用于肝细胞培养及肝脏类器官制备的培养基的制作方法

本发明涉及肝脏细胞的培养及类器官的建立，具体而言，本发明涉及用于肝细胞培养及肝脏类器官制备的培养基。
背景技术：
：肝脏是人体最大的解毒器官，也是人体内最大的消化腺，同时也是机体物质能量代谢的中心。肝脏主要由两种上皮细胞组成，分别是肝细胞和胆管细胞。肝脏的主要功能包括：储存肝糖原，合成基本的分泌性蛋白，清除外源化合物，调控机体代谢，转运药物以及排泄胆汁等。正是由于肝脏具有重要的生理功能，很多与肝脏有关的疾病，如肝炎、肝癌、肝纤维化、肝硬化、急慢性肝衰竭等，均有较高的发病率和死亡率。中国是肝炎感染的高发国家，因此重症肝脏疾病在中国的发病率也非常高。肝脏移植仍然是重症肝脏疾病治疗最有效的手段。由于肝脏供体的匮乏，很多重症肝脏疾病患者最终在保守治疗中死去，因此亟待需要发展新的治疗手段来提高肝病治疗的存活率。如果能将一个肝脏供体的细胞分离并移植给多个病人，可以大大节省肝源，使更多病人获得治疗机会。肝细胞的移植治疗在动物模型中已经进行了数十年的研究，并且研究结果显示肝细胞移植可以显著改善肝损伤动物的肝功能和个体存活率。人胚胎肝细胞或成体肝实质细胞移植可显著提高急性肝衰竭病人的存活率，并已被用于延长急性肝衰竭病人的生命。因此肝细胞移植治疗是未来治疗重症肝脏疾病的趋势。尽管肝细胞在体内具有强大的再生能力，但是在体外成熟肝细胞的长时间培养仍然是一个世界性难题。体外肝细胞培养主要采用三种策略：一是肝脏细胞的体外直接培养，二是通过干细胞的体外肝细胞定向分化培养，三是通过诱导纤维祖细胞转分化为类肝细胞培养。成熟肝细胞的培养一直是世界性难题，近期的研究表明，成熟肝细胞仅仅可以在体外维持一周左右的扩增培养。尽管胆管细胞可以在体外长期培养，但是其在诱导转分化为肝细胞以后仅能有限地恢复肝损伤动物的肝功能。利用人类胚胎干细胞(hes)和诱导多潜能性干细胞(hips)的体外分化技术，可以诱导干细胞分化成具有肝细胞标记物和部分肝细胞功能的“类肝细胞”。通过体外化学诱导或者转染肝细胞特异性的转录因子，可以诱导成纤维细胞转分化为具有部分肝细胞功能的肝细胞。然而近期的研究显示，这种体外的重编程将可能导致遗传和表观遗传改变，诱导产生基因组不稳定性和基因突变，将转基因生物材料移植入人体将面临很大的伦理学问题，这些缺陷将导致hes和hips来源的“类肝细胞”细胞移植具有巨大的风险。目前迫切需要建立一套可控的肝脏细胞培养新技术体系，在体外培养出具有肝组织器官功能的正常成熟肝细胞。类器官(organoid)研究是极重要的前沿性热点领域，是一种最新的细胞体外培养技术，即由干细胞定向诱导分化细胞、正常组织细胞或者病人发病组织细胞培养而形成的三维体外组织培养技术。类器官模型能够很好地模拟细胞在体内的微环境，对在体外构建具有生理功能的研究模型具有得天独厚的优势。目前，利用类器官培养已经在体外成功构建了结肠、胃、前列腺和胰腺等组织类器官。尽管类器官培养研究仍处于相对起步阶段，但是其作为一种重要的研究技术已经开始被广泛应用于干细胞和肿瘤的研究。类器官具有以下主要优点：(1)维持了组织器官细胞的高度复杂性；(2)维持了功能细胞与微环境基质的接触极性，更好地模拟了体内微环境；(3)来源于临床组织的类器官培养效率高，耗时少，可进行细胞的长期培养；(4)同时具备了可进行遗传操作的优点和模型的三维复杂特性。最新的研究表明，类器官可以快速准确地预测抗癌药物的疗效。类器官技术被naturemethods评价为2017年生命科学领域最具潜力的年度技术。类器官模型将在疾病模型构建、器官移植、药物筛选、药物安全性测试和药物疗效评价等领域发挥巨大的应用价值技术实现要素：本发明通过细胞谱系示踪技术标记小鼠的成熟肝脏细胞，结合流式细胞分选和肝细胞的类器官培养技术，发现成熟的小鼠肝脏细胞可以进行快速增殖，并能在体外长期培养，且具备肝脏细胞特异性的基因表达，例如albumin、hnf4α、krt8、cdh1等。另外，肝脏类器官中存在胆管细胞的分化，在类器官中形成类似胆管的结构。同时，本发明也建立了源于人胚胎肝脏和正常肝脏样本的肝脏细胞类器官培养体系，获得了长期培养的人肝脏类器官。在此基础上，通过将肝脏类器官细胞移植到肝脏损伤小鼠模型，本发明人发现肝脏类器官能够显著地恢复肝损伤小鼠的肝功能，并显著提高动物的存活率。因此，本发明第一方面提供一种无血清细胞培养基，其以用于哺乳动物细胞生长的培养基为基础培养基，添加有补充l-谷氨酰胺的试剂、维持培养基ph值稳定的ph值调节剂、原代细胞培养抗生素、血清替代物、n-乙酰半胱氨酸和任选的烟酰胺，以及添加有bmp抑制剂、wnt激动剂、生长因子、rock信号通路抑制剂、p38信号通路抑制剂、notch信号通路抑制剂、地塞米松、bmp7和camp激活剂中的一种或任意多种。在一个或多个实施方案中，所述无血清细胞培养基以用于哺乳动物细胞生长的培养基为基础培养基，添加有补充l-谷氨酰胺的试剂、维持培养基ph值稳定的ph值调节剂、原代细胞培养抗生素、血清替代物、n-乙酰半胱氨酸和任选的烟酰胺，以及添加有生长因子和rock信号通路抑制剂，任选地添加有bmp抑制剂、wnt激动剂、p38信号通路抑制剂、notch信号通路抑制剂、地塞米松、bmp7和camp激活剂中的一种或任意多种。在一个或多个实施方案中，所述基础培养基为改进dmem/f12或改进rpmi培养基。在一个或多个实施方案中，所述bmp抑制剂选自noggin、a-83-01、dan和dan样蛋白的一种或多种；优选地，所述bmp抑制剂在所述培养基中的终浓度在0.5-800ng/ml培养基的范围内。在一个或多个实施方案中，所述wnt激动剂选自rspondin、gsk抑制剂和wnt3(如wnt3a)中的一种或多种；优选地，每种wnt激动剂的终浓度为1-1500ng/ml培养基。在一个或多个实施方案中，所述生长因子选自表皮生长因子、转化生长因子β、基本的成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、脑源性神经营养因子和角质化细胞生长因子中的一种或多种；优选地，所述生长因子的终浓度为1-1000ng/ml培养基。在一个或多个实施方案中，所述rock信号通路抑制剂选自y27632、ha1077和h1152中的一种或多种；优选地，所述rock抑制剂的终浓度在0.5-50μm的范围内。在一个或多个实施方案中，所述notch信号通路抑制剂选自dapt(gsi-ix)、mk-0752、ro4929097、semagacestat(ly450139)、ly411575、dibenzazepine(yo-01027)、avagacestat、crenigacestat、ngp555中的一种或多种；优选地，所述notch信号通路抑制剂的终浓度为0.1-50μm。在一个或多个实施方案中，所述p38信号通路抑制剂选自sb203580，doramapimod，sb202190，ly2228820，vx-702，ph-797804，vx-745，tak-715，bms-582949，losmapimod，pexmetinib和skepinoe-l中的一种或多种；优选地，所述p38信号通路抑制剂的终浓度为1-20μm。在一个或多个实施方案中，所述camp激动剂为forskolin；优选地，所述camp激动剂的终浓度为1-200μm。在一个或多个实施方案中，所述细胞培养基为细胞增殖培养基，以用于哺乳动物细胞生长的培养基为基础培养基，添加有补充l-谷氨酰胺的试剂、维持培养基ph值稳定的ph值调节剂、原代细胞培养抗生素、血清替代物、n-乙酰半胱氨酸和烟酰胺，以及添加有bmp抑制剂、wnt激动剂、生长因子、rock信号通路抑制剂、p38信号通路抑制剂和camp激活剂中的一种或任意多种。在一个或多个实施方案中，所述细胞增殖培养基添加有bmp抑制剂、wnt激动剂、生长因子和rock信号通路抑制剂，并任选地添加有以及p38信号通路抑制剂和camp激活剂中的一种或两种。在一个或多个实施方案中，所述细胞培养基为细胞增殖培养基，包含作为bmp抑制剂的noggin和a-83-01，作为有丝分裂生长因子的egf、fgf10和fgf2，作为wnt激动剂的rspondin，以及作为rock信号通路抑制剂的y27632，并补充有glutamax-i、维持培养基ph值稳定的ph值调节剂、原代细胞抗生素、b27血清替代物、烟酰胺和n-乙酰半胱氨酸；优选地，所述细胞培养基还含有作为wnt激动剂的gsk抑制剂如chir99021，和/或wnt3a。