮肤皱纹的方法，其特征在于所述方法包含：将前述抗皱纹化妆品调配物涂敷于皮肤表面。

本申请的发明人也发现，地龙水性萃出物单方不但可以提升超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，简称sod)的活性，在h2o2诱发的细胞老化模型中也可增加细胞存活率。此外，多序岩黄耆和地龙水性萃出物的组合、苦瓜和地龙水性萃出物的组合，以及苦瓜和泽泻水性萃出物的组合，也可以增加以h2o2处理过后的细胞存活率。这些中草药组合对于维持真皮纤维母细胞的存活并且防止其老化，非常具有潜力。

因此，依据本发明的第六方面，其提供一种对抗皮肤老化的化妆品调配物，其特征在于所述化妆品调配物包含：来自于一或多个生物物种的水性萃出物，其选自地龙水性萃出物、多序岩黄耆水性萃出物和地龙水性萃出物的组合、苦瓜水性萃出物和地龙水性萃出物的组合，以及苦瓜水性萃出物和泽泻水性萃出物的组合；以及一化妆品可接受性载剂。

依据本发明的第七方面，其又提供一种预防或改善皮肤老化的方法，其特征在于所述方法包含：将前述对抗皮肤老化的化妆品调配物涂敷于皮肤表面。

本发明的目的、特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。

附图说明

图1为柱状图，显示运用各中草药萃出物单方培养纤维母细胞3天所得到的细胞存活率；

图2为柱状图，显示运用各中草药萃出物单方培养纤维母细胞6天所得到的细胞存活率；

图3为柱状图，显示运用各中草药萃出物单方培养纤维母细胞3天所得到胶原蛋白分泌量；

图4为柱状图，显示运用各中草药萃出物单方培养纤维母细胞6天所得到胶原蛋白分泌量；

图5为柱状图，显示运用各中草药萃出物单方培养纤维母细胞3天所得到血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor；vegf)分泌量；

图6为柱状图，显示运用各中草药萃出物单方培养纤维母细胞6天所得到血管内皮生长因子分泌量；

图7为柱状图，显示运用各中草药萃出物单方培养纤维母细胞3天所得到的超氧化物歧化酶(sod)活性；

图8为柱状图，显示运用各中草药萃出物复方培养纤维母细胞3天所得到的细胞存活率；

图9为柱状图，显示运用各中草药萃出物复方培养纤维母细胞6天所得到的细胞存活率；

图10为柱状图，显示运用各中草药萃出物复方培养纤维母细胞3天所得到胶原蛋白分泌量；

图11为柱状图，显示运用各中草药萃出物复方培养纤维母细胞6天所得到胶原蛋白分泌量；

图12为柱状图，显示运用各中草药萃出物复方培养纤维母细胞3天所得到血管内皮生长因子分泌量；

图13为柱状图，显示运用各中草药萃出物复方培养纤维母细胞6天所得到血管内皮生长因子分泌量；

图14为柱状图，显示运用各中草药萃出物复方培养纤维母细胞3天所得到的超氧化物歧化酶(sod)活性；

图15为柱状图，显示各中草药萃出物单方和复方对于经过h2o2处理后的细胞的影响；

图16为荧光显微镜影像，显示运用各中草药萃出物单方处理纤维母细胞后，表达fsp-1的细胞影像；以及

图17为柱状图，显示运用各中草药萃出物单方和复方处理纤维母细胞后，细胞中表达fsp-1的百分比。

具体实施方式

除非另外说明，否则本申请说明书和权利要求书中所使用的下列用语具有下文给予的定义。请注意，本申请说明书和权利要求书中所使用的单数形用语“一”意欲涵盖在一个以及一个以上的所记载事项，例如至少一个、至少二个或至少三个，而非意味着仅仅具有单一个所记载事项。此外，权利要求书中使用的“包含”、“具有”等开放式连接词是表示权利要求中所记载的组件或成分的组合中，不排除权利要求未载明的其他组件或成分。还应注意到用语“或”在意义上一般也包括“及/或”，除非内容另有清楚表明。本申请说明书和权利要求书中所使用的用语“约”或“实质上”，是用以修饰任何可略微变化的误差，但这种略微变化并不会改变其本质。

