专利名称：肝癌癌蛋白p28<sup>GANK</sup>在筛选肝癌治疗药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是肝癌癌蛋白p28^"用于筛选肝癌治疗药物的用途。
背景技术：
蛋白p28③k是存在于人肝细胞中的一种蛋白，通常在正常细胞中含量较少，但 在肝癌细胞中含量很高，所以将其称为肝癌癌蛋白。本申请人曾制备了P28^"抗体用 于鉴别诊断肝癌并申请了专利(详见《肝癌鉴别诊断用P28抗体及其制备》，专利号ZL 03116825. 6)。 近来有报道p28Mffi主要是通过调控P53及Rb信号通路发挥其促癌作用。p28^15 与泛素蛋白连接酶M匿2相互作用，介导p53蛋白的泛素化及降解，p28GANK与及Rb结合并 驱动肿瘤抑制蛋白Rb的核内磷酸化失活及核转录因子E2F-1的释放，加速细胞周期。外 源性转入癌基因p28^"使其高表达后的NIH/3T3细胞株可以使裸鼠荷瘤。(Li H， Fu X， Chen Y， et al. Use ofadenovirus-delivered siRNA to target oncoprotein p28GMK in hepatocellularcarcinoma. Gastroenterology 2005 ;128 :2029-2041)
最近有研究表明干扰或阻断内质网应激(ER stress)通路可以抑制肿瘤的进 展，并提出内质网应激在实体瘤的发展中具有重要意义(LeeAS.The glucose-regulated proteins :stress induction and clinical applications. TrendsBiochem Sci 2001 ^ 26 :504-510.)。 p28,在肝癌中的作用尚不明确，至今未见p28^在内质网应激中的作用 及其能否通过调控内质网应激发挥促癌作用的相关报道。
发明内容
本发明的目的是将p28Mffi蛋白用于筛选肝癌治疗药物。 本发明人根据肝癌中p28^k蛋白的高表达现象，研究了p28^"对内质网应激的调 控，通过实验发现，蛋白p28^k在内质网应激中对细胞具有保护作用，即p28Mffi能够通过抑 制内质网应激诱导的凋亡而发挥促癌作用。可以设想，如果用某一药物特异性阻断P28^k 对内质网应激诱导凋亡的抑制作用，也就阻断了 p28^k的这一促癌作用，所以p28^"可用 于筛选肝癌治疗药物。本发明为P28^"提供了一种新用途。
图1.p28^k促进内质网应激对GRP78的诱导表达。分别用内质网应激诱导剂 DTT(2. 5,1)和Tg(l践ol)剌激p28GANK稳定表达的NIH3T3细胞(NIH3T3/gank)和对照 细胞(NIH3T3/3. 1A)0h，6h，12h，24h。在对应时间点裂解细胞，细胞裂解液经过蛋白定量后 采用Western blot检测p28Mffi对GRP78诱导表达的影响。 图2.p28^k促进内质网应激对GRP78的诱导表达。分别用内质网应激诱导剂 DTT(2. 5,1)和Tg(l ii mol)剌激p28GANK瞬时转染的HEK293细胞(HEK293/gank)和对照 细胞(HEK293/3. 1A)0h，6h，12h，24h。在对应时间点裂解细胞，细胞裂解液经过蛋白定量后采用Western blot检测p28Mffi对GRP78诱导表达的影响。 图3.干扰p28^K促进内质网应激条件下肝癌细胞的凋亡。用腺病毒介导的p28^K siRNA干扰肝癌细胞SMMC-7721和H印G224h后，分别用内质网应激诱导剂DTT (2. 5mmo1)和 Tg(liimol)剌激上述细胞24h后采用Annexin V-FITC试剂盒和流式细胞术检测细胞凋亡 情况。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例，对本发明作详细描述。 本发明如下实验证明，p28Mffi能够通过抑制内质网应激诱导的凋亡而发挥促癌作 用的 1. p28③K和内质网应激相互关系的实验 实验表明，HCC标本中内质网应激的激活状态和p28eANK的过表达共同存在。进一
步分析发现p28③K不仅参与了对内质网应激的调控，而且能够明显抑制内质网应激引起肝