在一个或多个实施方案中，所述增殖培养基还含有p38抑制剂如sb202190、camp激活剂如forskolin、和bmp7中的任意一种、任意两种或全部三种。在一个或多个实施方案中，所述增殖培养基中，当含有时：noggin的终浓度为5-15ng/ml；a-83-01的终浓度为300-800ng/ml；egf的终浓度为20-80ng/ml；fgf10的终浓度为5-15ng/ml；fgf2的终浓度为0.1-2ng/ml；rspondin的终浓度为50-150ng/ml；y27632的终浓度为5-15μm；sb202190的终浓度为5-15μm；camp激活剂的终浓度为5-15μm；gsk抑制剂的终浓度为1-5μm；bmp7的终浓度为10-40ng/ml；wnt3a的终浓度为300-600ng/ml。在一个或多个实施方案中，所述细胞培养基为细胞分化培养基，以用于哺乳动物细胞生长的培养基为基础培养基，添加有补充l-谷氨酰胺的试剂、维持培养基ph值稳定的ph值调节剂、原代细胞培养抗生素、血清替代物和n-乙酰半胱氨酸，并添加有bmp7、生长因子、rock信号通路抑制剂、notch信号通路抑制剂和地塞米松的一种或任意多种。在一个或多个实施方案中，所述分化培养基添加有bmp7、生长因子、notch信号通路抑制剂、地塞米松和rock信号通路抑制剂。在一个或多个实施方案中，所述细胞培养基为细胞分化培养基，含有bmp7、生长因子、notch信号通路抑制剂、rock信号通路抑制剂和地塞米松，并补充了glutamax-i、维持培养基ph值稳定的ph值调节剂、原代细胞抗生素、b27血清替代物和n-乙酰半胱氨酸；优选地，所述生长因子包括fgf10、fgf2和hgf以及任选的fgf19，所述notch信号通路抑制剂为dapt，所述rock信号通路抑制剂为y27632。在一个或多个实施方案中，所述分化培养基中，所述bmp7的终浓度为10-40ng/ml，所述生长因子的终浓度为50-200ng/ml，所述notch信号通路抑制剂的终浓度为1-15μm，所述rock信号通路抑制剂的终浓度为5-15μm，所述地塞米松的终浓度为0.01-30μm。在一个或多个实施方案中，所述分化培养基中，fgf10的终浓度为5-15ng/ml；fgf2的终浓度为0.1-2ng/ml；hgf的终浓度为10-40ng/ml；当含有时，fgf19的终浓度为10-100ng/ml；y27632的终浓度为5-15μm；地塞米松的终浓度为1-10μm；和dapt的终浓度为5-15μm。本发明还提供一种试剂盒，其含有作为基础培养基的用于哺乳动物细胞生长的培养基，补充l-谷氨酰胺的试剂、维持培养基ph值稳定的ph值调节剂、原代细胞培养抗生素、血清替代物、n-乙酰半胱氨酸和任选的烟酰胺，以及bmp抑制剂、wnt激动剂、生长因子、rock信号通路抑制剂、p38信号通路抑制剂、notch信号通路抑制剂、地塞米松、bmp7和camp激活剂中的一种或任意多种。在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还含有细胞外基质。在一个或多个实施方案中，所述试剂盒含有本文任一实施方案所述的培养基；优选地，所述试剂盒含有所述细胞增殖培养基和细胞分化培养基。本发明还提供一种细胞培养物，所述细胞培养物含有本文任一实施方案所述的培养基以及肝脏细胞。在一个或多个实施方案中，所述细胞培养物为含有所述培养基及类器官的细胞培养物。本发明还提供一种肝细胞培养方法，所述方法包括使用本文任一项所述的细胞增殖培养基制备肝细胞悬液，将该悬液与细胞外基质混合，然后进行培养的步骤，和/或使用本文任一实施方案所述的细胞分化培养基对细胞进行分化的步骤。本发明还提供本文所述的类器官或采用所述的方法制备得到的类器官在药物开发、药物筛选和食品补充剂的毒性测定中的应用。附图说明图1：29种细胞因子组合方式分别培养等量细胞，第1天类器官情况。图2：29种细胞因子组合方式分别培养等量细胞，第6天类器官情况。图3：29种细胞因子组合方式分别培养等量细胞，第12天类器官情况。图4：29种细胞因子组合方式分别培养等量细胞，第14天类器官情况。图5：29种细胞因子组合方式分别培养等量细胞，第20天类器官情况。图6：通过人体胎肝细胞培养基建立了肝脏类器官培养体系。离体组织块儿经过机械剪切和胶原酶消化成单细胞后，在基质胶上进行3d培养形成类器官。图示为种下5-7天后，明场下不同肝脏样本的类器官形成情况。图7：利用人体胎肝细胞培养基建立了肝脏类器官的长期培养体系。图8：胚胎肝脏类器官形成效率。图9：胚胎肝脏类器官形成效率的统计。图10：胚胎肝脏类器官维持肝细胞基因的表达。图11：胚胎肝脏类器官低表达afp。图12：胚胎肝脏类器官维持肝脏的组织学特征。图13：胚胎肝脏类器官表达成熟肝细胞的标志物。图14：胚胎肝脏类器官高表达肝细胞功能的相关标志物。图15：胚胎肝脏类器官高表达细胞色素p450酶家族的基因。图16：胚胎肝脏类器官具有成熟肝的功能。图17：胚胎肝脏类器官可以延长肝损伤小鼠的寿命。图18：胚胎肝脏类器官可以整合进肝损伤小鼠的肝脏中。图19：胚胎肝脏类器官具有修复frg模型小鼠肝脏的功能。图20：胚胎肝脏类器官移植到frg肝损伤模型的小鼠内具有分泌alb的功能。图21：胚胎肝脏类器官在体外长期培养具有向胆管细胞转分化的倾向。图22：建立成体肝细胞类器官培养体系。图23：成体肝细胞类器官形成效率检测。图24：成体肝细胞类器官形成效率。图25：成体肝细胞类器官形成效率的统计。图26：成体肝细胞类器官维持肝细胞基因表达。图27：成体肝细胞类器官表达成熟肝细胞的标志物。图28：成体肝细胞类器官高表达细胞色素p450酶家族的基因。图29：成体肝细胞类器官主要由肝细胞构成。图30：成体肝细胞类器官具有成熟肝的功能。图31：成体肝脏类器官具有向胆管分化的潜能。图32：4种分化培养基诱导分化14天细胞生长情况。图33：4种分化培养基诱导分化14天肝细胞相关标志物表达情况。图34：分化后的肝脏类器官形成肝细胞-胆管细胞类器官结构。图35：分化成熟的肝细胞-胆管细胞类器官具有与肝脏组织相似的基因表达谱。图36：分化成熟的肝细胞-胆管细胞类器官具有成熟肝细胞功能。图37：分化成熟的肝细胞-胆管细胞类器官具有细胞色素p450酶家族3a4活力。图38：分化成熟的肝细胞-胆管细胞类器官具有成熟胆管细胞的功能。图39：分化成熟的肝细胞-胆管细胞类器官具有修复急性肝损伤小鼠肝脏的功能。图40：分化成熟的肝细胞-胆管细胞类器官可以整合进急性肝损伤小鼠的肝脏中。图41：分化成熟的肝细胞-胆管细胞类器官可以延长慢性肝损伤小鼠的寿命。图42：分化成熟的肝细胞-胆管细胞类器官移植到frg肝损伤模型的小鼠内具有分泌alb的功能。图43：分化成熟的肝细胞-胆管细胞类器官可以整合进慢性肝损伤小鼠的肝脏中。图44：分化成熟的肝细胞-胆管细胞类器官具有修复损伤肝脏的功能。图45：分化成熟的肝细胞-胆管细胞类器官在体内可形成胆管结构。具体实施方式应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。本领域周知，成熟肝细胞在体外培养条件下存活通常不超过1周，并且在普通体外培养条件下无法增殖。为解决此问题，本文提供肝脏细胞的培养方法，该方法包括使含分离的肝脏细胞的细胞培养液与细胞外基质(ecm)接触的步骤。本发明人发现，利用本发明的方法培养肝细胞能提高肝细胞的存活时间，维持成熟肝细胞的分化特性，实现分化肝细胞的持续存在。在不存在ecm的条件下，无法长时间培养肝细胞培养物，并且观察不到分化的肝细胞持续存在。此外，ecm的存在下可培养获得三维的组织类器官。具体而言，在某些实施方案中，采用本文所述的方法培养的肝细胞可发育成肝细胞-胆管细胞的类器官，该类器官包含衬有胆管样的上皮的管腔，形成管腔的细胞维持胆管的功能。所产生的类器官既有肝细胞的特征又部分发挥胆管的功能。更意外的是，本发明人发现，在不存在干细胞龛的条件下，采用本文所述的方法能使得单个分离的原代肝细胞长成肝细胞-胆管细胞的类器官。该单元的开放的上部分封闭，并且腔充有凋亡细胞。新形成的肝的类器官发挥肝脏的功能，同时具有修复受损伤肝脏的功能。而在不存在ecm的条件下培养不出三维的组织类器官。本文中，“肝脏细胞”指任何分离自肝脏的细胞，包括但不限于原代肝细胞、胚胎肝干/祖细胞和肝癌细胞。从肝脏组织分离肝脏细胞的方法在本领域是已知的，主要的分离方法包括非灌流法(spotornoetal.，2006)和灌流法(kuniyoshietal.，2004)。非灌流法又分为：机械分离法(kravchenkoetal.