本申请涉及多序岩黄耆、泽泻、苦瓜和地龙等传统中草药在细胞培养和皮肤保养上的用途。

在本说明书中，术语“多序岩黄耆”和“黄耆”可交互使用，其涵盖hedysarumpolybotryshand.-mazz.(简称为h.polybotrys)这个植物物种的新近收获、未经炮制和经过炮制的完整植株或是植物部分，尤指所述植物的地下部分，例如在传统中草药店铺所贩卖的所述植物的干燥根部。应注意，市面上常用的黄耆包括蒙古黄耆(astragalusmembranaceus(fisch.)bge.var.mongholicus(bge.)hsiao)和膜荚黄耆(astragalusmembranaceus(fisch.)bge.)，它们与本申请中所使用的“多序岩黄耆”属于不同物种。本申请中所使用的“多序岩黄耆”经过中国台湾财团法人工业技术研究院进行植物基原鉴定，确认属于所述物种。

本说明书中所使用的术语“泽泻(alismaplantago-aquatica(sam.)juzep；或简称为a.plantago-aquatica)”，其涵盖这个植物物种的新近收获、未经炮制和经过炮制的完整植株或是植物部分，尤指所述植物的地下部分，例如在传统中草药店铺所贩卖的所述植物块茎部分。通常于冬季茎叶开始枯萎时采挖所述植物的块茎部分，洗净后用微火烘干，除去须根及粗皮，以水润透切片，再加以晒干。泽泻在传统中草药店铺中的贩卖形式通常是经过麸炒或盐水炒等炮制手段加工后的干燥块茎部分。

本说明书中所使用的术语“苦瓜(momordicacharantial.；或简称为m.charantia)”，其涵盖这个植物物种的新近收获、未经炮制和经过炮制的完整植株或是植物部分，尤指所述植物的果实部分。苦瓜是果菜市场上常见的果实类蔬菜。本申请中所使用的苦瓜经过中国台湾财团法人工业技术研究院进行植物基原鉴定，确认属于所述物种。

本说明书中所使用的术语“地龙(eiseniafoetida；或简称为e.foetida)”，也称为赤子爱胜蚓，其涵盖这个动物物种的新近收获、未经炮制和经过炮制的完整虫体或是虫体部分，例如在钓鱼用品店贩卖做为饵料的未经炮制的完整虫体，或是在传统中草药店铺所贩卖的经过炮制的全虫体或虫体片段。在传统炮制过程中，地龙通常于夏、秋季捕捉，剖开腹部后洗去内脏及泥沙，再进行曝晒或低温干燥。干燥的虫体可直接供药用，或是进一步于每100公斤地龙中加入12.5公斤黄酒，拌炒至表面呈棕色，放凉备用。

本申请所称“水性萃出物”是指一种通过使前述一或多种药材与一水性溶剂相接触而遵循标准萃取程序所制备出来的组合物。本说明书中所使用的术语“来自于”是用于指出制备所述水性萃出物的药材来源。所述水性溶剂的例子包括但不限于水、c1-6烷醇(c1-6alkanols)、c1-4亚烷基二醇(c1-4alkyleneglycols)、水性醣类溶液，它们的盐类溶液，以及它们的混合物。在一优选具体实施方案中，所述水性溶剂是选自于水及其盐类溶液。为促进萃取的效率，可以先将药材磨碎，并且于萃取时提高温度及/或压力。在一优选具体实施方案中，所述水性萃出物是以去离子水在高温下进行萃取而得，例如在常压下于约100℃进行萃取。萃取持续的时间视萃取的产率而定，通常会持续30分钟至1天，优选为1至12小时，例如1至3小时。“水性萃出物”这个术语涵盖通过单一水性萃取工序所制得的粗萃物，以及进一步接受一或多个分离及/或纯化工序的粗萃物，包括通过使粗萃物接受一或多个额外的萃取、浓缩、过滤、蒸馏或其他纯化工序而衍生出来的活性组份或馏份(fractions)。当水性萃出物来自于二个以上的药材时，可以先针对个别药材分别进行萃取，再将个别萃出物加以混合，也可以先将这些药材加以混合，再共同进行萃取。的所述水性萃出物可以呈现液体形式，例如溶液、浓缩液或馏出液，也可以呈现半液体形式，例如凝胶。如果有需要，可以将水性萃出物加以冷冻干燥，并且储存于无菌容器中。使用前，再添加例如去离子水等水性溶剂进行复水。