癌细胞凋亡，这表明p28③K在内质网应激中对肝癌细胞具有保护作用，它可能通过内质网
应激途径促进肝癌的发展。 2. p28GANK上调GRP78表达的实验 实验表明p28^"可以通过促进p38和AKT活化而上调葡萄糖调节蛋白78 (glucose regulated protein 78， GRP78)的表达而对内质网应激进行调控。GRP78是内质网应激中 的关键性保护分子，其对于肿瘤的发展及抗化疗药物具有重要作用。p28MNK引起的GRP78表 达上调和AKT活化增强促进了肝癌细胞对内质网应激的适应。内质网应激可以促进肝癌细 胞适应缺氧、营养缺乏等不利因素进而促进肝癌的发展，也增强了肝癌细胞对治疗药物的 耐受。 3. p28eANK与GRP78间相互作用的实验 实验表明p28MNK与GRP78存在相互作用，促进肝癌细胞对内质网应激的适应性反 应。上述表明p28eAffi不仅能够调控P53及Rb信号通路，而且也能通过内质网途径促进肝癌 的发展。 4. p28GANK对内质网应激的调控实验 实验表明，p28MNK能够通过调控内质网应激促进肝癌的演进和耐药性。因此，蛋白 p28Mffi具有作为重要靶点用于肝癌治疗的潜质；特异性阻断p28MNK在内质网应激中对肝癌 细胞的保护作用可能为肝癌防治提供了潜在的应用前景。根据p28③K这一新功能筛选肝癌 治疗药物无疑能为肝癌的治疗提供新的特异性靶位。 实施例1 : (1)构建p28eANK稳定表达的NIH/3T3细胞系和对照细胞系。转染试剂 Lipof ectamine 2000转染(具体转染方法按照说明书)NIH/3T3细胞p28GAffi质粒24h后，用 G418(400ug/ml)筛选p28GANK稳定表达的细胞克隆。(2)用内质网应激诱导剂TG(l y mol/ L)剌激上述细胞系和对照细胞0h，6h，12h，24h并收对应时间点细胞。(3)细胞裂解液BCA 法定量后SDS变性。(4)上述蛋白样品SDS-PAGE， Western blot分析p28Mffi对GRP78表达 的影响。结果见图1。由图1可见，p28Mffi能够促进GRP78的表达。 实施例2 : (1)利用转染试剂PEI (具体转染方法按照PEI转染说明书)对HEK293 细胞瞬时转染p28^K质粒和对照质粒pcDNA3. 1。 (2)转染24h后，上述细胞加内质网应激
4诱导剂TG(l ii mol/L)剌激0h，4h，8h， 12h并收对应时间点细胞。(3)细胞裂解液BCA法定 量后SDS变性。(4)上述蛋白样品SDS-PAGE， Western blot分析p28eANK对P38和AKT磷酸 化的影响。结果见图2。由图2可见，p28eAffi能够促进P38和AKT的磷酸化。
实施例3 :(l)采用腺病毒介导的p28^KsiRNA和对照病毒干扰肝癌细胞 SMMC-7721和H印G2细胞的p28G皿表达。(2)干扰48h后用内质网应激诱导剂DTT (2. 5mmo1/ L)和TG(l ii mol/L)剌激上述细胞24h。 (3)采用Annexin V-FITC试剂盒通过流式细胞仪 分析p28^"对内质网应激诱导凋亡的影响。(4)统计学分析数据。结果见图3。由图3可 见，p28^k能够抑制内质网应激诱导的凋亡。
权利要求
肝癌癌蛋白p28GANK在筛选肝癌治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，是肝癌癌蛋白p28GANK用于筛选肝癌治疗药物的用途。根据肝癌中p28GANK蛋白的高表达现象，通过实验发现，蛋白p28GANK在内质网应激中对细胞具有保护作用，即蛋白p28GANK能够通过抑制内质网应激诱导的凋亡而发挥促癌作用。如果用某一药物特异性阻断蛋白p28GANK对内质网应激诱导凋亡的抑制作用，也就阻断了蛋白p28GANK通过内质网应激的促癌作用，所以p28GANK蛋白可用于筛选肝癌治疗药物。本发明为蛋白p28GANK提供了一种新用途。
文档编号G01N33/15GK101769914SQ200910044880
公开日2010年7月7日 申请日期2009年1月5日 优先权日2009年1月5日
发明者代荣阳, 王红阳, 陈瑶 申请人:中国人民解放军第二军医大学