，2002)：即通过使用外科手术器械，将肝脏组织分离成小块，通过吹散挤压分离得到肝细胞；胰酶消化法(wangetal.,2017)：利用胰酶来破坏肝细胞之间的桥梁，使肝细胞分离的一种方法；胶原酶消化法(ehrhardtandschmicke,2016)：用胶原酶来破坏细胞之间的纤维成分，现将组织剪成小块用无钙无镁的pbs中清洗一遍，置于胶原酶中消化，后用含血清的dmem中止反应，离心得到肝细胞悬液。灌流法是指通过下腔静脉向肝脏中依次注入多种分离溶液进而获得肝细胞的一种方法。在某些实施方案中，本发明选用离体胶原酶灌流法获得小鼠肝细胞。离体胶原酶灌流法是将离体灌注与胶原酶消化相结合的方法，在使用该方法分离肝细胞时，解剖暴露小鼠肝门静脉及下腔静脉，于下腔静脉内置管，建立灌流通路。首先用预热的无钙无镁的ebss液灌流80-150ml，换用含钙镁离子的ebss溶液持续灌流50-80ml，然后换用胶原酶作持续灌流，使肝细胞与间质分离，释放肝细胞。接着用肝细胞终止液终止胶原酶的消化作用，过滤、离心、弃上清后用肝细胞培养液重悬沉淀得到肝细胞悬液。在某些实施方案中，本发明选用机械分离法与胶原酶消化法相结合获得人源肝细胞。先剥除肝组织被膜和血管等纤维成分，用剪刀将肝组织剪成1mm3左右的小块，将小块肝组织转移至含有肝细胞分离培养基的离心管中，用吸管轻微吹打，静置沉淀后弃上清，洗涤数次后，加入适量的4-8mg/ml的iv型胶原酶在37℃培养箱中震荡消化一段时间(如40-80min，如60min左右)。待无明显肉眼可见块状组织，用含10％胎牛血清的高糖dmem终止反应，600-1000rpm离心3-6min后弃上清。沉淀即包含所需肝细胞。本文中，“细胞外基质”由结缔组织细胞分泌，包含多种多糖、水、弹性蛋白和糖蛋白，其中糖蛋白包括胶原蛋白、纤连蛋白、巢蛋白和层粘连蛋白。不同类型的ecm是已知的，其包括不同的组成，如含有不同类型的糖蛋白或糖蛋白的不同组合。产细胞外基质的细胞的实例是主要产胶原蛋白和蛋白聚糖的软骨细胞，主要产iv型胶原蛋白、层粘连蛋白、间质前胶原蛋白和纤连蛋白的成纤维细胞，和主要产胶原蛋白(i、iii和v型)、硫酸软骨素蛋白聚糖、透明质酸、纤连蛋白和肌糖蛋白c的结肠成肌纤维细胞。本文中，ecm中所含的多糖、弹性蛋白、糖蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、巢蛋白和层粘连蛋白为本领域周知的ecm中所含的各种多糖、弹性蛋白、糖蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、巢蛋白和层粘连蛋白。例如，胶原蛋白可以是本领域周知的包含于天然ecm中的i、iii、iv和v型胶原蛋白。适用于本文的ecm可从市售途径获得。可商购的细胞外基质的实例包括细胞外基质蛋白(invitrogen，r&dsystems)和基质胶(matrixgeltm，bdbiosciences)等。在某些实施方案中，本文的培养方法中使用的ecm包含至少两种不同的糖蛋白，例如两种不同类型的胶原蛋白或一种胶原蛋白与一种层粘连蛋白。所述ecm可以是合成的水凝胶细胞外基质或天然存在的ecm。最优选的ecm由基质胶(3-dculturematrixtm)(r&dsystems)提供，其包含层粘连蛋白。分离获得待培养的肝细胞后，可用本文所述的增殖培养基制成细胞悬液，与ecm混合，进行3d培养。适用于本文所述方法的细胞培养基(也称为基础培养基)可以是任何细胞培养基，尤其是用于人类细胞培养的细胞培养基。优选的细胞培养基是用基于碳酸盐的缓冲液缓冲至ph为7.2-7.6、优选7.4的规定合成培养基。例如，合适的培养基是无血清(如不含胎牛血清或小牛血清)、且含胰岛素的改进dmem/f12或改进rpmi培养基。通常，为代替胎牛血清，消除未知生长因子的影响，可在本发明的细胞培养基中添加适量的血清替代物，如b27supplement(gibco)。视需要，培养基中还可添加有其它维持细胞生长所需的营养成分，包括但不限于补充l-谷氨酰胺的试剂(如glutamax-i)、ph调节剂(如维持培养基ph值稳定的试剂，如hepes)、原代细胞培养抗生素(如primocin)以及青霉素-链霉素等。这些添加物的添加量可根据情况采用常规方法加以确定。例如，原代细胞培养抗生素的终浓度可以在50-200ug/ml的范围内。在某些实施方案中，基础培养基中还添加有烟酰胺和n-乙酰半胱氨酸，以为细胞的生长提供所需的环境。烟酰胺的添加量通常为1-50mm，例如10-20mm。n-乙酰半胱氨酸的添加量通常为0.5-20mm，例如1-5mm。在某些实施方案中，本发明的细胞增殖培养基中还添加有bmp抑制剂、wnt激动剂、生长因子、rock抑制剂、p38抑制剂和camp激活剂中的一种或任意多种。在某些实施方案中，本发明的细胞增殖培养基中添加至少添加有bmp抑制剂、wnt激动剂、生长因子和rock抑制剂。在某些实施方案中，本发明的细胞培养基添加有bmp抑制剂、wnt激动剂、生长因子和rock抑制剂，并任选添加有p38抑制剂和camp激活剂中的一种或两种。bmp与tgf-β超家族的受体部位结合，从而招募和激活smad家族转录因子，调控基因表达。bmp抑制剂为与bmp分子结合而形成复合物的试剂，其通过阻止或抑制bmp分子与bmp受体的结合来中和bmp活性。本文中，bmp抑制剂指能将细胞中的bmp依赖性活性抑制到相对于不存在所述抑制剂时的bmp活性水平的至多90％，更优选至多80％、更优选至多70％、更优选至多50％、更优选至多30％、更优选至多10％、更优选0％的制剂。如本领域技术人员所已知的，可以通过测定bmp的转录活性来测定bmp活性(franceschietal.，2000)。bmp抑制剂可以是起拮抗剂或反向激动剂作用的试剂，如抗体，这类抑制剂与bmp受体结合，并阻止bmp与所述受体结合。已知几类天然的bmp结合蛋白，包括noggin(peprotech)、脊索蛋白和包含脊索蛋白结构域的脊索蛋白样蛋白(r&dsytems)、卵泡抑素和包含卵泡抑素结构域的卵泡抑素相关蛋白(r&dsytems)、dan和包含dan半胱氨酸结结构域的dan样蛋白(r&dsytems)、硬化蛋白(sost，r&dsytems)、核心蛋白多糖(r&dsytems)和α2巨球蛋白(r&dsystems)。在某些实施方案中，bmp抑制剂也包括tgf-β抑制剂，如a-83-01。可在本发明的培养基中同时添加数种bmp抑制剂。在某些实施方案中，本文使用的bmp抑制剂可选自noggin、a-83-01、dan和包括cerberus和gremlin在内的dan样蛋白(r&dsytems)。这些可扩散的蛋白能以不同的亲和度与bmp配体结合，并抑制这些bmp配体接近信号转导受体。向基础培养基中添加任何这些bmp抑制剂能防止肝细胞丢失，否则在培养约1周之后就会发生肝细胞丢失。添加到基础培养基中的bmp抑制剂的量和频次可根据不同抑制剂的抑制活性加以确定，通常bmp抑制剂在培养基中的终浓度在0.5-800ng/ml培养基的范围内。例如，在某些实施方案中，本文使用noggin。noggin是一个重要的信号分子，在动物体节胚胎发育中起重要作用，由脊索释放在生长发育中调控bmp的表达。作为分泌多肽，noggin结合tgf-β超家族成员如骨形成蛋白-4(bmp-4)，使其失活。通常，培养基中，noggin的终浓度为0.5-500ng/ml。在某些实施方案中，noggin的终浓度为1-200ng/ml，例如1-150ng/ml、1-100ng/ml、1-50ng/ml、5-15ng/ml或20-100ng/ml。在某些实施方案中，本文使用tgf-β抑制剂，如a-83-01作为bmp抑制剂；通常，其在培养基中的终浓度为100-800nm，例如300-800nm、300-600nm或400-600nm。在某些实施方案中，本文将noggin及a-83-01加到培养基中；通常，noggin的终浓度为1-200ng/ml，如50-150ng/ml或5-15ng/ml，a-83-01的终浓度为300-600nm，如400-600nm。在肝脏细胞的培养过程中，优选每两天向培养基添加bmp抑制剂，优选每三天更换培养基。wnt信号通路由wnt蛋白与7种跨膜受体(frizzled家族成员)的细胞表面受体结合时起作用。这导致dishevelled家族蛋白的活化，结果抑制包含axin、gsk3的蛋白和蛋白apc的破坏复合体从而抑制βcatenin的降解。产生的核富集的βcatenin通过tcf/lef家族转录因子而增强转录。