依据本申请，多序岩黄耆、泽泻、苦瓜和地龙的水性萃出物，以及这些水性萃出物的复方组合，可以在仅含有低量胎牛血清的活体外培养条件下促进人类或动物细胞的生长，尤其是可以促进纤维母细胞的生长，例如促进人类真皮纤维母细胞的生长。这指出上述中草药的水性萃出物可供用做为动物细胞培养基的补充剂，以降低动物血清在细胞培养基中的使用量。一般来说，动物细胞培养基皆补充有10％至20％动物血清，以提供细胞生长所需要的蛋白质、无机盐外，生长因子、激素和细胞附着因子等。此处所称“动物血清”意指来自于非人类动物的血液的液体产品，其中血球、纤维蛋白原(fibrinogen)和纤维蛋白(fibrin)皆被移除，供添加于培养基以提供细胞生长所需养料，其包括但不限于胎牛血清(fbs)、小牛血清、成牛血清或是其他动物的血清，例如来自于马和骆驼的血清产品。

本申请采用人类初代真皮纤维母细胞做为中草药水性萃出物的筛选平台。如后文实施例1和7所示，就促进细胞增生的角度来看，相比于使用补充有0.5％fbs的基础培养基的对照组，除了0.5％fbs以外另添加多序岩黄耆、泽泻、苦瓜或地龙的水性萃出物单方或是它们的复方组合的基础培养基，于培养纤维母细胞3天时，皆可使纤维母细胞的数量增加达到1.5倍，培养3天时更可高出1.4至2.4倍，显示前述中草药的水性萃出物都具有促进纤维母细胞生长的效果。实施例7进一步显示，与5％和10％fbs比较，中草药水性萃出物单方或复方搭配0.5％fbs使细胞增生的程度也可以达到使用fbs常规用量(10％)的约50％至66.7％。虽然不希望被任何理论所拘束，但我们相信前述中草药的水性萃出物中不仅含有动物细胞生长所需要的营养成份，也可能含有能够刺激据纤维母细胞释出生长因子的成份，进而促使细胞快速增殖。实施例12也证实，经过前述中草药的水性萃出物处理的纤维母细胞，在快速增生的同时，并不会改变其原有细胞特征，也不会分化成为成熟细胞。

值得特别注意的是，如实施例7所示，当运用多序岩黄耆和地龙水性萃出物的组合、多序岩黄耆和泽泻和苦瓜水性萃出物的组合、泽泻和苦瓜和地龙水性萃出物的组合、多序岩黄耆和苦瓜和地龙水性萃出物的组合、以及多序岩黄耆和泽泻和苦瓜和地龙水性萃出物的组合来培养纤维母细胞，不仅可以使细胞的增生倍数超过2倍，而且这些复方组合所得到的细胞增生效果也较组合中个别单方所得到的效果更好。虽然不希望被任何理论所拘束，但我们相信这五种复方组合中的成份在促进细胞增生上产生了协同功效。因此，在一优选具体实施方案中，所述水性萃出物是来自于前述五种复方组合其中一种。在一更优选具体实施方案中，所述水性萃出物是来自于多序岩黄耆和地龙水性萃出物的组合。