本发明人发现，向基础培养基添加至少一种wnt激动剂对于肝细胞增殖是必需的。本文中，wnt激动剂被定义为激活细胞中tcf/lef介导的转录的试剂。因此，wnt激动剂选自结合并活化frizzled受体家族成员(包括任何和所有的wnt家族蛋白)的真正的wnt激动剂、细胞内β-catenin降解的抑制剂和tcf/lef的激活剂。相对于不存在wnt激动剂时的wnt活性水平，所述wnt激动剂将细胞中的wnt活性刺激至少提升10％，更优选至少20％、更优选至少30％、更优选至少50％、更优选至少85％、更优选至少100％。如本领域技术人员所已知的，可以通过测定wnt的转录活性来确定wnt活性，例如通过ptopflash和ptopflashtcf荧光素酶报告构建体(maetal.,2015)。wnt激动剂包括分泌型糖蛋白，该分泌型糖蛋白包括wnt-1/int-1、wnt-2/irp(int-1相关蛋白)、wnt-2b/13、wnt-3/int-4、wnt-3a、wnt-4、wnt-5a、wnt-5b、wnt-6、wnt-7a、wnt-7b、wnt-8a/8d、wnt-8b、wnt-9a/14、wnt-9b/14b/15、wnt-10a、wnt-10b/12、wnt-11、wnt-12、wnt-13、wnt-14、wnt-14b、wnt-15、wnt-16。在“thewntfamilyofsecretedproteins”(https://www.rndsystems.com/cn/resources/articles/wnt-family-secreted-proteins)，r&dsystems目录，2004中提供了关于人wnt蛋白的概述。其它的wnt激动剂包括分泌型蛋白的rspondin家族，该家族参与wnt信号通路的激活和调节，并由4个成员rspondin1、rspondin2、rspondin3和rspondin4组成；wnt激动剂还包括norrin(norrie或ndp)，其功能类似于wnt蛋白的分泌型调控蛋白，能以高亲和力与frizzled4受体结合并诱导wnt信号通路的活化(zhangetal.,2017)。最近鉴定出wnt信号通路的小分子激动剂，即氨基嘧啶衍生物(linetal.,2016)，并且也明确包括在wnt激动剂中。在某些实施方案中，wnt激动剂是gsk抑制剂。已知的gsk抑制剂包括小干扰rna(sirna；cellsignaling)、锂(sigma)、1-azakenpaullone(selleck)、tws119(selleck)、sb216763(selleck)、chir-99021、chir-98014以及能阻止gsk3与axin相互作用的frat家族成员和frat衍生的肽。测定gsk3抑制水平的方法和测定是本领域技术人员已知的，并且包括例如(dandekaretal.,2017；uwaietal.,2016)所描述的方法和测定。可同时添加数种wnt激动剂。每种wnt激动剂的添加量也与不同wnt激动剂的激动活性相关，通常在1-1500ng/ml基础培养基的范围内。例如，合适的添加量包括1-800ng/ml、1-500ng/ml、1-300ng/ml、1-200ng/ml、1-100ng/ml、20-300ng/ml、20-100ng/ml等范围内。在某些实施方案中，本文使用的wnt激动剂包括：rspondin1-4、norrin和gsk抑制剂中的一种或多种。在某些实施方案中，所述wnt激动剂为rspondin、gsk抑制剂和/或wnt3(如wnt3a)。优选地，当使用rspondin家族的蛋白作为wnt激动剂时，其在培养基中的终浓度可在50-1500ng/ml的范围内，如50-1000ng/ml、50-500ng/ml、50-200ng/ml或50-150ng/ml；当使用gsk抑制剂如chir-99021或chir-98014作为wnt激动剂时，其终浓度在0.1-20um的范围内，例如1-5μm、5-15μm或3-12μm；当使用wnt3如wnt3a作为wnt激动剂时，其终浓度可在1-1000ng/ml的范围内，例如10-500ng/ml、300-600ng/ml、400-600ng/ml或50-250ng/ml。在肝细胞的培养过程中，优选每三天更换新鲜培养基。添加到细胞增殖培养基中的生长因子通常是纯化的生长因子，该生长因子可以是天然的、半合成的或合成的生长因子。在某些实施方案中，添加到基础培养基中的生长因子是有丝分裂生长因子，所述生长因子家族包括表皮生长因子(egf，peprotech)、转化生长因子β(tgfβ，peprotech)、基本的成纤维细胞生长因子(bfgf，peprotech)、脑源性神经营养因子(bdnf，r&dsystems)、肝细胞生长因子和角质化细胞生长因子(kgf，peprotech)。可从市售途径获得这类生长因子，例如，可使用peprotech的表皮生长因子、转化生长因子β、基本的成纤维细胞生长因子、和角质化细胞生长因子；可使用r&dsystems提供的脑源性神经营养因子。egf对于多种培养的外胚层和中胚层细胞是有效的有丝分裂因子，并且对特定细胞的体内和体外分化和细胞培养物中的某些成纤维细胞的分化具有重要影响。egf前体以膜结合分子的形式存在，其经蛋白水解被切割而产生能刺激细胞的53个氨基酸的肽激素。因此，优选的有丝分裂生长因子是egf。egf可以用tgf-β替换，可用fgf2或fgf10替换kgf。可添加一种或数种有丝分裂生长因子，各有丝分裂生长因子的添加量可依据其生物学活性而确定，例如各有丝分裂生长因子的添加量通常在0.1-1000ng/ml(终浓度)、优选1-500ng/ml的范围内。例如，可以5-500ng/ml的浓度将egf添加到基础培养基中。优选的终浓度范围是5-200ng/ml，更优选为20-100n/ml，更优选为20-80ng/ml。在某些实施方案中，优选的浓度为至少10、18、28、36、45或50ng/ml且不高于500、400、300、200、150或100ng/ml。同样的浓度可用于fgf，优选用于fgf10或fgf2。如果使用多于一种fgf，例如fgf2和fgf10，那么fgf的浓度按上文所述来限定并且指的是所用的fgf的总浓度。在某些实施方案中，当含有时，fgf10的终浓度可为1-100ng/ml，如1-50ng/ml、1-20ng/ml或5-15ng/ml。在某些实施方案中，当含有时，fgf2的终浓度可为0.1-10ng/ml，例如0.1-5ng/ml或0.1-2ng/ml。在肝细胞的培养过程中，优选每三天更换培养基。可以使用bfgf家族的任何成员。优选地，使用fgf2或fgf10。在某些实施方案中，所述有丝分裂生长因子选自：egf、tgf-β、kgf、fgf10和fgf2中的一种或多种。在某些实施方案中，所述有丝分裂生长因子为：egf、tgf-β和kgf；egf、tgf-β和fgf2；egf、tgf-β和fgf10；egf和kgf；egf和fgf2；egf和fgf10；tgf-β和kgf；tgf-β和fgf2；或egf、fgf2和fgf10。rock(rho激酶)抑制剂能防止失巢凋亡，尤其当培养单一干细胞时。合适的rock抑制剂优选地选自y27632(selleck)、ha1077(caymanchemical)和h1152(tocrisbioschience)等。rock抑制剂的用量可以是常规的用量。例如，在某些实施方案中，rock抑制剂如y27632的终浓度在0.5-50μm的范围内，如5-20μm或5-15μm。在培养所述肝细胞中，优选持续添加所述rho激酶抑制剂，例如y27632。还可添加到基础培养基中的成分是p38信号通路的抑制剂。p38蛋白激酶是由han等用内毒素刺激哺乳动物细胞，从中分离纯化的酪氨酸磷酸蛋白激酶。p38是mapk家族控制炎症反应最重要的成员，它可因生理性应激、脂多糖、渗透性应激和紫外线照射而激活。p38通路的关键酶包括mapkk类的mkk3、mkk6和mapkkk类的tak、ask、mlk。tak被tak结合蛋白(tab)激活，介导转化生长因子(tgf-β)的信号转导。tak亦可以激活mkk4，进而活化p38。p38激活后发生核转位，并对许多蛋白激酶和转录因子具有磷酸化和激活的作用。p38信号通路的抑制剂包括sb203580，doramapimod(birb796)，sb201190，ly2228820，vx-702(抑制p38amapk)，ph-797804，vx-745(作用于p38a)，tak-715(作用于p38a)，bms-582949(抑制p38amapk)，losmapimod(gw856553x，r-1503/ro4402257)，pexmetinib(arry-614)，skepinoe-l。本发明人发现，在肝类器官培养中加入p38信号通路抑制剂的一种或几种可以改善类器官的增殖速度。p38信号通路抑制剂如sb202190的添加量通常在1-50μm(终浓度)的范围内。优选使用sb202190，其用量为可以在1-20μm的范围内，如5-15μm。本发明人发现，在基础培养基中添加p38信号通路抑制剂(如sb202190)，其对细胞增殖速率影响不大，但可延缓肝细胞特性丢失，当培养培养至28天之后，能利用rt-pcr或免疫组化检测到胆管细胞标志物krt19的表达。还可添加到基础培基中的另一种组分为真核细胞腺苷酸环化酶(ac)激活剂(camp激动剂)，如forskolin。forskolin在各种各样细胞类型中是一种普遍存在的camp激动剂，在细胞生理学研究中，通常用来提高camp水平。本发明人发现，在肝类器官培养过程中加入过camp激动剂，对维持成体肝类器官增殖有一定的效果。培养基中camp激动剂的浓度通常可在1-200μm的范围内，例如1-100μm、5-50μm或5-15μm。因此，在某些实施方案中，在至少添加有本文所述的骨形态发生蛋白(bmp)抑制剂、wnt激动剂、有丝分裂生长因子和rock抑制剂的含细胞外基质的细胞培养基中实施。可同时或错时向细胞培养基中添加适量的骨形态发生蛋白(bmp)抑制剂、wnt激动剂、有丝分裂生长因子和rock抑制剂。例如，如前文所述，每三天更换培养基，因此，可在同一天同时添加骨形态发生蛋白(bmp)抑制剂、wnt激动剂、有丝分裂生长因子和rock抑制剂，每三天更换全部培养基。可根据当前培养状态适当调整骨形态发生蛋白(bmp)抑制剂、wnt激动剂、有丝分裂生长因子和rock抑制剂的添加量和添加时机。所述培养基中还任选地添加有前文所述的p38信号通路的抑制剂和camp激动剂中的任意一种或全部两种。在某些实施方案中，本文所述的细胞增殖培养基包含作为bmp抑制剂的noggin和a-83-01，作为有丝分裂生长因子的egf、fgf10和fgf2，作为wnt激动剂的rspondin，以及作为rho抑制剂的y27632，并补充了glutamax-i、培养基ph值稳定的试剂、原代细胞抗生素、b27血清替代物、烟酰胺和n-乙酰半胱氨酸。培养基中各成分的含量可如前文任一实施方案所述。优选地，该培养基中，noggin的终浓度为1-20ng/ml、优选5-15ng/ml，egf的终浓度为10-100ng/ml、优选30-80ng/ml，fgf10的终浓度为1-20ng/ml、优选5-15ng/ml，fgf2的终浓度为0.1-5ng/ml、优选0.5-2ng/ml，rspondin的终浓度为10-200ng/ml、优选50-150ng/ml，y27632的终浓度为1-20μm、优选5-15μm。在某些实施方案中，该细胞培养基还含有作为wnt激动剂的gsk抑制剂如chir99021和/或wnt3a，其终浓度可分别为1-5μm和300-700ng/ml。在某些实施方案中，本文所述的培养基还含有p38抑制剂如sb202190、camp激活剂如forskolin、和bmp7中的任意一种、任意两种或全部三种，含有时，其终浓度可分别为5-15μm、5-15μm和10-40ng/ml。本文的细胞培养基支持分离的肝细胞在包含作为细胞外基质的基质胶的三维培养物中进行培养。该培养基能促进培养的细胞存活25天。培养可在常规的条件下进行，例如在5-10％co2环境中进行。温度可以是常规的肝细胞培养温度。在某些实施方案中，本文所述的培养包括使用本文所述的培养基制备肝脏细胞悬液(细胞密度可在为1×103～1×108每200μl悬液)，与细胞外基质混合均匀后种植在相应的容器中，放入培养箱中待胶滴凝固后，加入本文所述的培养基继续培养。通常，以等体积比与细胞外基质混合。本文所述的培养方法还可用于从胰腺、肺单分选的上皮干细胞的培养。当采用本文所述的方法和培养基培养单一肝细胞时，后期会向胆管细胞转分化，利用本文提供的分化培养基可使转分化的胆管细胞部分获得肝细胞的特征，形成复杂的肝细胞-胆管细胞的类器官结构。优选的细胞分化培养基是用基于碳酸盐的缓冲液缓冲至ph为7.2-7.6、优选7.4的规定合成培养基。例如，合适的培养基是无血清(如不含胎牛血清或小牛血清)、且含胰岛素的改进dmem/f12或改进rpmi培养基。通常，为代替胎牛血清，消除未知生长因子的影响，可在本发明的细胞培养基中添加适量的血清替代物，如b27supplement(gibco)。视需要，培养基中还可添加有其它维持细胞生长所需的营养成分，包括但不限于补充l-谷氨酰胺的试剂(如glutamax-i)、ph调节剂(如维持培养基ph值稳定的试剂，如hepes)、原代细胞培养抗生素(如primocin)以及青霉素-链霉素等。这些添加物的添加量可根据情况采用常规方法加以确定。例如，原代细胞培养抗生素的终浓度可以在50-200ug/ml的范围内。在某些实施方案中，基础培养基中还添加有n-乙酰半胱氨酸和bmp7，以为细胞的生长提供所需的环境。n-乙酰半胱氨酸的添加量通常为0.5-20mm，例如1-5mm。bmp7的终浓度为10-40ng/ml，例如20ng/ml。在某些实施方案中，本发明的分化培养基还可含有本文所述的生长因子、rock信号通路抑制剂、notch信号通路抑制剂以及地塞米松的一种或任意多种。在细胞分化培养基中添加的生长因子优选包括成纤维生长因子以及肝细胞生长因子。优选地，成纤维生长因子为fgf10和fgf2；当含有时，fgf10的终浓度可为1-100ng/ml，如1-50ng/ml、1-20ng/ml或5-15ng/ml。fgf2的终浓度可为0.1-10ng/ml，例如0.1-5ng/ml或0.1-2ng/ml。在某些实施方案中还添加有fgf19，当含有时，fgf19的终浓度为10-200ng/ml，例如50-150ng/ml。在某些实施方案中还包含有肝细胞生长因子(hgf)，当含有时，其终浓度为10-40ng/ml。在细胞分化培养基中添加的rock信号通路抑制剂，如y27632的终浓度在0.5-50μm的范围内，如5-20μm或5-15μm。在细胞分化培养基中添加的地塞米松的终浓度可以是0.01-30μm，如1-10μm或1-5μm。本文中，notch信号通路抑制剂可选自dapt(gsi-ix)、mk-0752、ro4929097、semagacestat(ly450139)、ly411575、dibenzazepine(yo-01027)、avagacestat、crenigacestat、ngp555中的一种或多种。通常，在细胞分化培养基中，notch信号通路抑制剂的终浓度为0.1-50μm，如0.1-10μm或5-30μm。因此，肝脏细胞类器官的分化在以用于哺乳动物细胞生长的培养基为基础培养基，添加有补充l-谷氨酰胺的试剂、维持培养基ph值稳定的ph调节剂、原代细胞培养抗生素、血清替代物和n-乙酰半胱氨酸，并添加有bmp7、生长因子、rock信号通路抑制剂、notch信号通路抑制剂以及地塞米松的一种或任意多种含细胞外基质的细胞分化培养基中实施，每隔三天更换一次培养基。优选地，该细胞分化培养基含有bmp7、生长因子、rock信号通路抑制剂、notch信号通路抑制剂以及地塞米松。在某些实施方案中，该细胞分化培养基含有生长因子fgf10、fgf2和fgf19，rock信号通路抑制剂的y27632，notch信号通路抑制剂dapt，并补充了glutamax-i、维持培养基ph值稳定的ph调节剂、原代细胞抗生素、b27血清替代物、bmp7和n-乙酰半胱氨酸。利用该培养基进行诱导分化，在大约2周后，可使转分化的胆管细胞部分回复肝细胞的特性并具有肝细胞的功能。在某些实施方案中，本发明的细胞分化培养基无血清且含胰岛素的改进dmem/f12或改进rpmi培养基为基础培养基，含有glutamax-i、培养基ph值稳定的试剂、原代细胞抗生素、b27血清替代物、bmp7、n-乙酰半胱氨酸、fgf10、fgf2、y27632、hgf、地塞米松和dapt，任选含有fgf19；其中，该培养基中，bmp7的终浓度为10-40ng/ml，fgf10的终浓度为5-15ng/ml，fgf2的终浓度为0.1-5ng/ml，y27632的终浓度为5-30μm，hgf的终浓度为10-40ng/ml，地塞米松的终浓度为1-5μm，dapt的终浓度为5-30μm，所述任选的fgf19添加时其终浓度为50-200ng/ml。