据此，本申请提供一种细胞培养基补充剂，其包含：来自于一或多个生物物种的水性萃出物，所述生物物种选自多序岩黄耆、泽泻、苦瓜和地龙。此处所称“细胞培养基补充剂”是指添加于细胞培养基中以协助维持所述培养基内所接种的细胞的存活及/或促进其增殖的组合物。所述细胞培养基补充剂适用于辅助性地支持人类或动物细胞的活体外培养，较佳为辅助性地支持人类或动物纤维母细胞的活体外培养，例如辅助性地支持人类真皮纤维母细胞的活体外培养。上述中草药的水性萃出物在培养基中的用量，可以由本申请所涉技术领域的普通技术人员经由本领域的常规手段来决定。由于上述中草药的水性萃出物可以取代动物血清在培养基中的部分或全部功能，所以动物血清在细胞培养基中的用量可以由依据所述细胞培养基的总体积为基准为10％的常规用量，大幅度地降低至依据所述细胞培养基的总体积为基准实质上低于10体积％的动物血清，优选为实质上低于5体积％的动物血清，更优选为实质上低于1体积％的动物血清，例如约0.5体积％的动物血清。

因此，本申请也提供一种细胞培养基，其包含：前述细胞培养基补充剂；以及一基础培养基，其补充有依据所述细胞培养基的总体积为基准实质上低于10体积％的动物血清，优选为实质上低于5体积％的动物血清，更优选为实质上低于1体积％的动物血清，例如约0.5体积％的动物血清。所述培养基一般呈现液体或半液体的形式。

术语“基础培养基”是指任何不含有动物血清但含有用于支持人类或动物细胞的活体外培养的无机盐类、氨基酸和维生素等基本营养成份的液体培养基。在一优选具体实施方案中，所述基础培养基不含有生长因子。适用于本发明的基础培养基的例子包括不限于伊格尔基础培养基(basalmediumeagles；bme)、最低基础培养基(minimumessentialmedium；mem)、达尔伯克改良伊格尔培养基(dulbecco'smodifiedeagle'smedium；dmem)、营养混合培养基f-10(ham'sf-10)和营养混合培养基f-12(ham'sf-12)。在一更优选具体实施方案中，所述基础培养基为dmem。

本申请又提供一种使用前述培养基来培养细胞的方法，其包含下列步骤：(a)使所述细胞与前述培养基相接触；以及(b)在适于支持所述细胞进行活体外培养的条件下，培养所述细胞。此处所使用的术语“接触”是指将细胞置入载有培养基的培养容器中。使细胞与培养基相接触的手段属于本申请所涉技术领域的常规例行手段，其包括但不限于使细胞与培养基相混合、以移液管将培养基移入载有细胞的培养容器中、使细胞沈浸于培养基中。此处所使用的术语“培养”是指在有利于细胞生长、存活及/或分化的活体外条件下维持细胞。在一优选具体实施方案中，所述细胞是人类或动物细胞。在一更优选具体实施方案中，所述细胞是纤维母细胞。在一更优选具体实施方案中，所述细胞是人类真皮纤维母细胞。活体外培养细胞的手段属于本申请所涉技术领域的常规技术手段。一般来说，动物细胞的最适温度约为35至37℃。偏离这一温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至导致死亡。温度在43℃以上，细胞大多会死亡。低温对细胞影响较小，将细胞置于25至35℃，细胞仍能生存和生长，但速度缓慢。一般细胞被培养于恒温有氧环境下，而且给予一定浓度的二氧化碳，维持培养基的酸碱值。在一优选具体实施方案中，细胞是在二氧化碳培养箱内进行培养。所述二氧化碳培养箱通常设定于恒温(例如37℃)、稳定的co2水平(例如5％)、恒定的酸碱度(例如ph7.2-7.4)和较高的相对饱和湿度(例如95％)，以模拟细胞在生物体内的生长环境。

本申请通过人类初代真皮纤维母细胞做为筛选平台，进一步筛选出具有抗皮肤皱纹效果的中草药水性萃出物。一般认为，皱纹的生成是导因于环境中(例如阳光紫外线、香烟的烟雾和空气污染)的自由基和活性氧破坏了皮肤的真皮层中胶原蛋白和弹力蛋白的分子间联结，并且造成细胞膜脂质的过氧化。因此，能够促进纤维母细胞增生并且促进其分泌胶原蛋白的中草药水性萃出物，即具有对抗皱纹发生的潜力。如后文实施例8所示，多序岩黄耆和地龙水性萃出物的组合，培养纤维母细胞6天，可以显著地促进细胞分泌胶原蛋白，其效果甚至可达使用10％fbs所得分泌量的2至3倍，从而有助于降低皮肤中胶原蛋白的耗损。值得特别注意的是，多序岩黄耆和地龙水性萃出物的组合促进细胞分泌胶原蛋白的效果，远高于多序岩黄耆和地龙单独使用时所得到的效果。这个实验结果指出，多序岩黄耆水性萃出物和地龙水性萃出物在促进纤维母细胞分泌胶原蛋白上产生了协同功效。实施例7也显示，这个复方组合具有促进纤维母细胞生长的效果。实施例11进一步显示，这个复方组合可以增加以h2o2处理过后的细胞存活率。