在大约增殖2周、分化2周后，形成了十分类似于利用完整的肝脏所获得的肝细胞-胆管细胞的类器官结构的结构。这些类器官的组织学分析也表明：其保留了基本的肝细胞-胆管细胞构造、存在所有分化的肝脏上皮细胞类型，且不存在非上皮成分。本文还提供前文任一实施方案所述的任意一种细胞培养基。在某些实施方案中，本文提供的无血清细胞培养基以用于哺乳动物细胞生长的培养基为基础培养基，添加有补充l-谷氨酰胺的试剂、维持培养基ph值稳定的ph值调节剂、原代细胞培养抗生素、血清替代物、n-乙酰半胱氨酸和任选的烟酰胺，以及添加有生长因子和rock信号通路抑制剂，任选地添加有bmp抑制剂、wnt激动剂、p38信号通路抑制剂、notch信号通路抑制剂、地塞米松、bmp7和camp激活剂中的一种或任意多种。在这些实施方案中，可在该培养基的基础上，任选地添加所述任选成分，如烟酰胺、bmp抑制剂、wnt激动剂、p38信号通路抑制剂、notch信号通路抑制剂、地塞米松、bmp7和camp激活剂等，从而配制得到前文任一实施方案所述的细胞增殖培养基和细胞分化培养基。在某些实施方案中，本文还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有本文任一实施方案所述的无血清细胞培养基。优选地，试剂盒含有本文任一实施方案所述的增殖培养基和分化培养基。优选地，试剂盒中还含有ecm。在某些实施方案中，试剂盒中含有用于配制本文所述培养基的独立包装的各种成分，例如独立包装的基础培养基、bmp7、骨形态发生蛋白(bmp)抑制剂、wnt激动剂、生长因子和rock抑制剂，任选的p38信号通路的抑制剂和/或camp激动剂，notch信号通路抑制剂以及地塞米松；试剂盒中还可任选地包括可独立包装或以混合物形式提供的glutamax-i、维持培养基ph值稳定的ph调节剂、原代细胞抗生素、b27血清替代物、烟酰胺和n-乙酰半胱氨酸中的一种或多种。在某些实施方案中，试剂盒中可含有独立包装的添加了补充l-谷氨酰胺的试剂、维持培养基ph值稳定的ph值调节剂、原代细胞培养抗生素、血清替代物、n-乙酰半胱氨酸、生长因子和rock信号通路抑制剂的基础培养基，和各自独立包装的烟酰胺、bmp抑制剂、wnt激动剂、p38信号通路抑制剂、notch信号通路抑制剂、地塞米松、bmp7和camp激活剂中的一种或任意多种。本文也包括本文所述的细胞培养基在肝脏细胞培养中的应用，尤其是在延长肝脏细胞的存活时间、维持成熟肝细胞的分化特性和/或实现分化肝细胞的持续存在中的应用。本文还包括本文所述的细胞培养基在制备肝脏类器官中的应用。在某些实施方案中，本文还提供一种细胞培养物，该细胞培养物含有采用本文所述方法制备得到的肝脏细胞。任选地，该细胞培养物还含有本文所述的细胞培养基。在某些实施方案中，该培养物含有本文所述的培养基、肝脏细胞以及ecm。在某些实施方案中，所述细胞培养物是肝细胞-胆管细胞的类器官，其包含衬有胆管样上皮细胞的中央腔，所述胆管样上皮细胞是通过在本文所述的细胞培养基中培养肝细胞转化而产生的。优选地，所述肝细胞-胆管细胞的类器官利用本文所述的方法获得。本文还提供肝细胞-胆管细胞的类器官的集合体，每个集合体包含多于10个，优选多于20个、更优选多于40个类器官。所述肝细胞-胆管细胞的类器官集合体优选包含至少20％的活细胞、更优选至少50％的活细胞、更优选至少60％的活细胞、更优选至少70％的活细胞、更优选至少80％的活细胞、更优选至少90％活细胞。可以在facs中利用hoechst染色或碘化丙啶染色评价细胞活力。采用本文所述的方法或细胞培养基制备得到的肝细胞-胆管细胞类器官包含衬胆管样上皮的管腔。该腔在连续的时间间隔是开放的，从而将内容物释放到培养基中。所述类器官可以传代并且可以持续培养至少6个月，而不会丧失重要的特性。本文所述的细胞培养物，尤其是肝细胞-胆管细胞可替代商品化原代肝细胞系，用于药物开发、药物筛选和食品补充剂的毒性测定。因此，本文还提供本文所述的细胞培养物，尤其是所述类器官在药物开发、药物筛选、毒性测定或再生医学中的用途。此外，本文所述的细胞培养物，尤其是所述类器官还可用于细胞色素p450酶活性的检测、肝脏解毒功能研究等方面。在检测所述类器官的酶活性时，可以在加入相应底物后直接通过高效液相色谱仪检测cyp450家族酶活力的变化，也可以加入相应的诱导剂观察酶活力的变化。在检测肝脏代谢活力时，可以外源加入phenacetin，coumarin，dextromethorphan等观察肝脏解毒功能。另外，将本文所述的类器官移植到肝受损伤的动物中还可修复受损的肝脏。采用本文所述的方法和培养基可提供大量的肝脏细胞。我国是乙肝大国，虽然早期的抗病毒治疗可以一定程度的缓解病人肝硬化，肝衰竭的发展，但依然有很多病人发展到肝衰竭。患者因肝功能衰竭而导致的生活质量差严重影响了病人的生存质量，而为了维持患者生存，沉重的医药费往往为家庭带来严重的负担。与肾衰竭的透析不同，现在尚没有成熟的人工肝能模拟肝脏的功能。由于肝脏本身结构的复杂性，功能的多样性，使得人工肝的建立未取得一个很好的突破。而机械模拟肝功能不如利用体外培养的肝细胞来帮助行使肝功能更有可行性。而采用本文所述的方法能够获得大量的能够稳定行使肝功能的细胞，将使人工肝的研究迈进一大步。下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并不意图限制本发明的范围。实施例中所到的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。一、材料和方法1、组织块分离肝细胞法原代肝细胞来自肝癌患者的癌旁组织分离。胎肝细胞来自医院流产胎儿的肝脏组织。肝癌的癌旁组织或流产胎儿的肝脏组织经组织分离培养基(advancedmem/f12中加入glutamaxtm、hepes、青霉素/链霉素、primocin、rock信号通路抑制剂)清洗3遍，以便除掉血迹、杂质、细菌，通过外科手术剪将组织剪成小块儿(＜0.1mm3)，转移至离心管中静置待肝脏组织块沉积在管底，弃掉上清，用适量6mg/mliv型胶原酶溶液(含rock信号通路抑制剂)重悬沉淀，放在37℃培养箱中震荡消化1h。待无肉眼可见块状结构，用高糖dmem(加入glutamaxtm、青霉素/链霉素、10％fbs)终止反应，300g离心5min，弃掉上清。用肝细胞清洗培养基(高糖dmem加入glutamaxtm、青霉素/链霉素、10％fbs；percol溶液；含钙离子、镁离子的ebss溶液)重悬细胞，采用差速离心法去掉死细胞和细胞碎片，用红细胞裂解液裂解红细胞。最后重悬在肝细胞培养基中，70μm滤器过滤即得到单个的肝细胞。为进一步得到纯度较高、活力较好的肝细胞，我们利用流式分选的方法处理上述获得的肝细胞。将过滤后的肝细胞以1*107/ml重悬，人epcam抗体(miltenyibiotec)按照1：250的比例进行染色，并通过dapi标记死细胞，通过流式细胞分选获得活力较好的肝细胞。2、肝细胞培养方法使用以下29种增殖培养基分别制备肝细胞悬液(细胞密度为1×106每200μl悬液)，与基质胶等体积混合均匀，种植在六孔板内，放入培养箱中待胶滴凝固后，加入3ml相应的培养基继续培养，培养在37℃、5％co2环境中进行。这29种培养基以改进dmem/f12(invitrogen)为基础培养基，按表2所示添加表1所示的添加剂制备得到。表1表2使用以下4种分化培养基对增殖的肝脏类器官进行诱导分化。当需要制备有功能的肝细胞-胆管细胞类器官时，在增殖良好的肝脏类器官中添加以下4种分化培养基。培养在37℃、5％co2环境中进行。这4种培养基以改进dmem/f12(invitrogen)为基础培养基，按表4所示添加表3所示的添加剂制备得到。表3表4分化培养基1abcdef分化培养基2bcdef分化培养基3abcde分化培养基4bcde3、肝细胞-胆管细胞细胞群鉴定通过单细胞测序分析不同时期培养的肝细胞类器官，以及肝细胞-胆管细胞类器官可发现在增殖前期大部分细胞为肝细胞，在后期肝细胞呈现向胆管细胞分化的趋势，经过分化培养基诱导分化后能形成同时含有肝细胞，胆管细胞，干细胞的复杂结构。4、肝细胞类器官及肝细胞-胆管细胞类器官相关特征和功能的鉴定将所述得到的类器官在体内外进行功能鉴定。体外鉴定方法主要包括形态、基因表达和肝细胞功能鉴定。肝类器官及肝细胞-胆管细胞类器官中的类肝细胞具有与肝实质细胞类似的全基因表达谱，表现在mrna水平和蛋白水平均表达肝实质细胞的基因，主要包括：肝脏相关转录因子(hnf4a，hnf1a)、分泌蛋白基因(alb、serpina)、细胞骨架基因(krt8)、细胞连接基因(cdh1)、肝代谢功能相关基因(cyp450家族、糖代谢相关g6pc)等，利用qpcr检测相关基因的mrna表达水平并通过rna测序对全基因表达情况进行鉴定；利用elisa法(humanalbuminelisaquantitationset:e80-129)检测培养基中人源白蛋白的相对含量；利用免疫荧光检测肝特异性标志物(goat-anti-alb；rabbit-anti-hnf4a；rabbit-anti-fah)骨架蛋白(rabbit-anti-krt19)与连接蛋白(mouse-anti-cdh1)的表达情况。而肝细胞-胆管细胞同时还具有胆管细胞的表达特征如krt19，以及干细胞的表达特征如epcam。功能鉴定方面肝细胞主要包括糖原染色、油红染色、吲哚菁绿等肝相关特异性染色，高效液相色谱法检测细胞色素p450家族酶活力的情况等。体内鉴定方法包括将上述培养的肝脏类器官利用上述传代方法得到类器官小团，利用胰酶将小团消化成单细胞，终止消化后，用70μm滤器过滤得到单细胞。将这些细胞利用门静脉注射的方法移植进入8周龄肝功能损伤的小鼠体内对其进行治疗。利用elisa法检测小鼠体内的人血白蛋白水平及免疫组织学法检测特异性人源基因的表达。胆管细胞功能的体外鉴定主要包括荧光素二乙酸盐的摄取和排出。在体内主要通过将上述形成的肝细胞-胆管细胞类器官移植到scid小鼠肾包膜下生长，利用免疫组织学法检测胆管细胞相关基因的表达。二、结果1、29种培养基培养胎肝细胞的结果如图1－5所示，其中图1－5分别显示第1天、第6天、第12天、第14天和第20天类器官的形成情况。图中显示，采用第9种培养基取得了最好的培养结果。2、建立胚胎肝细胞类器官长期培养体系将分离得到的原代肝细胞用第9种培养基按1*106每200μl的密度与基质胶等体积混合，种植在6孔板上，然后转移至培养箱中培养，待胶滴凝固，补充3ml培养基进行3d培养。待3-5天形成典型的类器官结构后，将其吹散为单细胞的状态，重新用基质胶包被，待其凝固后转移至生物反应器中进行悬浮式培养，约14天即可形成典型的肝脏类组织，进一步培养会形成复杂结构的类器官。结果如图6和7所示。图6显示种下5-7天后明场下不同样本的类器官形成情况。利用本发明的培养基，原代肝细胞可以在体外长期培养，每次传代采用机械吹散的方式效果最佳。图7显示，离体组织块经过机械剪切和胶原酶消化成单细胞后，在基质胶上进行3d培养形成类器官，传至25代细胞依然呈现良好的活力。图示为不同传代次数后，明场下不同样本的类器官形成情况。肝脏类器官的结构为典型的上皮样类器官结构即单层极性上皮形成的类球体。肝脏类器官细胞在体外具有增殖能力，对本实验所获得的肝脏类器官细胞进行了致瘤性检测。具体而言，将该肝脏类器官细胞皮下注射到裸鼠腹股沟。结果显示，注射2月后，该肝脏类器官细胞依然不能成瘤。3、胚胎肝脏类器官形成效率将分离得到的胎肝细胞，分别以每孔200，500，1000，5000，10000个的分类方式，分别种到24孔板中，3天更换一次新鲜培养基(第9种培养基)，每隔两天拍照记录类器官形成效率。当到14天时，统计每孔中类器官的形成数量。以上实验重复三次以上，结果如图8和9所示。图9显示，胎肝类器官的形成效率约为9％。4、胚胎肝脏类器官具有肝的相关基因表达采用与前述第2点相同的方法培养分离得到的原代肝细胞，约14天形成了典型的肝类器官结构，取出适量类器官进行总rna抽提，逆转录形成cdna后通过qpcr检测相关基因的表达情况。结果如图10所示。从alb、hnf4a、hnf1a、krt8的基因表达结果可以看出，胎肝可以维持较高的肝细胞特性，alb约占成体肝的80％，hnf4a、hnf1a、krt8的基因表达水平高于成体肝。5、胚胎肝脏类器官低表达afp采用与前述第2点相同的方法培养分离得到的原代肝细胞，约14天形成了典型的类肝组织。形成后取出适量类器官进行总rna抽提，逆转录形成cdna后通过qpcr检测afp的表达。结果如图11所示。结果显示，胎肝组织本身afp的表达量比较高，随着培养时间的延长，afp的表达量逐渐降低，与成体肝样本间没有明显的差异。6、胚胎肝类器官具有肝的组织学特征采用与前述第2点相同的方法培养分离得到的原代肝细胞，约14天形成了典型的类肝组织。形成后取出适量类器官进行多聚甲醛固定，然后进行石蜡包埋、4μm连续切片、h&e染色等操作。结果如图12所示。结果显示，从早期的肝脏类器官到培养一个月的类器官的过程观察来看，类器官具有成熟肝脏的特征，并呈现典型的肝细胞特征：核大；多边形少数呈圆形，偶见双核；细胞间相互接触，界限清晰，排列成肝索样结构等。7、胚胎肝脏类器官表达成熟肝细胞的标志物采用与前述第2点相同的方法培养分离得到的原代肝细胞，约14天即可形成典型的肝类器官结构，取出适量类器官用多聚甲醛固定后进行石蜡包埋，4μm连续切片，抗原修复，封闭，一抗4℃过夜，二抗室温1h，dapi染色7分钟，封片。结果如图13所示。结果表明，培养前期的类器官高表达alb、hnf4a、cdh1，低表达krt19，具有成熟肝细胞的特征。8、胚胎肝脏类器官表达成熟肝细胞的功能基因采用与前述第2点相同的方法培养分离得到的胎肝细胞，约14天即可形成典型的类肝组织，取出适量类器官进行总rna抽提，逆转录为cdna，通过qpcr进行成熟肝细胞功能基因检测。结果如图14和15所示。从serpina、cdh1、cyp3a4、sox17的基因表达结果可以看出，肝脏的类器官可以保持相对较高的肝功能基因表达；从cyp2b6、cyp2c18、cyp2c8、cyp2d6、cyp3a4的基因表达结果可以看出，肝脏的类器官可以保持相对较高的肝解毒功能基因表达。9、胚胎肝脏类器官具有成熟的肝功能采用与前述第2点相同的方法培养分离得到的胎肝细胞，约21天即可形成典型的复杂的类器官结构，取出进行相关功能实验研究，按照油红染色方法，糖原染色方法进行相关功能染色。结果如图16所示。从油红染色、糖原染色的结果可以看出，肝脏的类器官具有成熟肝的功能。10、胚胎肝脏类器官具有修复肝损伤小鼠肝脏的功能将按照前述第2点培养形成了复杂结构的类器官消化成单细胞，按照每只鼠移植1*106个细胞到8-12周的frg小鼠中，通过门静脉移植的方式，将细胞注入，48小时后取血检测人源alb的分泌情况，随后每两周取一次血检测人源alb的表达情况，直至2个月。2个月后，处死小鼠，取出肝脏后进行多聚甲醛固定、石蜡包埋、连续切片并进行h&e染色和免疫组织化学染色的处理。结果如图17-20所示。结果显示，肝脏类器官可以延长frg肝损伤模型小鼠寿命。具体而言，将肝脏类器管移植到肝损伤的免疫缺陷frg小鼠中，可以发现撤掉ntbc水之后，对照组于1个月内死亡，而移植了肝脏类器官的小鼠普遍可以活到2个月，即治愈了肝损伤，差异明显(图17)。此外，从免疫荧光的结果可以看出，在frg小鼠的肝脏中可以检测到人源基因alb的表达，提示人源肝细胞整合到受损伤的小鼠肝脏中(图18)。从h&e染色的结果可以看出，受损伤的frg小鼠在移植了肝脏类器官后可见多边形的肝细胞，成条索状的肝细胞索结构，而阴性对照中就有大量坏死结构；从fah的免疫组化结果可以看出，肝脏的类器官整合到受损伤的肝结构中(图19)。分别检测第30天和第60天小鼠血液中人源alb的含量情况，从实验结果可以出，移植2个月内，alb的量稳定维持在100-300ng/ml范围内(图20)。11、胚胎肝脏类器官在后期会出现向胆管细胞转分化的倾向图21显示，按照前述第2点培养形成的肝脏类器官在体外长期培养具有向胆管细胞转分化的倾向。从免疫荧光的结果可以看出前期培养过程中及p3代及以前，alb处于高表达的状态，krt19处于低表达或弱表达的状态，在培养后期krt19慢慢向胆管位置聚集，同时alb的表达也相应降低。12、建立成体肝脏类器官培养体系将得到的成体肝脏(来自肝癌患者癌旁组织)经过机械剪切和iv型胶原酶消化，待没有明显的块状组织，终止反应，以800rpm/min离心5min，弃上清，加入含10％胎牛血清的dmem-高糖培养液重悬，用70μm网筛过滤，细胞悬液在4℃条件下800rpm/min离心3min，离心弃上清。沉积的细胞用红细胞裂解液裂解红细胞，离心，用上述培养基重悬，台盼蓝染色测定肝细胞活力。将上述分离得到的成体肝细胞按前述第2点所述方法进行培养。