据此，本申请也提供一种抗皱纹化妆品调配物，其包含：多序岩黄耆的水性萃出物、地龙的水性萃出物，以及一化妆品可接受性载剂。此处所称“抗皱纹”意指预防皱纹在皮肤上发生及/或改善已经在皮肤上发生的皱纹。应注意，“预防”和“改善”并非意指施用所述抗皱纹化妆品调配物的皮肤永远不生皱纹，而是指相比于未施用所述化妆品调配物的皮肤可以具有更少及或外观较不明显的皱纹。

另一方面，人类皮肤中自然产生的抗氧化分子和酵素会随着年纪渐长而逐渐减少，致使皮肤抗氧化能力无法完全清除环境自由基和活性氧。此外，超氧化物歧化酶(sod)是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶，它是纤维母细胞中的一种主要抗氧化剂。过度的外界刺激(例如阳光紫外线)不但可能导致产生过多自由基，也可能使得sod失去活性。这些因素皆导致皮肤老化。本申请也通过人类初代真皮纤维母细胞做为筛选平台，筛选出具有抗皮肤老化效果的中草药水性萃出物。首先，本申请参照莎托等人和邱等人的文献数据，利用过氧化氢诱导对于细胞形成氧化压力，从而建立起细胞老化的活体外模型(satoh,a.etal.,j.pharm.pharmacol.57(10):1335-1343；以及choi,m.j.etal.,biol.pharm.bull.33(3):421-426)。如后文实施例11所示，地龙水性萃出物单方，以及多序岩黄耆和地龙水性萃出物的组合、苦瓜和地龙水性萃出物的组合，以及苦瓜和泽泻水性萃出物的组合，在h2o2诱发的细胞老化模型中都可增加细胞的存活率。实施例5进一步显示，地龙水性萃出物单方也可以提升超氧化物歧化酶的活性。这些中草药组合对于维持真皮纤维母细胞的存活并且防止其老化，非常具有潜力。

前述中草药的水性萃出物能够对抗过氧化氢形成的氧化压力，甚至可以提升超氧化物歧化酶的活性，即具有对抗皮肤细胞老化的潜力。据此，本申请又提供一种对抗皮肤老化的化妆品调配物，其包含：来自于一或多个生物物种的水性萃出物，其选自地龙水性萃出物、多序岩黄耆水性萃出物和地龙水性萃出物的组合、苦瓜水性萃出物和地龙水性萃出物的组合，以及苦瓜水性萃出物和泽泻水性萃出物的组合；以及一化妆品可接受性载剂。

前述抗皱纹化妆品调配物和对抗皮肤老化的化妆品调配物可呈任何合宜的形式，无特定的限制。在一优选具体实施方案中，所述化妆品调配物是呈现供局部施用的溶液、乳液、乳霜、凝胶、油膏、泡沫剂、肥皂、眼影剂、唇膏、沐浴乳、刮胡膏等保养品或化妆品的形式，其可以经由涂敷于皮肤表面来施用。在一优选具体实施方案中，所述化妆品调配物是呈现供注射于皮下或静脉内的输注液形式，例如悬液剂、静脉输注液、干粉注射剂、悬液注射剂及干粉悬液注射剂等。