结果显示，成体肝类器官在体外培养，约一周可以呈现典型类器官结构，并且可以稳定传代(图22)。将分选得到的epcam阳性，阴性的细胞群分别培养，发现均可形成典型的类器官结构，但是阴性的效率较未分选和epcam阳性的细胞略低(图23)。将从组织中分离到的单个肝细胞分别以每孔200，500，1000，5000，10000个种到24孔板中，每隔两天拍照记录类器官形成效率。当到14天时，统计每孔类器官数量。图24和25显示成体肝类器官形成效率。成体肝类器官形成效率约1％。13、成体肝脏类器官具有肝的相关基因表达采用与前述第12点相同的方法培养成熟肝脏类器官，在第三次传代时取出适量类器官抽取rna，逆转录形成cdna后通过qpcr检测相关基因的表达情况。结果如图26所示。从alb、hnf4a、apoe、serpina的基因表达结果可以看出，成熟肝类器官可以维持较高的肝细胞特性，serpina的表达水平高于成体肝组织，alb、hnf4a、apoe具有较高的表达水平。14、成体肝脏类器官表达成熟肝细胞的标志物采用与前述第12点相同的方法培养分离得到的原代成熟肝细胞，取出适量类器官用多聚甲醛固定后进行石蜡包埋，4μm连续切片，抗原修复，封闭，一抗4℃过夜，二抗室温1h，dapi染色7分钟，封片。结果如图27所示。结果表明，培养前期的类器官高表达hnf4a、cdh1，具有成熟肝细胞的特征。15、成体肝脏类器官表达成熟肝细胞的功能基因采用与前述第12点相同的方法培养成熟肝脏类器官，在第三次传代时取出适量类器官抽取rna，逆转录形成cdna后通过qpcr检测相关基因的表达情况。从图28可看出，成熟肝脏类器官高表达细胞色素p450家族的基因cyp3a4、cyp2b6、cyp2c8、cyp2c18、cyp2d6。说明培养的成熟肝脏类器官具有肝脏的解毒功能。16、早期成体肝脏类器官主要由肝细胞和肝干细胞组成采用与前述第12点相同的方法培养成熟肝脏类器官，在第三次及以前传代时取出适量类器并消化成单细胞，利用10×genomics的方法进行单细胞测序，观察细胞组成。结果如图29所示，早期的肝脏类器官主要由肝细胞，肝干细胞组成。其中肝细胞占主要部分，高表达alb。17、成体肝脏类器官具有成熟肝细胞的功能采用与前述第12点相同的方法培养成熟肝脏类器官，形成复杂的类器官结构后，取出进行相关功能实验研究，按照油红染色方法，糖原染色方法，吲哚菁绿染色方法进行相关功能染色。结果如图30所示。从油红染色、糖原染色、吲哚菁绿染色的结果可以看出，成体肝脏的类器官能摄取低密度脂蛋白，储存糖原，吸收吲哚菁绿，具有成熟肝的功能。18、成体肝脏类器官在后期会出现向胆管细胞分化的倾向采用与前述第12点相同的方法培养成熟肝脏类器官，从图31所示的实验结果中可以看出：在培养后期大约在p3代以后的成体肝脏类器官中，胆管细胞标志物krt19的表达水平逐渐升高，alb表达水平逐渐下降。说明成体肝脏类器官具有向胆管细胞分化的倾向。19、诱导分化后期肝脏类器官形成肝细胞-胆管细胞类器官采用与前述第12点相同的方法培养成熟肝脏类器官，在第三次传代后期的成体肝脏类器官长至80％左右时(约7d)用表4所述的6种分化培养基诱导分化。每隔3天更换培养基并记录细胞的生长情况。在诱导14天后，收集类器官，抽提rna并进行反转录检测肝细胞、胆管细胞和干细胞相关基因的表达情况。结果如图32-33所示。从图32可看出用不同的分化培养基诱导14后，肝脏类器官的增殖受到抑制且不同的处理组之间没有显著性的差别。其中利用4号分化培养基诱导的类器官相应的肝细胞标志物表达水平最高。因此以4号培养基作为肝脏类器官的分化培养基(图33)。20、成熟的肝细胞-胆管细胞类器官具有多种细胞成分采用前述19点的培养方法，利用第4种培养基进行诱导分化，形成成熟的肝细胞-胆管细胞类器官结构。取出适量类器官，消化成单细胞，并利用10×genomics的方法进行单细胞测序，以观察细胞组成。结果如图34所示，分化成熟的肝细胞-胆管细胞类器官含有肝细胞，胆管细胞以及肝干细胞。其中肝细胞高表达肝细胞标志物alb、ttr和rbp4等，干细胞高表达epcam、alb、krt19和sox9等基因，胆管细胞高表达krt19、epcam、sox9等基因。21、成熟的肝细胞-胆管细胞类器官在基因表达谱上与肝组织类似采用前述19点的培养方法获得成熟肝细胞-胆管细胞类器官结构。取出适量类器官进行rna建库并测序。检测其基因表达情况。从图35可看出，与后期的肝脏类器官相比，分化成熟的肝细胞-胆管细胞类器官在基因表达谱上更接近与成体肝组织，同时通过基因富集分析发现分化成熟的肝细胞-胆管细胞类器官高度富集细胞代谢以及生物氧化等相关的基因，与成熟肝细胞的功能一致。22、成熟的肝细胞-胆管细胞类器官具有肝脏器官的功能采用前述19点的培养方法获得成熟肝细胞-胆管细胞类器官结构。取出适量类器官进行糖原染色、油红染色和吲哚菁绿染色、cyp3a4的活力鉴定以检测是否具有肝细胞的功能。结果如图36-37所示，从图36的结果可看出成熟的肝细胞-胆管细胞类器官能摄取低密度脂蛋白，储存糖原，吸收吲哚菁绿。并且该类器官与未分化的后期肝脏类器官相比具有更高的cyp3a4的活力，更接近于肝组织的水平，并且在底物利福平诱导后，cyp3a4的活力能进一步提升(图37)，说明具有成熟的肝细胞-胆管细胞类器官成熟肝细胞的功能同时取出适量类器官，加入荧光素二乙酸盐，观察并记录它的摄取和排出，以检测是否具有胆管细胞的功能。结果如图38所示，在加入5min后类器官开始摄入荧光素并在20-30min左右达到最高值，之后开始排出，90min时将荧光素全部排出。说明该类器官具有胆管细胞的功能。23、成熟的肝细胞-胆管细胞类器官具有修复急性肝损伤小鼠肝脏的功能将采用前述19点的培养方法获得成熟肝细胞-胆管细胞类器官结构消化成单细胞，按照每只鼠移植1*106个细胞，采用脾脏移植的方法移植到四氯化碳处理24h的scid小鼠中。移植后7天连续通过眼眶采血抽取小鼠的血液进行谷草转氨酶(ast)、谷丙转氨酶(alt)的测定。同时将移植48h的部分小鼠肝脏取出，通过多聚甲醛固定，石蜡包埋、4μm连续切片进行人源特异性肝组织的标志物alb、apoe、cyp3a4免疫组化染色。从图39可看出，与对照组相比，移植成体肝脏类器官的小鼠在移植1天后体内的水平明显下降。图40进一步证明在移植48h时成体肝脏类器官进入受损的小鼠肝脏，并发挥成熟肝细胞的功能。24、成熟的肝细胞-胆管细胞类器官具有修复慢性肝损伤小鼠的功能将利用前述19点的培养方法获得成熟肝细胞-胆管细胞类器官结构消化成单细胞，按照每只鼠移植1*106个细胞，采用门静脉移植的方法移植到8-12w的frg小鼠中同时撤出ntbc水。移植两个月后取血检测人源alb的表达情况。同时处死小鼠，取出肝脏后进行多聚甲醛固定、石蜡包埋、连续切片并进行免疫组织化学染色的处理。结果如图41-44所示，在撤除ntbc水后，移植成体肝脏类器官的frg小鼠具有更强的生存优势(图41)。并且在小鼠的血清中能检测到人源alb的存在，含量在695.86μgml-1左右，与成熟肝细胞移植的水平相当(图42)。通过人源肝特异性的标志物alb、apoe、fah的免疫组织化学检测(图43，44)进一步证明成体肝脏类器官成功在受损伤的小鼠体内定殖并且发挥成熟肝细胞的功能。25、成熟的肝细胞-胆管细胞类器官能在体内形成胆管结构将采用前述19点的培养方法获得成熟肝细胞-胆管细胞类器官结构消化成单细胞并与等量的间充质干细胞进行混合，加入胶原混合后在培养板上按照10微升/包滴加形成1mm2左右的小包，第二天将其种在scid小鼠的肾包膜下。两个月后将小鼠处死，取出肾包膜下的组织，进行石蜡包埋和组织染色，观察胆管细胞基因的表达情况。从图45可看出，在体内成熟肝细胞-胆管细胞类器官结构可形成类似于胆管的官腔结构并高表达胆管细胞的标志物krt19和krt7。说明成熟的肝细胞-胆管细胞类器官具有胆管细胞的潜能。如前文所述，本发明找到了适合胚胎及成体时期肝细胞类器官长期培养的方法，从类器官传代的效率、细胞活力、基因表达水平和组织学水平几个方面进行验证，证明确实养活了肝脏细胞，能够在一个月内维持肝细胞特性，长期培养过程中会向胆管转化。利用本发明的分化培养基可使转分化的胆管细胞分化成成熟的肝细胞，形成肝细胞-胆管细胞的复杂结构。通过单细胞测序，转录组分析证实该复杂结构具有与肝脏细胞类似的细胞组成以及基因表达谱系。此外，通过肝脏功能学实验和动物体内实验，证实体外培养的肝脏类器官是有功能的，具有成熟肝细胞和胆管细胞的功能，不仅能够修复肝受损伤的小鼠。还能在体内形成胆管结构。当前第1页12