本申请所称“化妆品可接受性载剂”意指被使用做为所述中草药水性萃出物的载体的惰性物质，其对于施用的部位(例如皮肤)不具有毒性、刺激性、热原性、抗原性及溶血性，而且无实质的药理活性，也不会妨碍所述中草药水性萃出物的有益效果的发挥。一般来说，化妆品可接受性载剂的用量是依据化妆品调配物的总重量为基准为约1％至约99.9％，优选为约50％至约99％。化妆品可接受性载剂的适用种类视化妆品调配物的形式而定。

下列实施例仅供用于示例本发明，而非限制本发明的范围。各实施例中所显示的实验结果是通过司徒登氏t测验(student’sttest)，与对照组作比较，#:0.05<p<0.1；*：p<0.05。

制备例1：人类真皮纤维母细胞的初代培养

在受试者的同意下取得皮肤样本。将皮肤样本切成0.5至1毫米立方大小的皮肤碎块。随后，将皮肤碎块置入含有fbs、胶原蛋白酶和中性蛋白酶(dispase)的dmem中，于37℃下培育16至18小时。以1,500rpm进行离心5分钟。接着，移去上清液，以补充有fbs的打散细胞及皮肤块，并且将打散的皮肤块及细胞均匀分布于锥瓶中，于37℃下进行培养。细胞生长密度达80％，则进行细胞继代。使用第三代到第六代的细胞进行后述实验。

制备例2：中草药萃出物的制备

多序岩黄耆和泽泻购自于传统中药店铺。地龙购自于地区钓鱼用品店。苦瓜购自于地区果菜市场。

将100克多序岩黄耆加入500克二次去离子水中，随后于常压下煮沸2小时。秤重得210克多序岩黄耆悬浮液。

将100克泽泻加入500克二次去离子水中，随后于常压下煮沸2小时。秤重得242克泽泻悬浮液。

将100克苦瓜果实加入500克二次去离子水中，随后于常压下煮沸2小时。秤重得150克苦瓜悬浮液。

将100克未经炮制的地龙完整虫体加入500克二次去离子水中，随后于常压下煮沸2小时。秤重得170克地龙悬浮液。

使上述各种悬浮液分别通过纱布以滤去杂质。收集滤出液，再于6000rpm下离心30分钟。取上清液，使其通过0.2微米孔径的滤器，并且秤重记录。收集滤出液，做为各中草药萃出物的测试原液，并以无菌血清瓶锁紧瓶盖，置于-20℃冰箱中保存。为了避免所述中草药萃出物中含有大量重金属而影响实验结果，各中草药萃出物的重金属含量都经过检测。检测结果发现，四种中草药萃出物的铅、汞、镉含量皆低于检测底限2ppm(mg/kg)。

在后述实施例中，各中草药萃出物原液将会以对照组培养基稀释数倍，再使用稀释液来处理细胞。举例来说，黄耆100x是指多序岩黄耆萃出物原液经过对照组培养基100倍稀释后所得到的稀释液。

实施例1：使用萃出物单方处理细胞

取定量的制备例1所得纤维母细胞，种入96孔平盘培养皿中，并且在制备例2所制得的个别中草药萃出物的存在下，培养于含有0.5％热去活小牛血清(fbs；美国纽约州gibco公司)的杜氏改良伊格尔培养基(dmem；美国密苏里州圣路易市sigmachemicalco.)，历时3至6天。对照组是使用含0.5％或1.0％fbs的dmem进行培养的制备例1纤维母细胞。收取上清液和细胞，分别进行分析。

实施例2：萃出物单方促进细胞生长

运用市售xtt分析试剂盒(美国密苏里州圣路易市sigmachemicalco.)并且参照试剂盒指南来处理实施例1所得细胞，随后于450nm取得平盘培养皿中各孔的读数，得到细胞存活率。图1和图2显示分别运用黄耆、泽泻和地龙萃出物培养纤维母细胞3天及6天时，都可以观察到细胞的数目相比于0.5％fbs对照组有显著的增加，其中培养3天时增生倍率约只达0.5％fbs对照组的1.2倍，培养6天时更可高达对照组的1.5倍以上。在运用苦瓜萃出物的例子中，则在培养6天后才显著促进纤维母细胞增生。本实施例显示，本申请所使用的4种中草药萃出物单方，都具有促进人类真皮纤维母细胞增生的能力。

实施例3：萃出物单方对于纤维母细胞分泌胶原蛋白的效应

运用市售人类重组第i型胶原蛋白检验试剂盒(美国纽约州gibco公司；试剂盒编号pro-479a)并且参照试剂盒指南来处理实施例1所得上清液，得到各实验组中纤维母细胞的胶原蛋白分泌量。

图3显示以个别中草药萃出物培养纤维母细胞3天所得到胶原蛋白分泌量。相比于0.5％fbs对照组，黄耆萃出物在三个试验浓度下皆可以显著刺激纤维母细胞的胶原蛋白分泌量，且200x稀释液所得到的效果最好。泽泻萃出物在4800x稀释时可显著促进胶原蛋白的分泌量。地龙萃出物在4000x和2000x稀释时也可以显著刺激纤维母细胞分泌胶原蛋白。苦瓜萃出物在试验浓度下没有刺激纤维母细胞分泌胶原蛋白的能力。图4显示以个别中草药单方培养纤维母细胞6天所得到胶原蛋白分泌量，其中只有黄耆200x和地龙8000x的组别可显著促进胶原蛋白的分泌。本实施例显示，黄耆和地龙的萃出物单方搭配0.5％fbs，可以促进纤维母细胞分泌胶原蛋白，其促进效果甚至超过1.0％fbs所达到的效果。

实施例4：萃出物单方对于纤维母细胞分泌生长因子的效应

运用市售vegf检验试剂盒(美国明尼苏达州r&dsystems公司；vegfelisakit，編号dy293b)并且参照试剂盒指南来处理实施例1所得上清液，得到各实验组中纤维母细胞的vegf分泌量。

图5和图6分别显示以个别中草药萃出物培养纤维母细胞3天和6天所得到vegf分泌量。相比于0.5％fbs对照组，中草药萃出物单方对于纤维母细胞vegf分泌的影响，不论是培养3天或6天，都没有显著差异。

在实施例1至4的单方测试实验中，黄耆萃出物在稀释400x时效果最好，地龙萃出物在稀释2000x时效果最好，泽泻萃出物在稀释4800x时效果最好，而苦瓜萃出物在稀释2500x时效果最好。因此，在后续实施例中，使用黄耆400x、地龙2000x、泽泻4800x和苦瓜2500x进行测试。

实施例5：萃出物单方的抗氧化活性

采用市售试剂试剂盒(美国密执安州安娜堡市开曼化学公司(caymanchemical)，试剂盒编号#706002)并且参照试剂盒指南来处理实施例1所得上清液，得到各实验组的超氧化物歧化酶(sod)活性。如图7所示，地龙2000x相比于对照组显著地具有促进sod活性的能力，这表示地龙萃出物具有增进细胞抗氧化能力的作用。

实施例6：使用萃出物复方处理细胞

重复实施例1所述流程，但是将黄耆400x、地龙2000x、泽泻4800x和苦瓜2500x这四种萃出物稀释液加以单独使用或配对组合，用于培养纤维母细胞，历时3至6天。对照组是使用含0.5％或1.0％fbs的dmem进行培养的制备例1纤维母细胞。收取上清液和细胞，分别进行分析。

实施例7：萃出物复方促进细胞生长

运用市售xtt分析试剂盒(美国密苏里州圣路易市sigmachemicalco.)处理实施例6所得细胞，随后于450nm取得平盘培养皿中各孔的读数，得到细胞存活率。图8和图9显示运用上述四种萃出物稀释液培养纤维母细胞3天及6天，不论是单方或复方，都可以促进纤维母细胞增生。培养3天时，各组皆可促进纤维母细胞增生约1.5倍以上，培养6天时更可达2倍。本实施例也显示，这四种萃出物稀释液在培养纤维母细胞时，不会彼此干扰而抑制细胞生成。值得注意的是，如图9所示，当运用黄耆+地龙、黄耆+泽泻+苦瓜、泽泻+苦瓜+地龙、黄耆+苦瓜+地龙、以及黄耆+泽泻+苦瓜+地龙等复方组合来培养纤维母细胞6天时，更可以使细胞的增生倍数超过2倍，而且复方组合所得到的细胞增生效果也较组合中个别单方所得到的效果更好。相比于5％和10％fbs所得到的结果，各种中草药水性萃出物单方或复方搭配0.5％fbs也可以达到约50％至66.7％的细胞增生效果。

实施例8：萃出物复方对于纤维母细胞分泌胶原蛋白的效应

运用市售胶原蛋白检验试剂盒(美国纽约州gibco公司；试剂盒编号pro-479a)并且参照试剂盒指南来处理实施例6所得上清液，得到各实验组中纤维母细胞的胶原蛋白分泌量。

图10和图11显示单独使用或配对组合四种中草药萃出物来培养纤维母细胞3天和6天所得到胶原蛋白分泌量。相比于0.5％fbs对照组，黄耆和地龙的复方组合可以使胶原蛋白的分泌量增加近3倍，其促进效果也大幅超过1.0％fbs所达到的效果。

实施例9：萃出物复方对于纤维母细胞分泌生长因子的效应

运用市售vegf检验试剂盒(美国明尼苏达州r&dsystems公司；vegfelisakit，編号dy293b)并且参照试剂盒指南来处理实施例6所得上清液，得到各实验组中纤维母细胞的vegf分泌量。

图12和图13分别显示单独使用或配对组合四种中草药萃出物来培养纤维母细胞3天和6天所得到vegf分泌量。相比于0.5％fbs对照组，中草药萃出物复方对于纤维母细胞vegf分泌的效应，不论是培养3天或6天，都没有显著差异。

实施例10：萃出物单方的抗氧化活性

重复实施例5所述实验流程，但用于处理实施例6所得上清液，得到各实验组的sod活性。图14显示单独使用或配对组合四种中草药萃出物来培养纤维母细胞3天所得到sod活性。相比于0.5％fbs对照组，各中草药萃出物的复方组合对于sod活性无显著影响。

实施例11：抗细胞老化能力测试

参照莎托等人和邱等人的文献数据，建立测试抗老化能力的细胞模型(satoh,a.etal.,j.pharm.pharmacol.57(10):1335-1343；以及choi,m.j.etal.,biol.pharm.bull.33(3):421-426)。先将制备例1所得纤维母细胞种在12孔平盘培养皿中过夜。待细胞贴附于培养皿后，加入各中草药萃出物稀释液。处理72小时后，以300μmh2o2刺激24小时，诱发细胞提早老化。

本实施例中观察到，在h2o2的影响下，纤维母细胞的形态会改变，趴附状况较差，发生压力诱发性早发老化(stress-inducedprematuresenescence)，并且发生细胞凋亡(apoptosis)。以台盼蓝(trypanblue)染色所算出的细胞数目显示于图15。加入h2o2前，0.5％fbs对照组的细胞数显著较加入h2o2后多。预先以地龙、黄耆+地龙、泽泻+苦瓜、或是苦瓜+地龙萃出物处理细胞72小时，可显著改善h2o2所造成的细胞凋亡现象。

实施例12：萃出物对纤维母细胞特性的效应

为了确认中草药不会对纤维母细胞的性质产生改变，本实施例以抗体染色实施例6所得纤维母细胞，检验其是否仍会表达出纤维母细胞特异性蛋白-1(fibroblastspecificprotein1，简称fsp-1)。如图16所示，以中草药萃出物处理3天后，各组纤维母细胞皆会表达fsp-1这个指标蛋白。图17显示运用各中草药萃出物单方和复方组合处理纤维母细胞后，细胞中表达fsp-1的百分比，即纤维母细胞的纯度。结果显示，各组处理过的纤维母细胞会表达fsp-1的细胞都在95％以上，表示中草药萃出物单方或复方组合都不会影响初代真皮纤维母细胞表达fsp-1的特性。这指出纤维母细胞的基本特性不会受中草药萃出物的影响而改变。

以上各实施例仅供说明本发明，而并非对本发明的限制，相关领域的技术人员，在不脱离本发明的技术范围做出的各种变换或变化也应属于本发明的保护范畴。